專利名稱：：一種分離、純化相思子毒素的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物活性成分的分離、純化方法，尤其涉及一種從云南豆科植物相思子G4brusprecatorius)種子中分離、純化毒素(abri'n)的方法，屬于植物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子C46rusprecatorius)種子中的一種毒蛋白，與蓖麻毒素(ric&)同為II型核糖體失活蛋白0I"家族成員，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，相思子毒素類似于蓖麻毒素，是一種植物蛋白毒素，具有極強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用，特別是對(duì)某些惡性腫瘤細(xì)胞的毒性更強(qiáng)，這使它成為用于殺傷腫瘤細(xì)胞的候選毒素之一。相思子毒素是一種分子質(zhì)量約為63icu67;oj的糖蛋白，分子由4、S兩條多肽鏈通過(guò)1個(gè)二硫鍵連接而成。完整毒素在SDS-PAGE分析時(shí)呈一條蛋白帶，經(jīng)二巰基乙醇處理后，爪S兩條鏈分離開(kāi)，其中4鏈呈酸性，分子質(zhì)量約為30Au，與蓖麻毒素4鏈存在102個(gè)相同的氨基酸殘基；S鏈呈中性，分子質(zhì)量約35ioi。有關(guān)試驗(yàn)表明，相思子毒素兩條鏈經(jīng)二巰基乙醇還原分離開(kāi)后，其活性并不喪失。迄今為止，從相思子種子中分離和純化毒素和凝集素的方法有多種。大多經(jīng)過(guò)離子交換，凝膠過(guò)濾，親和層析等多步層析，才能得到純品，方法較為繁瑣，費(fèi)用，成本相對(duì)較高。例如，國(guó)外從70年代開(kāi)始進(jìn)行相思子毒素的分離純化，首先經(jīng)DE-52陰離子交換層析，然后經(jīng)凝膠過(guò)濾，S印harose4B親和層析，操作過(guò)程較為煩瑣，流程較長(zhǎng)，費(fèi)用和成本也相對(duì)較高，制約了對(duì)相思子的開(kāi)發(fā)和利用，所以尋找一種步驟簡(jiǎn)捷、制備成本低的相思子毒素的分離和純化方法,對(duì)于相思子的開(kāi)發(fā)和利用具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分離、純化相思子毒素的方法，該方法步驟簡(jiǎn)捷、生產(chǎn)成本相對(duì)較低。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一種分離、純化相思子毒素的方法，包括(1)將云南相思子粗毒素上酸化的S印harose4B親和層析柱，先用初始平衡緩沖洗脫掉雜蛋白，然后用半乳糖梯度洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集半乳糖梯度洗脫液的前面兩個(gè)在280nm處有吸收的峰；(2)將步驟(1)所收集的洗脫液濃縮后加樣于DEAE-S印haroseFF凝膠面上，先用洗脫平衡液洗脫掉雜蛋白；然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL進(jìn)行梯度洗脫，分別收集在280nm處有吸收的前兩個(gè)較大的峰，分別濃縮后進(jìn)行脫鹽處理，即得h、P2。為了達(dá)到更好的分離或純化效果，步驟(l)中所述的酸化的S印harose4B親和層析柱按照以下方法制備得到將凝膠Sepharose4B酸化處理，經(jīng)洗滌、脫氣、平衡后裝層析柱;其中，所述的酸化處理優(yōu)選用鹽酸處理凝膠S印harose4B5-6小時(shí)。步驟(1)中所述的初始平衡緩沖液優(yōu)選是10mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH=7.4;所述的半乳糖梯度洗脫液優(yōu)選為含0—0.5mol/L半乳糖的磷酸鹽緩沖液，pH=7.4;步驟(2)中所述的洗脫平衡液優(yōu)選為10mmol/L的Tris-HCL，pH為7.0;步驟(2)中所述的脫鹽處理優(yōu)選為用脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，更優(yōu)選的，以S印hadexG-25(30X2.Ocm)為脫鹽柱，將濃縮液上脫鹽柱后用水洗脫，流速為0.8ml/min，280nm檢測(cè)，收集第一主峰。本發(fā)明中所述的相思子優(yōu)選為云南相思子UfcrasprecatoriusL)，其分布于云南南部較熱地區(qū)以及廣東、廣西、福建和臺(tái)灣等地，1200米以下山坡、灌叢、路邊等地。云南相思子粗毒素可從市場(chǎng)購(gòu)買得到，也可按照常規(guī)的方法從云南相思子種子中制備得到。作為參考，可按照以下方法制備得到相思子粗毒素將相思子種子搗碎后，去掉種皮，種仁用5%的稀乙酸4'C浸泡過(guò)夜，次日用研缽磨碎，冷凍離心，取上清加入35。/。(NH4)2S04，低溫靜置，冷凍離心，取上清，加入9596的飽和(NH4)2S04，低溫靜置，冷凍離心，得到沉淀物，將沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH=7.4)透析3天，離心，取上清，得相思子Abrin粗毒素；本發(fā)明方法采用酸化的S印harose4B親和層析柱可顯著提高分離效果。相思子毒素具有乳糖結(jié)合專一性，而S印harose4B是一種含有半乳糖功能基的多糖載體，用HCL處理使S印harose4B發(fā)生部分酸水解，增加半乳糖殘基數(shù)，可以提高基質(zhì)的親和容量。另外，本發(fā)明采用半乳糖梯度洗脫毒蛋白，同時(shí)去除凝集素，簡(jiǎn)化了分離步驟。