專利名稱：一種抗氧化活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于保健藥品或功能性食品生物工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種抗氧 化活性肽，以及該抗氧化活性肽的制備方法 背景技術(shù)氧化是細(xì)胞生存所需的一種生理機(jī)制，細(xì)胞的這種依賴性會(huì)導(dǎo)致游離自由 基及活性氧的產(chǎn)生。當(dāng)游離自由基的產(chǎn)生超過(guò)一定的數(shù)量時(shí)，它們的活性將大 于細(xì)胞保護(hù)酶的活性，這將直接導(dǎo)致細(xì)胞破壞性的致死作用(細(xì)胞凋亡)，細(xì)胞 的呼吸作用也隨之停止。在人體的衰老和某些疾病的發(fā)生過(guò)程中，氧化起著重 要作用。機(jī)體內(nèi)的氧化作用所產(chǎn)生的游離自由基可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Abuja， P等.Clinica Chimica Acta， 2001， 306: 1 17. Halliwell， B. Cardiovascular Research, 2000， 47:410 418. Halliwell， B 等.British Journal of Pharmacology, 2004， 142:231 - 255. Hoelzl， C等. Journal of Physiology肌d Pharmacology, 2005， 56:49 64)。氧化還危害至ll 阿茨海默病人的大腦中的所有主要的生物大分子(Halliwell, B. Drugs Aging， 2001， 18， 479 484.Liu， Q等.Molecular Aspects of Medicine, 2003， 24: 305 313)?，F(xiàn)有的藥物療法都存在一定的副作用。食品的脂質(zhì)過(guò)氧化作用會(huì)導(dǎo)致食品質(zhì)量劣化，如會(huì)產(chǎn)生酸敗味、不易接受 的口感，而且也會(huì)縮短食品的貨架期。攝取一定量的過(guò)氧化食品會(huì)導(dǎo)致肝臟肥 大或上皮組織壞死等嚴(yán)重病情。 一些人工合成的抗氧化劑(BHA, BHT和n-propyl gallate)對(duì)某些氧化反應(yīng)雖然具有一定的抑制作用，但是這些抗氧化劑在機(jī)體內(nèi) 具有潛在的危害，其使用受到一定的限制。天然抗氧化劑由于具有安全、高效 的性質(zhì)，已引起人們的極大關(guān)注。血紅蛋白生物活性肽具有很多極為重要的功能活性，如阿片樣活性(Brantl V等.Eur J Pharmacol 1986:125:309 - 10. Piot JM等.Biochem Biophys Res Commun 1992， 189: 101 - 110. Zhao QY等.Biochem Biophys Acta 1996， 1295: 73 - 80.Zhao， Q等.Biopolymers， 1997， 43:75 - 98.Nyberg F等，Inc.Biopoly， 1997， 43:147 - 56.Lignot B，等.Biotechnol Appl Biochem 1999， 30:201 - 7) 、 ACE抑制活性(Hyun， C. -K.等.Process Biochemistry, 2000,36:65 - 71)、增強(qiáng)血管舒緩激肽活性(Piot JM等，F(xiàn)EBS Lett 1992,299:75 - 79)、刺激細(xì)菌生長(zhǎng)活性(Zhao， Q等.Analytica Chimica Acta, 1997,352:201 - 220)、鎮(zhèn)痛活性(Takagi H等，Nature 1979， 5737:410 - 412. ZhaoQY等，J Liq Chrom Rel Technol 1997,20:1717 - 1739)、抗菌活性(Daoud R等，Peptides 2005， 26:713-719.Froide雨x R等，F(xiàn)EBS Lett 2001， 491:159 - 163.Li印ke C等，J Chromatogr B 2003， 791:345 - 356. Parish CA等，Bioorg Med Chem 2001,9:377 - 382)等。