專利名稱：一種人的核糖體蛋白s20蛋白質(zhì)及其在自身免疫性肝炎診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人的核糖體蛋白S20自身抗原，更具體地說是一種自身免疫性疾 病特異抗原核糖體蛋白S20，在制備檢測自身免疫性疾病試劑盒中的應(yīng)用及含有該自身抗 原的檢測試劑盒，屬于生物工程和疾病診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自身免疫性肝炎(Autoimmune Hepatitis, AIH)又稱自免肝，是一種非病毒性的慢 性肝炎，其致病原因不明，臨床表現(xiàn)為慢性肝細(xì)胞發(fā)炎及壞死。如治療不及時，AIH重癥患 者僅有50%的5年存活率。中國人群中AIH的患病率較低，但隨著臨床經(jīng)驗的積累以及實 驗室診斷技術(shù)的進(jìn)步，我國人群中這類疾病逐漸增多。只有通過早期發(fā)現(xiàn)，才有可能對病期 進(jìn)行更準(zhǔn)確的評估，盡早地進(jìn)行針對性治療，從而提高生存率，改善預(yù)后。AIH患者血清內(nèi)能檢測到多種自身抗體，如抗核抗體 (anti-nuc 1 earautoantibody, ANA)、㈱〒胃磯㈱^本(smooth muscle autoantibody, SMA)、 抗月干腎微粒體抗體(anti-liver and kidney microsomal antigens, anti—LKM)等。巨前 臨床檢驗科常用間接免疫熒光法(indirectimmunofluoresence，IIF)檢測，即用嚙齒類動 物組織或ifep-2細(xì)胞制備成組織/細(xì)胞芯片，與患者血清反應(yīng)，繼之以熒光標(biāo)記的抗人IgG 抗體檢測血清抗體和芯片上抗原的結(jié)合，通過熒光圖像判斷，主觀性強(qiáng)。近年來，對AIH自 身抗體靶標(biāo)進(jìn)行了探索，已知的有CYP2D6、ASGP-R、F-actin等，為使用客觀的診斷方法提 供了分子基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可以全面地分析血清的抗體譜，提供具有疾病特異性的自身抗體 標(biāo)志物。核糖體蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)是1993年從人皮膚血管內(nèi)皮細(xì) 胞cDNA文庫中克隆出的一個核糖體結(jié)構(gòu)蛋白的基因。該基因編碼119個氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的第一個目的是提供一種特異性自身免疫性肝炎RPS20抗原。本發(fā)明的第二個目的是提供RPS20抗原在制備人自身免疫性肝炎的蛋白質(zhì)芯片 檢測試劑及其相應(yīng)試劑盒的用途。本發(fā)明的第三個目的是提供RPS20抗原在制備人自身免疫性肝炎的ELISA檢測試 劑及其對應(yīng)ELISA檢測試劑盒的用途。解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)手段本發(fā)明利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，首先利用5000人類蛋白質(zhì)芯片比較AIH和健康對照 的血清抗體譜，篩選出14個與AIH相關(guān)的候選自身抗原。然后制備該14個候選抗原的蛋 白質(zhì)芯片，對AIH、健康對照、以及其它需要和不需要進(jìn)行鑒別診斷的血清樣本進(jìn)行檢測，鑒定出在AIH樣本中特異的RPS20自身抗原。發(fā)明人制備了 RPS20蛋白質(zhì)，通過特異性蛋白質(zhì)芯片和酶聯(lián)免疫吸附試驗 ((enzyme-1 inked immunosorbent assay，ELISA)方法，驗證了其自身抗體可在部分 AIH 病人血清中檢測到。單獨檢測時，檢出率為40.0%-47. 70%。RPS20與其他5個自身抗原 一起，可聯(lián)合檢測AIH，特異性和敏感性分別為96. 2%和68. 2% (邏輯回歸)及93. 2%和 84. 1% (判別分析)，準(zhǔn)確率達(dá)到91. 7% (表1)。另外，RPS20可特異性地鑒別診斷PBC和 HC等其他肝臟疾病(圖1)。因此，RPS20可作為AIH診斷的分子標(biāo)志。具體地，本發(fā)明涉及以下幾個方面1、一種人的RPS20蛋白質(zhì)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中SEQ ID No 2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中SEQ ID No :2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或多于一個氨基酸殘基 的取代和/或缺失和/或添加且可識別針對序列表中SEQ IDNo 2的自身抗體的蛋白質(zhì)序 列或可識別用序列表中SEQ ID No 2的序列表達(dá)的蛋白質(zhì)所制備的抗體的蛋白質(zhì)序列。