在植物種子中，毒素與凝集素是共存的，其分子相差一倍左右,一般使用凝膠過(guò)濾分離開(kāi),而本發(fā)明方法使用半乳糖梯度洗脫，在洗脫毒蛋白的同時(shí)，將凝集素除去，省略了凝膠過(guò)濾層析，簡(jiǎn)化了純化步驟。再者，本發(fā)明采用DEAE-S印haroseFF為離子交換介質(zhì)可獲得相思子兩種毒蛋白成分。傳統(tǒng)的纖維毒介質(zhì)DE-52，由于流速太慢，柱床高度會(huì)隨緩沖液濃度及pH值改變，難以純化樣品，而且纖維素不能承受0.lmol/NaOH的在位清洗，重生效果差，壽命短。鑒此，本發(fā)明采用化學(xué)穩(wěn)定性高，流速快的高度偶聯(lián)瓊脂糖DEAE-S印haroseFF為介質(zhì)。DEAE-S印haroseFF是在瓊脂糖凝膠基礎(chǔ)上改進(jìn)的新產(chǎn)品，它是瓊脂糖珠體經(jīng)充分交聯(lián)后得到的一類具有高通透能力的半剛性層析材料，引進(jìn)功能基DEAE后具有陰離子交換能力，DEAE-S印haroseFF保留了天然多糖化合物的極好的親水性及大網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，與生物活性大分子有很好的相容性，實(shí)驗(yàn)證明，其分離效果很好總之，本發(fā)明方法利用兩次層析就可以得到相思子的兩種毒素蛋白純品，不僅簡(jiǎn)化了純化步驟，而且在純度，產(chǎn)率上均有顯著提高，為大規(guī)模的純化奠定了基礎(chǔ)。由本發(fā)明方法所分離的相思子毒素由&和P2兩種相思子毒素組成，其中P!分子量為64000，等電點(diǎn)為6.9，含糖量為9.4%;P2的分子量在62000-63000之間，等電點(diǎn)為6.0-6.2，含糖量為3.3%。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所分離的相思子毒素對(duì)Bel7402等10余種腫瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用。觀察本發(fā)明所分離的相思子^動(dòng)物移植性腫瘤抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果表明，會(huì)^1^$(勵(lì)物移植性腫瘤的增殖活性。本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種治療腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物由治療上有效劑量的本發(fā)明所分離的相思子和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。根據(jù)不同的給藥方法，本發(fā)明藥物組合物可以含有10%-99%重量的相思子毒素，優(yōu)選為含有10-50%重量的相思子毒素。將本發(fā)明所分離得到的相思子^t加入制備不同劑型時(shí)所需的各種輔料和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體后，以常規(guī)的藥物制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑，例如可以是片劑、口服液、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊、滴丸等；其中，所述的輔料可以是抗氧絡(luò)合劑、填充劑、骨架材料等；所述的藥學(xué)上可接受的載體可以是木糖醇、甘露醇、乳糖、果糖、葡聚糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮、低分子右旋糖酐、氯化鈉、葡萄糖酸鈣或磷酸鈣中的一種或幾種，優(yōu)選為甘露醇或乳糖。圖1Abrin和AAG從S印harose4B的洗脫圖。圖2Abrin和AAG從酸處理的S印harose4B的洗脫圖。圖3凝集素從S印harose4B的洗脫圖。圖4凝集素從酸處理的S印harose4B的洗脫圖。圖5經(jīng)酸化S印harose4B得到的兩種毒素混合物再經(jīng)過(guò)DEAE-S印haroseFF離子交換層析結(jié)果。圖6本發(fā)明純化的毒素經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖7蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8本發(fā)明所分離的P2的HPCE結(jié)果。圖9通過(guò)HPCE確定的P2的分子量結(jié)果。圖10標(biāo)準(zhǔn)蛋白各自的相對(duì)遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)線性關(guān)系圖。圖11本發(fā)明所分離的Pi的MALDI-T0F-MS分析結(jié)果。圖12為等電聚膠電泳pH-cm圖譜(橫坐標(biāo)為從陰極到陽(yáng)極的距離，縱坐標(biāo)為pH值)。8圖13本發(fā)明所分離的P2的毛細(xì)管等電聚膠電泳圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。試驗(yàn)材料1云南相思子"brusprecatoriusL.)種子購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所。2凝膠S印harose4B(購(gòu)自Pharmacia公司)，S印hadexG-25(購(gòu)自Pharmacia公司)，DEAE-S印haroseFF(購(gòu)自四川成都晨光化工研究院)。