動(dòng)物血液富含大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，特別是血紅蛋白占血液總蛋白質(zhì)含量的 60 70%。但是目前動(dòng)物血液卻大部分被以污水的形式排放或丟棄，導(dǎo)致大量寶 貴營(yíng)養(yǎng)資源流失，并且給環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。利用血紅蛋白制備抗氧化活性 肽不但有助于環(huán)境的保護(hù)，而且可以充分利用血液中大量寶貴的蛋白質(zhì)開(kāi)發(fā)為 功能食品、醫(yī)藥及化妝品等具有高附加值的生物制品。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)制備血紅蛋白抗氧化活性肽的報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于提供一種利用血紅蛋白制備的抗氧化活性肽。 本發(fā)明另一 目的是提供上述抗氧化活性肽的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 本發(fā)明一種抗氧化活性肽，通過(guò)如下方法制備(1) 按照2 8%的重量百分比取血紅蛋白干粉，并溶于蒸餾水中，在85 90。C下保溫5 10min，得血紅蛋白溶液；(2) 調(diào)節(jié)血紅蛋白溶液的pH至6.7 7.2;按照0.05 0.10%的重量百分比 向血紅蛋白溶液中加入中性蛋白酶，然后在溫度為45 55。C， pH為6.7 7.2條 件下水解3 4，5h，再在85 90。C下恒溫5 10min;得血紅蛋白水解產(chǎn)物溶液；(3) 通過(guò)離子交換樹(shù)脂對(duì)步驟(2)所得血紅蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽，濃 縮、冷凍干燥，即得抗氧化活性肽。上述抗氧化活性肽中所述的中性蛋白酶是指AS1398中性蛋白酶，可于北京 東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。上述抗氧化活性肽的制備方法，包括如下步驟 (1)按照2 8%的重量百分比取血紅蛋白干粉，并溶于蒸餾水中，在85 9(TC下保溫5 10min，得血紅蛋白溶液；(2) 調(diào)節(jié)血紅蛋白溶液的pH至6.7 7.2，按照0.05~0.10%的重量百分比 向血紅蛋白溶液中加入中性蛋白酶，然后在溫度為45 55。C， pH為6.7 7.2條 件下水解3 4.5h，再在85 90。C下恒溫5 10min;得血紅蛋白水解產(chǎn)物溶液；(3) 通過(guò)離子交換樹(shù)脂對(duì)步驟(2)所得水解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍 干燥，即得抗氧化活性肽。上述制備方法中所述的中性蛋白酶是指AS1398中性蛋白酶，可于北京東華 強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司購(gòu)買。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明抗氧化活性肽抗氧化能力強(qiáng)， 抗氧化活性肽的活性(40mg/ml)高于同等濃度下常用天然抗氧化劑維生素C的 抗氧化力；(2)本發(fā)明純度高，純度可達(dá)95%以上，灰分小于1.5%; (3)本發(fā) 明是經(jīng)食品級(jí)蛋白酶在溫和條件下獲得的，其安全性極高，無(wú)副作用，無(wú)不良風(fēng) 味；(4)本發(fā)明抗氧化活性肽具有抗氧化作用外，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)、降血 壓、降膽固醇等作用；(5)本發(fā)明生產(chǎn)成本低，可降低生產(chǎn)成本25%以上。