2、項目1所述人的RPS20蛋白質(zhì)的編碼基因，是具有下述核苷酸序列之一的基因1)序列表中SEQ ID No 1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID No 1的DNA序列具有85%以上同源性。3、含有項目1所述蛋白質(zhì)的檢測試劑，其用于檢測人的自身免疫性肝炎。4、項目1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的蛋白質(zhì)芯 片檢測試劑。5、項目1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的ELISA檢 測試劑。6、項目1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的檢測試 劑。7、使用項目1所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測的方法，其包括使項目1所述的蛋白質(zhì)與生 物樣品接觸。8、含有項目1所述蛋白質(zhì)的抗體在自身免疫性肝炎中的應(yīng)用。9、含有項目1所述蛋白質(zhì)為藥物靶標(biāo)的應(yīng)用。10、項目2所述的核酸分子的應(yīng)用，其特征在于作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者 用于制造基因芯片或微陣列，或者用于作為自身免疫性肝炎診斷的標(biāo)志。本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明RPS20具有極強(qiáng)的特異性，為特異的AIH標(biāo)志物。(2)本發(fā)明克隆了其全長，具免疫反應(yīng)的高特異性和高敏感性；其可以制備檢測 AIH的試劑盒，檢測效率高，使用方便，該試劑盒具有較高的應(yīng)用價值。(3)本發(fā)明RPS20還可以作為治療AIH藥物研發(fā)的靶標(biāo)。(4)本發(fā)明RPS20蛋白質(zhì)及其核酸序列均可以作為AIH檢測的靶標(biāo)。


圖1是RPS20蛋白質(zhì)與各組血清反應(yīng)信號值的盒須圖分析。將含有RPS20的蛋白質(zhì)芯片檢測包含自免肝、健康對照、原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、丙肝(HC)、及其他疾病對 照共278份樣品。長方形定義四分位距(IQR)；長方形內(nèi)的橫線表示中位值；長方形上下方 的誤差棒定義了 1. 5IQR的離群值。所有1. 5*IQR+中位值之外的末端離群值點用黑色小方 塊表示。結(jié)果顯示RPS20可特異性地鑒別AIH與非AIH，包括需要與AIH鑒別診斷的PBC及 HC。
具體實施例方式材料來源本發(fā)明具體實施方式
所用血清標(biāo)本來源于北京協(xié)和醫(yī)院。留取的血液經(jīng)沉淀離心 后，血清移入低溫保存。疾病標(biāo)本均經(jīng)臨床檢驗確診，并有患者知情同意書。本具體實施方式
所用試劑均為市售產(chǎn)品。實施例1RPS20自身抗原的制備以人肝臟cDNA文庫為模板，根據(jù)RPS20基因序列設(shè)計特異引物，引物兩端含有酵 母重組位點上游弓丨物5，gcatcaccatcaccatcacggtggtggtatggcttttaaggataccgg 3，(SEQID No 3)；下游弓丨物5，aggcagatcgtcagtcagtcacgatgaaagcatctgcaatggtgacttcc3，(SEQID No 4)。PCR(參數(shù)-MV 4min ；94°C 30s，58°C 30s, 72°C 2min，共 35 循環(huán)；72°C 10min，4°C 保存)擴(kuò)增出全長RPS20基因，與線性載體pEGH(XbaI+HindIII雙酶切)共同化學(xué)轉(zhuǎn)化酵 母感受態(tài)細(xì)胞Y258(參考文獻(xiàn)1)，挑單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，驗證序列無誤。篩選得到的 陽性克隆，用2%半乳糖誘導(dǎo)表達(dá)14小時。誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞裂解后，用GST親和樹脂純化 蛋白(洗脫條件為30mM還原性谷胱甘肽)。實施例2RPS20蛋白質(zhì)制備蛋白質(zhì)芯片檢測AIH取10微升純化的蛋白質(zhì)溶液至384孔板中，用PerkinElmer Spotarray72型芯片 點樣儀將經(jīng)5000個人類蛋白質(zhì)芯片篩選出的包含PRS20的14個與AIH相關(guān)的候選自身抗 原在表面經(jīng)過化學(xué)處理適用于蛋白質(zhì)芯片點制的顯微玻片上連續(xù)點制成12個完全一致的 方陣，每個方陣都包括了這12個候選自身抗原以及人IgG作為正對照，一個隨機(jī)選取的重 組人蛋白質(zhì)和點樣緩沖液作為負(fù)對照(參考文獻(xiàn)1)。每個蛋白質(zhì)樣品被點制成橫排相鄰的 兩個重復(fù)的點。芯片點制完成后，室溫下放置1小時，存放于4°C。