3層析系統(tǒng)HD-8858型紫外檢測(cè)儀(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，F(xiàn)BS-100型自動(dòng)部分收集器(上海青浦滬西生化儀器廠)，TH-1000型梯度混合議(上海滬西分析儀器廠)，3057型記錄儀(四川儀表四廠)，DW-II型層析冷柜(浙江嵊縣中愛(ài)恒溫設(shè)備廠)。4層析柱20X1.6cm，20X2.6cm，30X2.Ocm等規(guī)格(購(gòu)自上海錦華實(shí)驗(yàn)儀器廠)。5離心機(jī)日立55-P7型超速冷凍離心機(jī)(日立公司)。6分光光度計(jì)日立340型UV-VIS分光光度計(jì)(日立公司)。7冷凍干燥機(jī)LGJ型(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠)。8試劑Nacl、(NH4)2S04、NA2HP04、NaH2P04、Gal、HAC(均為分析純，北京化工廠出品)，BSA(Serve公司出品)。實(shí)施例1一、實(shí)驗(yàn)方法1、相思子Abrin粗毒素的制備云南相思子"ferusprecatorius)種子100g搗碎后，去掉種皮，種仁用5%的稀乙酸41:浸泡過(guò)夜，次日用研缽磨碎，lOOOg冷凍離心20min，得到的上清中加入3596(NH4)2S04，4"靜置2h，lOOOg冷凍離心10min，去除沉淀，留取上清，加入959&的飽和(NH4)2S04,4'C靜置2小時(shí)，lOOOg冷凍離心20min，得到沉淀物，將沉淀物溶于少量水，然后用5mmol/L的PBS(pH=7.4)透析3天，3000g離心去除變性蛋白，上清為相思子Abrin粗提取液，冷凍干燥保存；2、酸化S印harose4B的制備取適量S印harose4B，用HCL處理5-6小時(shí)，用水洗滌，緩沖液平衡后備用；3S印harose4B及酸化S印harose4B柱層析將酸化的S印harose4B凝膠經(jīng)常規(guī)清洗后脫氣，裝柱(20X1.6cm)平衡，將粗毒素溶于初始平衡緩沖液(O.005mol/LPBS，pH=7.4)中，用吸管將其加到凝膠面上，以0.3ml/min的速度進(jìn)入凝膠，先用初始平衡緩沖液(0.005mol/LPBS，pH=7.4)洗脫雜蛋白，洗脫流速為0.7ml/min，然后用含0-0.5mol/LGal的PBS梯度洗脫，收集半乳糖梯度洗脫液的前面兩個(gè)在280nm處有吸收的峰；4DEAE-S印haroseFF柱層析將所收集的半乳糖梯度洗脫液的前面兩個(gè)在280nm處有吸收的峰用DEAE-S印haroseFF初始平衡緩沖液(O.Olmol/LTris-HCL,pH=7.0)透析，濃縮10后，加樣于DEAE-S印haroseFF柱層析(2.6X20cm)凝膠面上，以0.3ml/min的速度進(jìn)入凝膠，先用初始平衡緩沖液(0.005mol/LPBS，pH二7.4)洗脫雜蛋白，然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL進(jìn)行梯度洗脫，收集梯度洗脫液(洗脫流速優(yōu)選為O.8ml/min)，分別收集在280nm處有吸收的前兩個(gè)較大的峰，即分別得到P2，將PhP2經(jīng)濃縮后進(jìn)行脫鹽處理(脫鹽柱為S印hadexG-25(30X2.Ocm)，用水洗脫，流速為0.8ml/min.280nm檢測(cè))，冷凍干燥，樣品保存于-20。C。5蛋白含量測(cè)定采用Lowry法。二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1采用酸化的S印harose4B親和層析提高分離效果HCL處理S印harose4B不同時(shí)間對(duì)親和容量的影響，見(jiàn)表1._表1HCL處理S印harose4B不同時(shí)間對(duì)親和容量的影響_處理時(shí)間(小時(shí))5i^^^^^^^^~凝膠吸附蛋白量(mg/2ml凝膠)3.283.253.503.673.743.863.853.773.483.493.38由表1可知，HCL處理S印harose4B的時(shí)間不同，在親和容量上是由差異的:未處理的凝膠吸附蛋白量為3.28mg/2ml凝膠，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附蛋白量增加，處理5-6小時(shí)達(dá)到最大，吸附蛋白量最高達(dá)到3.86mg/2ml凝膠，比未處理凝膠高17.7%.但如果繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間，吸附蛋白量又下降,所以本發(fā)明選擇親和容量達(dá)到最大的條件,用HCL處理5-6小時(shí)，作為實(shí)驗(yàn)分離介質(zhì)。(2)為了確定親和容量的提高是否為特異性增加，做了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，在同樣條件下用S印harose4B和酸處理的S印harose4B進(jìn)行分離，蛋白含量比較見(jiàn)表2，分離圖譜見(jiàn)圖l和圖2。表2從S印harose4B和酸化的S印harose4B洗脫的蛋白含量的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>由表2可見(jiàn)，酸化S印harose4B滯留280mg毒蛋白，而S印harose4B滯留200mg毒蛋白.可見(jiàn)，酸化S印harose4B親和容量可提高特異性蛋白(Abrin)的增加，而不增加凝集素或雜蛋白的增加。從圖1和圖2還可以看出，采用酸化的S印harose4B可以滯留兩種毒性成分，而S印harose4B只滯留一種毒性成分，由此結(jié)果分析，酸化S印harose4B親和容量的提高是因?yàn)槎鄿袅艘环N毒性成分Pi，另外，采用酸化S印harose4B除去雜蛋白所需要的時(shí)間縮短，用S印harose4B親和層析洗脫雜蛋白峰有較長(zhǎng)的拖尾現(xiàn)象，按48ml/h.3ml/管計(jì)算，洗脫雜蛋白需要6h，而用酸化的S印harose4B洗脫雜蛋白只需要2.5h，可大大節(jié)省了時(shí)間。