圖1血紅蛋白和血紅蛋白抗氧化活性肽的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜； A血紅蛋白；B血紅蛋白抗氧化活性肽圖2血紅蛋白(20mg/ml)、蒸餾水與制備的抗氧化活性肽(20mg/ml)之 間抗氧化活力(還原力)柱形圖。圖3 BHT、 VC與抗氧化活性肽之抗氧化活力比較曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1取5g血紅蛋白干粉(豬血經(jīng)過(guò)離心噴霧干燥制得)，溶于100ml蒸餾水中， 在90。C下保溫10min，然后用1NNaOH和1N HCL調(diào)節(jié)體系pH至7.0，接著加 入0.08g AS1398中性蛋白酶(購(gòu)于北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司)，然后在 45°C、 pH值為7.0下水解4h，再在9(TC下恒溫10min，接著通過(guò)離子交換樹(shù)脂 進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍干燥，得到抗氧化活性肽3.1g?？寡趸钚噪暮繙y(cè)定稱取上述抗氧化活性肽干粉溶解于蒸餾水中，用 雙縮脲法測(cè)得其多肽含量大于95%，說(shuō)明制備的抗氧化肽純度較高。抗氧化活性肽灰分含量的測(cè)定在坩堝中稱取上述抗氧化活性肽干粉—在 電爐中炭化至無(wú)煙—在50(TC馬福爐中灼燒到灰白色—冷卻至200°C —移入干燥皿冷卻到室溫—稱重灼燒1小時(shí)—冷卻到恒重，測(cè)得其灰分小于0.8%，說(shuō)明 本發(fā)明制備的抗氧化活性肽基本沒(méi)有污染。實(shí)施例2取2g血紅蛋白干粉(豬血經(jīng)過(guò)離心噴霧干燥制得)，溶于40ml蒸餾水中， 在9(TC下保溫10min，然后用1NNaOH和1N HCL調(diào)節(jié)體系pH至7.0，接著加 入0.032g AS1398中性蛋白酶(北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司)，然后在45^、 pH值為7.0下水解3.5h，再在9(TC下恒溫10min，接著通過(guò)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行 脫鹽，濃縮、冷凍干燥，得到抗氧化活性肽1.3g。取8g血紅蛋白干粉(豬血經(jīng)過(guò)離心噴霧干燥制得)，溶于160ml蒸餾水中， 在90。C下保溫10min，然后用1NNaOH和1NHCL調(diào)節(jié)體系pH至7.0，接著加 入0.128g AS1398中性蛋白酶(北京東華強(qiáng)盛生物技術(shù)有限公司)，然后在45t:、 pH值為7.0下水解4.5h，再在90。C下恒溫10min，接著通過(guò)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行 脫鹽，濃縮、冷凍干燥，得到抗氧化活性肽4.8 g 。試驗(yàn)實(shí)施例1血紅蛋白酶解效果檢測(cè)采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(18%T， 6%C)方法檢測(cè)，具體方法如下取未酶解的血紅蛋白和上述實(shí)施例1所得的抗氧化活性肽進(jìn)行SDS-聚丙烯 酰胺凝膠電泳(18%T， 6%C)分析。采用Tris-glycin-Hcl系統(tǒng)進(jìn)行電泳。其分 離膠濃度為18%，濃縮膠濃度為4%，樣品濃度為20mg/ml，上樣量20{il，采用 考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色，乙醇-冰醋酸進(jìn)行脫色。結(jié)果(見(jiàn)圖l)圖1A為未酶解的血紅蛋白，圖1B為實(shí)施例1所得的酶解 后的抗氧化活性肽，在電泳圖中呈現(xiàn)陰影區(qū)域，說(shuō)明血紅蛋白已經(jīng)被酶解成許 多多肽片段。試驗(yàn)實(shí)施例2抗氧化活性肽的抗氧化活力(還原力)檢測(cè)檢測(cè)方法如下取待測(cè)液lml，加入2.5ml 0.2mol/L磷酸緩沖液(pI^6.6)和 2.5mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混勻，5(TC水浴20min后急速冷卻，加入2.5mL 10%TCA (三氯乙酸)，充分混勻后3000g離心10min。取上清液2.5ml，加入 2.5ml蒸餾水及0.5ml l%Fecl3，充分混勻，室溫反應(yīng)lOmin后于700nm波長(zhǎng)處 測(cè)定吸光度值。吸光度越大，表明樣品的還原力越強(qiáng)，其抗氧化活力也越強(qiáng)。