將上述芯片，對包含44份AIH及其他各種疾病和健康對照在內(nèi)的共278份樣品進(jìn) 行芯片雜交分析實驗。所有樣品均以1 1000的比例稀釋，血清中與芯片上蛋白結(jié)合的抗 體用Cy5標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(1 1000稀釋)來測定。RPS20自身抗原在AIH的檢出率為47. 70% (21、44)。對RPS20自身抗原與各組血 清反應(yīng)信號值的盒須圖分析結(jié)果(圖1)表明，RPS20可特異性地鑒別AIH與非AIH，包括需 要與AIH鑒別診斷的PBC及HC。本發(fā)明還通過訓(xùn)練數(shù)學(xué)判別模型，得到了包括RPS20在內(nèi)的6個抗原及其判別公 式。針對278份樣品，AIH的判別準(zhǔn)確率達(dá)到91. 7% (表1)。表1 兩種判別模式對訓(xùn)練樣品的判別
判別方式總樣 品數(shù)正確判別 樣品數(shù)假陽性假陰性敏感性特異性準(zhǔn)確率邏輯回歸 判別分析278 278255 2559 1614 768.2% 84.1%96.2% 93.2%91.7% 91.7%本發(fā)明用蛋白質(zhì)芯片的方法對另外15份AIH和26份健康對照樣品進(jìn)行雙盲判 別，準(zhǔn)確率達(dá)到85. 4% (表2)。表2 兩種判別模式對雙盲樣品的判別
判別方式總樣 品數(shù)正確判別 樣品數(shù)假陽性假陰性敏感性特異性準(zhǔn)確率邏輯回歸 判別分析41 4135 360 06 560% 66.7%100% 100%85.4% 87.8%實施例3PRS20蛋白質(zhì)制備ELISA試劑盒檢測AIH選擇聚苯乙烯ELISA板，保證單孔的吸光值和96孔吸光值的平均值之間的差值在 10%以內(nèi)。在每孔中包被 οομ 1的Alba-like抗原(2. 5 μ g/ml)，并用的牛血清白蛋 白進(jìn)行封閉。對板材和包被的抗原進(jìn)行干燥處理和真空包裝。將包被的ELISA板與15份AIH和15份健康對照血清(1 40稀釋)反應(yīng)，進(jìn)行 ELISA分析實驗。與AIH和健康人血清反應(yīng)的結(jié)果(吸光度)做T檢驗，ρ值小于0.01，顯 示其與兩種血清反應(yīng)時有顯著差異。以健康對照血清與RPS20蛋白質(zhì)反應(yīng)的光吸收值的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)差的三倍作 為閾值，判斷RPS20蛋白質(zhì)與15份AIH反應(yīng)的陽性率及特異性。陽性率為40% (6/15)，特 異性為100%，即沒有一例對照血清被誤診。參考文獻(xiàn)1. Hu S. , Li Y. , Liu G. ， Song Q, Wang L. ， Han Y. ， Zhang Y. ， SongY. ， Yao X.， Tao Y. ， Zeng H. ， Yang H. ，Wang J. ， Zhu H. ， Chen ZN, and Wu L. (2007) A Protein Chip approach for high-throughputantigen identification and characterization. Proteomics 2007，7，2151-2161.序列表<110>北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司<120> 一種人的核糖體蛋白S20蛋白質(zhì)及其在自身免疫性肝炎診斷中的應(yīng)用<130><160>4<170>PatentIn version 3. 5<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>HUMAN
<400>1atggcttttaaggataccgg3.3.3.3.3.C3.CCCgtggagccggaggtggcaattcaccgaatt60
cgaatcaccctaacaagccgcaacgtaaaatccttggaaaaggtgtgtgctgacttgata120
agaggcgcaaaagaaaagaatctcaaagtgaaaggaccagttcgaatgcctaccaagact180
ttgagaatcactacaagaaaaactccttgtggtgaaggttctaagacgtgggatcgtttc240
cagatgagaattcacaagcgactcattgacttgcacagtccttctgagattgttaagcag300
attacttccatcagtattgagccaggagttgaggtggaagtcaccattgcagatgct357
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>HUMAN
<400>2
Met Ala Phe Lys
1
lie
Asp Thr Gly Lys Thr 5
Arg lie Thr Leu
Glu Lys
Lys Val 50 Arg
His Arg lie 20
Cys Ala Asp Leu
Val
35
Lys
Gly Pro Val
lie
40
Met
Thr 25
Arg Gly Ala Lys
Val Glu Pro Glu Val Ala 15