2、采用半乳糖梯度洗脫毒蛋白的同時(shí)將大量凝集素去除文獻(xiàn)報(bào)道洗脫毒蛋白時(shí)都是使用半乳糖一次性洗脫(見(jiàn)圖3、圖4)，將毒素與凝膠素混在一起收集，以后再用凝膠過(guò)濾除去凝膠素，但很難完全去除凝膠素。本發(fā)明采用半乳糖梯度洗脫，在洗脫毒蛋白的同時(shí)就可以去除大量凝膠素，簡(jiǎn)化了純化步驟.3、采用新型的DEAE-S印haroseFF離子交換介質(zhì)獲得兩種毒蛋白成分經(jīng)酸化S印harose4B得到的兩種毒素混合物再經(jīng)過(guò)DEAE-S印haroseFF離子交換層析，結(jié)果見(jiàn)圖5;兩種毒蛋白完全分開(kāi)，并將極少量的凝集素去除。試驗(yàn)結(jié)果相思子毒素分離純化過(guò)程中蛋白產(chǎn)率結(jié)果見(jiàn)表3。_表3從lOOg相思子種子中分離得到的蛋白餾分的產(chǎn)率_分離或純化方式蛋白種類總蛋白(mg)~~蛋白收率(％)酸處理的S印harose4B雜蛋白2460.25Bi+B22800.28B34320.43DEAE-S印haroseFFPi740.07P21620.16從表3可看出，勻槳上清液產(chǎn)率為9.87%，粗提液產(chǎn)率約1%，最后層析純化的Pi、P2產(chǎn)率分別為0.07%，0.16%，毒蛋白總產(chǎn)率為0.23%，而文獻(xiàn)報(bào)道含量為0.19%,可見(jiàn)本發(fā)明的純化方法在產(chǎn)率上得到很大提高。試驗(yàn)例1本發(fā)明方法所分純化的相思子毒素(Abrin)的毒性及理化性質(zhì)試驗(yàn)一試驗(yàn)材料1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小白鼠.雌雄兼用，體重20土2g;新西蘭大白兔；購(gòu)自海淀通利實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖廠。2、儀器DYY-II型穩(wěn)壓流電泳儀(北京六一儀器廠)，雙垂直電泳槽(大連捷邁高新技術(shù)公司)，日立340型分光光度計(jì)(日立公司)，普通離心機(jī)(上海醫(yī)用離心機(jī)廠)，日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀，ABI-491蛋白序列分析儀，ZabspecTlatformPlatform-ESI型質(zhì)譜儀(英國(guó)質(zhì)譜公司VGTOFSPEC)。3、試劑標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，兩性電解質(zhì)(均為上海麗珠東鳳生物技術(shù)有有限公司出品)，考馬斯量蘭R-250(Fluka出品)，甘露糖，丙稀酰胺，甲叉雙丙稀酰胺(均為Sigma公司出品).SDS,苯酚，貼04等其它試劑(國(guó)產(chǎn)分析純)。4、受試樣品本發(fā)明實(shí)施例l所分離、純化的相思子毒素(Abrin)。二試驗(yàn)方法131、分子量測(cè)定采用SDS-PAGE,HPCE，MALDI-TOF-MS檢測(cè)。(1)SDS-PAGE，按Laemmli方法(Laemmli，V.K.CleavageofstructureproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4，Nature,227:680-685,1970.)進(jìn)行，按Weber方法測(cè)定分子量采用不連續(xù)垂直板狀電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為4.0%，先于20mA電泳lh，待樣品進(jìn)入分離膠后，再調(diào)電流至40mA電泳3-4h，電泳完畢，凝膠條以考馬斯蘭R-250染色。(2)HPCE:使用未涂漬毛細(xì)管，電進(jìn)樣10KVX5秒，分離溫度20'C，分離電壓15KV,檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，電泳方向由負(fù)到正。(3)MALDI-TOF-MS:實(shí)驗(yàn)條件如下激光能量為4檔185:加速電壓為23608V;檢測(cè)器電壓為1850V;線性方式，正離子量程，2mV;基質(zhì)為CHCA。2.等電點(diǎn)測(cè)定IEF按照文獻(xiàn)所公開(kāi)的方法(張龍翔，張庭芳，李令媛主編生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)，高等教育出版社，1997，7)進(jìn)行；兩性電解質(zhì)聚合于7.5%的凝膠中，正極電泳液為lmol/LH3P04，負(fù)極為lmol/LNa0H,恒壓580伏，電泳2-3h,至電流接近于O.電泳完畢，從膠板一側(cè)切下一條膠條，切成O.5cm的小塊，用少量蒸餾水浸泡過(guò)夜，測(cè)定pH值，繪制pH-cm圖譜。毛細(xì)管電泳使用涂漬毛細(xì)管,壓力進(jìn)樣60sec，聚焦和遷移溫度均為27°C,聚焦電壓15KV,條件為電流到0.4uA，遷移電壓為18KV.檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，電泳方向由正到負(fù)。3.氨基酸組成分析日立835-50型氨基酸自動(dòng)分析儀，樣品經(jīng)6NHCL1l(TC，&保護(hù)下水解24h，離子交換柱分離，茚三酮柱衍生檢測(cè)。4、肽鏈N-末端測(cè)定ABI-491蛋白序列分析儀，反相柱填料為C18，采用Edman降解法測(cè)定。