檢測(cè)血紅蛋白(20mg/ml)、蒸餾水及制備的抗氧化活性肽(20mg/ml)的還原力； 檢測(cè)實(shí)施例1制備的抗氧化活性肽(0.01， 0.1， 1， 5， 10， 20， 40mg/ml)的還 原力，同等濃度下以抗氧化劑BHT及VC作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果(見(jiàn)圖2)血紅蛋白(20mg/ml)、蒸餾水與抗氧化活性肽(20mg/ml) 之間的還原力存在顯著性差異，其各自還原力大小順序?yàn)榭寡趸钚噪?gt;血紅蛋 白>蒸餾水。蒸餾水的還原力值僅為0.032。制備的抗氧化活性肽的還原力較血 紅蛋白提高31.8%。不同濃度抗氧化劑BHT、 VC與抗氧化活性肽之抗氧化活力(還原力)比較 結(jié)果(見(jiàn)圖3)顯示，抗氧化劑BHT、 VC與抗氧化活性肽在不同濃度下，還原 力值之間變化趨勢(shì)并不一致?？寡趸钚噪脑谡麄€(gè)濃度范圍內(nèi)還原力都低于 BHT，但其還原力基本呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，在40mg/ml濃度下，其還原力已略 高于VC，顯示出卓越的抗氧化潛力。
權(quán)利要求
1. 一種抗氧化活性肽，其特征在于按照如下方法制備(1)按照2～8％的重量百分比取血紅蛋白干粉，并溶于蒸餾水中，在85～90℃下保溫5～10min，得血紅蛋白溶液；(2)調(diào)節(jié)血紅蛋白溶液的pH至6.7～7.2，按照0.05～0.10％的重量百分比向血紅蛋白溶液中加入中性蛋白酶，然后在溫度為45～55℃，pH為6.7～7.2條件下水解3～4.5h，再在85～90℃下恒溫5～10min；得血紅蛋白水解產(chǎn)物溶液；(3)通過(guò)離子交換樹(shù)脂對(duì)步驟(2)所得血紅蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽，濃縮、冷凍干燥，即得抗氧化活性肽。
2、 按照權(quán)利要求1所述的抗氧化多肽，其特征在于所述的中性蛋白酶是 指AS1398中性蛋白酶。
3、 權(quán)利要求1所述的抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于包括如下歩驟(1) 按照2 8%的重量百分比取血紅蛋白干粉，并溶于蒸餾水中，在85 90。C下保溫5 10min,得血紅蛋白溶液；(2) 調(diào)節(jié)血紅蛋白溶液的pH至6.7 7.2，按照0.05 0.10%的重量百分比 向血紅蛋白溶液中加入中性蛋白酶，然后在溫度為45 55。C， pH為6.7 7.2條 件下水解3 4.5h，再在85 90。C下恒溫5 10min;得血紅蛋白水解產(chǎn)物溶液；(3) 通過(guò)離子交換樹(shù)脂對(duì)步驟(2)所得血紅蛋白水解產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽，濃 縮、冷凍干燥，即得抗氧化活性肽。
4、 按照權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的中性蛋 白酶是AS1398中性蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抗氧化活性肽及其制備方法，主要是將血紅蛋白干粉溶于水中，然后用中性蛋白酶進(jìn)行水解，再進(jìn)行脫鹽、濃縮、冷凍干燥等即可。本發(fā)明抗氧化活性肽抗氧化能力強(qiáng)；本發(fā)明純度高，純度可達(dá)95％以上，灰分小于1.5％；本發(fā)明安全性極高，無(wú)副作用，無(wú)不良風(fēng)味；本發(fā)明抗氧化活性肽具有抗氧化作用外，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降膽固醇等作用；本發(fā)明生產(chǎn)成本低，可降低生產(chǎn)成本25％以上。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101298470SQ20081010344
公開(kāi)日2008年11月5日 申請(qǐng)日期2008年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月3日
發(fā)明者騫 孫, 沈慧星, 羅永康, 鑫 胡 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)