Ser Leu
Pro 10
Ser Arg Asn Val
Pro Thr Lys
Thr 65
Gln Met
Lys Thr Pro Arg lie lie Val Lys
Arg 55
Gly Glu Gly Ser
Glu
45
Leu
His
85
lie
Cys 70
Lys Arg Leu lie
Thr Ser lie
Glu Val
Thr 115
Gln 100
lie Ala Asp Ala
Ser 105
Asp
90
lie
Lys
75
Leu
Thr 60
Thr Trp
His Ser Pro
Lys 30
Lys Asn Leu
Arg lie Thr
Asp Arg Phe 80 Glu
Glu Pro Gly Val 110
Ser
95
Glu
Val
<210>3
<211>48
<212>DNA
<213>Primer
<400>3
gcatcaccat caccatcacg gtggtggtat ggcttttaag gataccgg <210>4
<211>50<212>DNA<213>Primer<400>4aggcagatcg tcagtcagtc acgatgaaag catctgcaat ggtgacttcc 50
權(quán)利要求
一種人的核糖體蛋白S20蛋白質(zhì)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)1)序列表中SEQ ID No2的氨基酸殘基序列；2)將序列表中SEQ ID No2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或多于一個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且可與針對序列表中SEQ ID No2的自身抗體識別的蛋白質(zhì)的序列或可與用序列表中SEQ ID No2表達(dá)的蛋白質(zhì)制備的抗體識別的蛋白質(zhì)的序列。
2.權(quán)利要求1所述人的核糖體蛋白S20蛋白質(zhì)的編碼基因，是具有下述核苷酸序列之 一的基因1)序列表中SEQID No 1的核苷酸序列；2)編碼序列表中SEQID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQID No 1的DNA序列具有85%以上同源性。
3.含有權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的檢測試劑，其用于檢測人的自身免疫性肝炎。
4.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的蛋白質(zhì)芯 片檢測試劑。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的酶聯(lián)免疫 吸附試驗(ELISA)檢測試劑。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的用途，其用于制備檢測人的自身免疫性肝炎的檢測試劑。
7.使用權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測的方法，其包括使權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì) 與生物樣品接觸。
8.含有權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的抗體在自身免疫性肝炎中的應(yīng)用。
9.含有權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)為藥物靶標(biāo)的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求2所述的核酸分子的應(yīng)用，其特征在于作為引物用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)，或者 用于制造基因芯片或微陣列，或者用于作為自身免疫性肝炎診斷的標(biāo)志。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種自身免疫性肝炎特異的蛋白質(zhì)核糖體蛋白S20及其應(yīng)用。該蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列。本發(fā)明還公開了用其基因克隆表達(dá)該蛋白質(zhì)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)芯片和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測的方法，由本方法制備的核糖體蛋白S20可用于自身免疫性肝炎的診斷。
文檔編號C40B40/06GK101921323SQ20091008635
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者劉國振, 吳 琳, 宋其峰, 朱衡, 李永哲, 韓宇寧 申請人:北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司