5、含糖定性定量測(cè)定定性測(cè)定采用SDS-PAGE分離蛋白后，用PAS染色，可定性顯示糖蛋白條帶。定量測(cè)定采用苯酚-H2S04法，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)，以每克蛋白含糖量表示。6、血凝活性測(cè)定按孫冊(cè)方法進(jìn)行(孫冊(cè)，大蒜凝集素的分離純化及性質(zhì)研究生物化學(xué)及生物物理學(xué)報(bào)19(3):188_194，1987)，采集兔抗凝血，1500rpm離心5分鐘，去掉血漿,紅細(xì)胞用生理鹽水洗3次，按紅細(xì)胞壓積計(jì)算，配成2%的紅細(xì)胞懸液，待測(cè)樣品倍比稀釋,然后加入等體積紅細(xì)胞懸液,室溫放置4h，肉眼觀察結(jié)果，以能夠引起紅細(xì)胞凝集的最小濃度表示。7、毒性測(cè)定昆明種小白鼠，設(shè)4-7個(gè)劑量組,每組6-8只動(dòng)物，新西蘭大白兔，設(shè)4-7個(gè)劑量組，每組4只動(dòng)物，受試樣品(毒素)用生理鹽水配成適宜濃度,靜脈或腹腔給藥后觀察一周.實(shí)驗(yàn)結(jié)果用藥理學(xué)計(jì)算與程序中的Bliss法計(jì)算LD5。。三試驗(yàn)結(jié)果1分子量測(cè)定(1)SDS-PAGE分析從圖6可以看出，按本發(fā)明純化方法得到的PKP2均達(dá)到電泳純，用2-硫基乙醇處理后P2出現(xiàn)兩條鏈.推測(cè)P:和凝集素P3均出現(xiàn)3條鏈.推測(cè)P,出現(xiàn)3條帶可能是亞基的降解產(chǎn)物。圖7為SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率計(jì)算分子量，見(jiàn)表4表4所分離蛋白質(zhì)和亞單位的分子量方法類別完整的蛋白亞單位SDS-PAGEPI68000360003300031000P2620003500029000P36600063000390003700031000HPCEP263000MALDI-TOF-MSPI64000(2)HPCE測(cè)定毛細(xì)管電泳鑒定h純度，見(jiàn)圖8。P2為單一峰，純度達(dá)到95%，毛細(xì)管電泳測(cè)定分子量結(jié)果見(jiàn)圖9、圖10。從圖9可以得到8種標(biāo)準(zhǔn)蛋白各自的相對(duì)遷移率，圖10為標(biāo)準(zhǔn)蛋白各自的相對(duì)遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)線性關(guān)系圖，可以得到h的分子量為63000，與SDS-PAGE的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，表明SDS-PAGE測(cè)定的P2的分子量數(shù)據(jù)可靠。(3)MALDI-TOF-MS分析PL的MALDI-TOF-MS檢測(cè)分子量結(jié)果見(jiàn)圖11。Pi分子量為64000，為單一成分。2.等電點(diǎn)測(cè)定(1)IEF結(jié)果圖12為等電聚膠電泳pH-cm圖譜(橫坐標(biāo)為從陰極到陽(yáng)極的距離，縱坐標(biāo)為pH值)，Pi，P2，P3的等電點(diǎn)分別為6.9，6.2，5.3;三種蛋白均為單一成分。(2)P2經(jīng)毛細(xì)管等電聚焦電泳P2經(jīng)毛細(xì)管等電聚膠電泳，見(jiàn)圖13;可以得到P2的等電點(diǎn)為6.0-6.2。在聚膠過(guò)程中，由于氯離子的加入，陰極的pH值降低，電流逐步加大，已經(jīng)聚膠成帶的蛋白質(zhì)逐步經(jīng)過(guò)監(jiān)測(cè)器，先是等電點(diǎn)最高的蛋白質(zhì)，其它的依次通過(guò)。3、氨基酸組成分析從氨基酸組成分析，P2成分的大部分氨基酸，如Arg，Lys，asp，thrser，gil，leu，tyr，his的含量與文獻(xiàn)報(bào)道的AbrinC，Abrina的相應(yīng)氨基酸含量相似,而Giu含量比文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果高，Pro，Ala，Met，Iso，Val比文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果偏低，尤其是Pro，Ala.Met與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果差異很大，Pro,Ala含量幾乎為文獻(xiàn)報(bào)道的1/3，MET為文獻(xiàn)報(bào)道的1/5，原因可能是在酸水解過(guò)程中，部分MET被氧化破壞，因?yàn)榘被峤M成分析采用酸水解，全部的Trp，大部分Cys，部分Met被氧化破壞掉。4.N-末端分析P2由兩條鏈組成，推測(cè)應(yīng)出現(xiàn)兩個(gè)N端，實(shí)際測(cè)得N末端序列只有一個(gè)，為IVEKS，與文獻(xiàn)報(bào)道的Abrina的一級(jí)結(jié)構(gòu)比較，此序列與Abrina的B鏈N末端相一致，所以P2的A鏈N-末端是封閉的,通過(guò)Edman降解法不能測(cè)定A鏈N末端.考慮到Abrina的A鏈N末端為Glu，推測(cè)P2的A鏈N末端封閉基團(tuán)為焦谷胺酸，可能用焦谷胺酰氨肽酶處理，可以暴露A鏈N末端游離a-NH2。5.糖含量的定性定量測(cè)定SDS-PAGE凝膠電泳后使用高碘酸-Schiff試劑染色，確定亞基的含糖情況。P、A的2條鏈均為糖蛋白，而h只有1條鏈?zhǔn)翘堑鞍?，根?jù)分子量判斷，A鏈沒(méi)有顯示出來(lái)，所以P2的A鏈不含糖基或含極少量不能顯示出來(lái)，以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)得Pi,P2,P3的含糖量分別為9.4%，3.3%，10.5%。6.血凝活性以兔紅細(xì)胞為凝血活性測(cè)定的材料，測(cè)得Pi,P2，P3引起紅細(xì)胞凝集的最小濃度分別為19lig/ml，2.5ug/ml，0.3ug/ml。7、本發(fā)明所分離的云南Abrin與國(guó)外Abrin比較據(jù)理化性質(zhì)分析，本發(fā)明所分離的h類似于Wei，C等人分離的AbrinA，Olsnes，S.等人分離Abrin,b，它們均為含糖量高，凝集紅細(xì)胞活性低，等電點(diǎn)較高，毒性相對(duì)低的毒素。但是，從分子量比較，質(zhì)譜檢測(cè)h的分子量為64000，而AbrinA為60100，Abrinb為67000，差別很大。據(jù)理化性質(zhì)分析，本發(fā)明所分離的P2類似于Wei，C等人分離的AbrinC、Olsnes，S.等人分離的Abrina，它們均為含糖量低，凝集紅細(xì)胞活性高的毒素。P2的毒性結(jié)果，ip小鼠，觀察期為3天，LD5。為4.02ng/kg，比文獻(xiàn)報(bào)道的性質(zhì)相似的毒素毒性高，AbrinCLD5Q為g/kg，Abrina的LD5。為10ug/kg，可能由于相思子種子產(chǎn)地的差異，分離純化的毒素不同。。本發(fā)明采用5種方法(SDS-PAGE，HPCE，MALDI-TOF-MS，IEF，N-末端分子)鑒定毒素的純度，Pi成分通過(guò)SDS-PAGE鑒定，完整蛋白為單一成分，但二硫鍵裂解后有3個(gè)亞基.通過(guò)質(zhì)譜分析完整蛋白含有單一成分，所以h成分的3個(gè)亞基中有一個(gè)可能為肽鏈降解產(chǎn)物，可能是在樣品保存或處理過(guò)程中形成的。h成分通過(guò)4種方法鑒定均為單一成分.綜合毒性與理化性質(zhì)分析，本發(fā)明分離的hP2可能為中國(guó)云南產(chǎn)相思子中特有的毒素，與文獻(xiàn)報(bào)道的性質(zhì)類似的毒素均有差異。印度學(xué)者分離的AbrinII被認(rèn)為是目前毒性最大的相思子毒素，為L(zhǎng)D5。2.4ug/kg(ip小鼠)，對(duì)S印harose4B無(wú)結(jié)合活性，而本發(fā)明所分離的P2成分卻有很強(qiáng)的結(jié)合活性，顯然兩者并不相同。試驗(yàn)例2本發(fā)明所分離的相思子毒素體外抗腫瘤活性試驗(yàn)18一、試驗(yàn)材料受試樣品本發(fā)明實(shí)施例1所分離的相思子毒素，白色粉末，用DMSO溶解;藥品及試劑RPMI1640購(gòu)自GIBCO公司；小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；MTT購(gòu)自Sigma。細(xì)胞株KB(人口腔上皮癌)，KB/VCR(人口腔上皮癌耐藥細(xì)胞)，A2780(人卵巢癌細(xì)胞)，A549(人肺腺癌細(xì)胞)，HCT-8(人結(jié)腸癌細(xì)胞)，Bel7402(人肝癌細(xì)胞)。A549/Taxo1(人肺腺癌耐藥細(xì)胞)，CNE-2Z(人鼻咽癌細(xì)胞)，PC-3M(人前列腺癌細(xì)胞)，BGC803(人胃癌細(xì)胞)，MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)，CaEs-17(人食管癌細(xì)胞)(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院腫瘤研究所)。儀器BIORAD550型酶標(biāo)儀。二、試驗(yàn)方法MTT法測(cè)定收集生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基制成1X107ml細(xì)胞懸液，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)接種，每孔100ii1(含1000腫瘤細(xì)胞)，置37-C，5%0)2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h后加藥，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照及溶劑對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照藥為順鉑。受試樣品設(shè)5-6個(gè)濃度，每濃度3個(gè)平行孔，置37'C，5%0)2溫箱內(nèi)培養(yǎng)4天。棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT溶液(0.4mg/ml，RPMI1640配制)100u1，37。C孵育4小時(shí)。棄去上清夜，每孔加入DMS0150ul，溶解Fomazan顆粒，輕度震蕩后，用550型酶標(biāo)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)540nm，參考波長(zhǎng)450nm下測(cè)定0D值。結(jié)果計(jì)算以藥物不同濃度及對(duì)細(xì)胞的抑制率作圖可得到劑量反應(yīng)曲線，從中求出半數(shù)抑制濃度(IC5。)。三、試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。_表5MTT法人癌細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果(X土SD)瘤株IC5。(ng/ml)相思子毒素順鉑Bel7402(人癌細(xì)胞)0.000007±0.00000021.051±0.250HCT-8(人結(jié)腸癌細(xì)胞)0.000039±0.0000111.257±0.592CNE-2Z(人鼻咽癌細(xì)胞)0.000041±0.0000121.159±0.628MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)0.000047±0.0000030.489±0.016CaEs-17(人食管癌細(xì)胞)0.000063±0.0000090.585±0.151AM9(人肺癌細(xì)胞)0.000073±0.0000011.023±0.278PC-3M(人前列腺癌細(xì)胞)0.000088±0.0000092.341±0.996KB(人口腔上皮癌細(xì)胞)0.000349±0.0001991.076±0.108A2780(人卵巢癌細(xì)胞)0.000378±0.0000882.327±1.065BGC-803(人胃癌細(xì)胞)0.000528±0.0000871.541±0.421A549/T(人肺癌耐藥株)0.000083±0.0000051.300±0.581KB/V(人口腔上皮癌耐藥株)0.000083±0.0000151.267±0.049試驗(yàn)結(jié)果表明受試樣品相思子毒素對(duì)Bel7402等10余種腫瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用。試驗(yàn)例3本發(fā)明所分離的相思子毒素對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤抑制作用的觀察試驗(yàn)一、試驗(yàn)材料1、受試樣品本發(fā)明實(shí)施例所分離的相思子毒素(Pi、P2)，白色粉末。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育的KM，C57BL品系二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤所生產(chǎn)的SPF級(jí)BALB/C系裸鼠。體重18-22g或16-18g(裸鼠)，合格證號(hào)分別為醫(yī)動(dòng)字第01-3001，01-3004號(hào)和京動(dòng)許字(1999)第015號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施合格證號(hào)為京動(dòng)管準(zhǔn)字(1994)第103號(hào)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)為京動(dòng)管準(zhǔn)字(1996)第007號(hào)。二、試驗(yàn)方法每次試驗(yàn)分5組，即空白對(duì)照組(H2020ml/kg，PO)、陽(yáng)性對(duì)照藥組(環(huán)磷酰胺CTX30mg/kg，ip)，受試樣品低劑量組(50ug/kg)、受試樣品中劑量組(75ug/kg)、受試樣品高劑量組(100ug/kg);口服給藥，每組10動(dòng)物，小鼠性別根據(jù)腫瘤性質(zhì)采用雄性或雌性。每次試驗(yàn)的50只小鼠接種腫瘤后24h，將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只，分組標(biāo)號(hào)后，按體重計(jì)算給藥劑量，并開(kāi)始給藥，每天1次，給藥次、10次或14次。藥效評(píng)定根據(jù)公式腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(1_治療組瘤重/對(duì)照組瘤重)X100%如抑瘤率超過(guò)30%，則進(jìn)行t測(cè)定三、試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表7-表13。表7受試樣品相思f^素對(duì)小鼠移植性腫瘤S180的抑瘤活性觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>與對(duì)照組比較，***P<0.001,**P<0.01表8受試樣品相思子毒素對(duì)小鼠移植性腫瘤Ehrlish癌實(shí)體型抑瘤活性觀察l跟J劑量，物數(shù)體重變化(g)瘤重g抑瘤率<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>相思轉(zhuǎn)素0.075po1010相思f^素0.100po101018.5±1.222.9±1.91.51±0.1449.19.2±1.220.8±2.50.96±0.2064.77***與對(duì)照組比較，***P<0.001,*P<0.05表9受試樣品相思子毒素對(duì)小鼠移植性腫瘤H22抑瘤作用觀察船'J劑量麟動(dòng)物數(shù)體重變化g瘤重g鵬率mg/kg錄始終始終(x土SD)("對(duì)照組恥20mlpo101019.2±1.223.6±1.62.19±0.92cn30ip101019.9±1.120.8±1.10.41±0.1881.28***相思a素0.050po101019.9±0.921.8±1.71.60±0.7126.48相思f4素0.075po101019.7±0.919.7±2.41.30±1.1740.64相思子毒素0.100po101020.3±1.221.0±3.30.44±0.2172.67***與對(duì)照組比較，***P<0.001表10受試樣品相思子毒素對(duì)小鼠移植性腫瘤肺癌Lewis抑瘤作用觀察M^J劑量^動(dòng)物數(shù)mg/kg始終體重變化g始銀瘤重g(x土SD)(%)對(duì)照組H2020mlpo101019.8±1.321.7±0.82.82±0.52CTX30ip101020.0±1.322.3±1.31.08±0.2361.700.050po101019.3±1.319.0±0.91.68±0.3940.43相思^t素0.075po101020.1±1.517.6±1.41.45±0.28*相思^4素0.10po101020.2±1.416.3±0.81.16±0.2658，86*林與對(duì)照組比較，***P<0.001表11受試樣品相思子毒素對(duì)裸鼠移植的人成骨肉瘤OS732抑瘤作用觀察船'J劑量mg/kg麟動(dòng)物數(shù)錄始終體重變化g始沐瘤重g鵬率(x±SD)(%)22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>與對(duì)照組比較，***P<0.001表12受試樣品相思子毒素對(duì)津白小鼠移植性乳腺癌CA891的抑瘤作用觀察<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>與對(duì)照組比較，***P<0.001<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>與對(duì)照組比較，***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤抑制作用的觀察試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所分離的相思子^t能^mWl^慟物移植性腫瘤的增殖活性。權(quán)利要求1、一種分離、純化云南相思子(AbrusprecatoriusL.)毒素P1、P2的方法，包括(1)將云南相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B親和層析柱，先用初始平衡緩沖洗脫掉雜蛋白，然后用半乳糖梯度洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集半乳糖梯度洗脫液的前面兩個(gè)在280nm處有吸收的峰；(2)將步驟(1)所收集的洗脫液濃縮后加樣于DEAE-SepharoseFF凝膠面上，先用洗脫平衡液洗脫掉雜蛋白；然后用含0-0.5mol/LNaCL的10mmol/LTris-HCL進(jìn)行梯度洗脫，分別收集在280nm處有吸收的前兩個(gè)較大的峰，分別濃縮后進(jìn)行脫鹽處理，即得P1、P2。2、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(1)中所述的酸化的S印harose4B親和層析柱按照以下方法制備得到將凝膠S印harose4B酸化處理，經(jīng)洗滌、脫氣、平衡后裝層析柱。3、按照權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述的酸化處理是用鹽酸處理凝膠S印harose4B5-6小時(shí)。4、按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于步驟(1)中所述的初始平衡緩沖液是10mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH=7.4;所述的半乳糖梯度洗脫液為含0一0.5mol/L半乳糖的磷酸鹽緩沖液，pH二7.4;步驟(2)中所述的洗脫平衡液為10mmol/L的Tris-HCLpH為7.0;5、按照權(quán)利要求l的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的脫鹽處理如下以規(guī)格為30X2.0cm的S印hadexG-25為脫鹽柱，將濃縮液上脫鹽柱后用水洗脫,流速為0.8ml/min,280nm檢測(cè)，收集第一主峰。6、權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)方法所分離、純化得到的云南相思子毒素。7、按照權(quán)利要求6的云南相思子毒素，其特征在于所述的相思子毒素由Pi和P2組成；其中，Pi分子量為64000，等電點(diǎn)為6.9，含糖量為9.4%;P2的分子量在62000-63000之間，等電點(diǎn)為6.0-6.2，含糖量為3.3%。8、權(quán)利要求6的云南相思子毒素在制備抗腫瘤藥物中的用途。9、按照權(quán)利要求6的云南相思子毒素，其特征在于將所述的云南相思子^m加入制備不同劑型時(shí)所需的各種輔料和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體后，以常規(guī)的藥物制劑方法制備成任何一種適宜的臨床制劑。10、一種治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物由治療上有效劑量的權(quán)利要求6所述的云南相思子和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了分離、純化云南相思子毒素的方法，包括將相思子粗毒素上酸化的Sepharose4B親和層析柱，先用緩沖液洗脫雜蛋白，然后用半乳糖進(jìn)行梯度洗脫，收集半乳糖梯度洗脫液；濃縮后加樣于DEAE-SepharoseFF凝膠面上，洗脫雜蛋白，梯度洗脫，收集梯度洗脫液，濃縮、脫鹽，即得。本發(fā)明方法利用兩次層析就可以得到相思子的兩種毒素蛋白純品，不僅簡(jiǎn)化了純化步驟，而且再純度，產(chǎn)率上均有顯著提高，為大規(guī)模的純化奠定了基礎(chǔ)。體外抗腫瘤活性試驗(yàn)和動(dòng)物移植性腫瘤抑制作用試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所分離的相思子毒素對(duì)Bel7402等10余種腫瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的抑制作用，能有效的抑制動(dòng)物移植性腫瘤的增殖活性。文檔編號(hào)C07K14/415GK101560243SQ20081010421公開(kāi)日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日發(fā)明者紅林,高南南申請(qǐng)人:高南南