專利名稱：銀杏抗氧化活性肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種銀杏抗氧化活性肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國具有豐富的銀杏資源，其資源量占世界銀杏資源總量的90%。隨著近年來國內(nèi)銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，銀杏種仁的產(chǎn)量也迅速增加，導(dǎo)致銀杏種仁的價格降低。這一方面是由于銀杏種仁中還含有一些致敏性成分，不能直接大量食用；另一方面，銀杏種仁的精深加工產(chǎn)品較少，導(dǎo)致市場上供大于求，價格隨之下降。如何解決銀杏種仁的深加工問題成為銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵所在。銀杏種仁營養(yǎng)豐富，具有很高的食用和藥用價值，含有蛋白質(zhì)、淀粉、黃酮類、萜類、生物堿、多糖類、酚類、氨基酸、微量元素等，此外還含有白果酸、氫化白果酸、銀杏內(nèi)酯等成分。銀杏種仁中蛋白質(zhì)含量在10%以上，氨基酸組成合理，而且具有許多功能作用，如抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等。因此，以銀杏蛋白為原料，推動銀杏的深加工產(chǎn)業(yè)，可以帶來更高的產(chǎn)品附加值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種銀杏抗氧化活性肽的制備方法。本發(fā)明還提供銀杏抗氧化活性肽。所述銀杏抗氧化活性肽的制備方法，以油脂含量不大于0. 95%的銀杏種仁粉末為原料，堿法提取銀杏種仁蛋白質(zhì)，然后采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對所述銀杏種仁蛋白質(zhì)進(jìn)行分步水解，提純得到銀杏抗氧化活性肽。優(yōu)選，油脂含量不大于0. 95%的銀杏種仁粉末是將冷凍干燥、粉碎得到的銀杏種仁粉末超臨界流體萃取法脫脂得到。進(jìn)一步優(yōu)選，冷凍干燥銀杏種仁粉末的條件為在真空度10 20Pa，不高于_35°C條件下冷凍干燥36 48h，超臨界流體萃取法脫脂的參數(shù)為 萃取壓力30 35MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間3 4h。銀杏種仁粉末由銀杏種仁粉碎、過60目篩得到。優(yōu)選，所述堿法提取蛋白質(zhì)的方法為在油脂含量不大于0. 95%的銀杏種仁粉末中加入質(zhì)量濃度為1. 5 2. 5g/L的NaOH溶液，銀杏種仁粉末與NaOH溶液的質(zhì)量體積比 1 25 1 30g/ml，提取溫度3 5°C，提取時間為11 13h，然后離心，取上清液，調(diào)整 PH值到等電點(diǎn)，分離得到沉淀即為銀杏種仁蛋白質(zhì)。a. 2709堿性蛋白酶酶解將銀杏種仁蛋白配制成濃度為18 22g/L的蛋白水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8. 5 9. 5， 以銀杏種仁蛋白的質(zhì)量為基準(zhǔn)，2709堿性蛋白酶添加量為6500 7500U 56°C酶解4 證，滅酶，得到一次酶解液；b.胃蛋白酶酶解將一次酶解液的pH值調(diào)整為2. 5 3. 5，以銀杏種仁蛋白的質(zhì)量為基準(zhǔn)，添加胃蛋白酶的量為8500 9500U · g^,49 51°C酶解1. 5 2.釙，滅酶，得到二次酶解液。優(yōu)選，分步水解后提純的方法為離心二次酶解液得到上清液，經(jīng)過冷凍干燥，得到具有抗氧化活性的銀杏抗氧化肽。所述分步水解后提純過程中的冷凍干燥的方法為預(yù)凍溫度為_50°C，真空度為10 20Pa，凍干溫度低于_:35°C，凍干時間36 48h。進(jìn)一步優(yōu)選，分步水解后提純的方法為離心二次酶解液得到上清液，經(jīng)過冷凍干燥，得到具有抗氧化活性的銀杏抗氧化肽，將銀杏抗氧化活性肽配制成45 55mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，去離子水洗脫，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選的抗氧化活性最高的多肽組分，冷凍干燥，然后配制成45 55mg/mL的溶液，上kphadexG-10凝膠柱進(jìn)行分離純化，去離子水洗脫，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選的抗氧化活性最高的多肽組分，冷凍干燥，然后配制成18 22mg/mL的溶液， 采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，以10%乙腈+0. 1 % TFA為洗脫液，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的兩種組分，經(jīng)冷凍干燥得到具有抗氧化活性的第一多肽組分和第二多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的第一多肽組分和第二多肽組分兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為 Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為 452. 21)和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。本發(fā)明中所述百分比均為質(zhì)量百分比。本發(fā)明以銀杏種仁為原料制備銀杏抗氧化活性肽，所得產(chǎn)品具有較高的抗氧化活性，能夠清除自由基，抑制亞油酸過氧化活性，具有較好的還原能力。本發(fā)明技術(shù)設(shè)計(jì)科學(xué)合理，可以實(shí)現(xiàn)銀杏種仁的綜合利用和提高其附加值，對銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。


圖1為第一多肽組分的液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜圖。圖2為第二多肽組分的液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1在萃取壓力35MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間4h的條件下對銀杏種仁粉末(過60目篩)進(jìn)行脫脂，脫脂后油脂含量為0.95%。稱取脫脂后的銀杏種仁粉末100g，加入質(zhì)量濃度為2g/L的NaOH溶液2. 6L，置于4°C冰箱中提取12h，每隔30min攪拌一次。提取液經(jīng)過3000r/min離心15min，調(diào)整上清液pH值到4. 62，然后5000r/min離心20min，得沉淀。將沉淀配制成20g/L的銀杏種仁蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為8. 5，首先添加 2709堿性蛋白酶，添加量為6500U/g，置于55°C恒溫振蕩水浴槽中酶解4h ；將酶解液置于 90°C水浴中滅酶lOmin，調(diào)節(jié)pH值為2. 5，添加胃蛋白酶的量為8500U/g，置于50°C恒溫振蕩水浴槽中池，將酶解液置于90°C水浴中滅酶lOmin。滅酶后的酶解液于3000r/min離心 lOmin，收集上清液，在-50°C下預(yù)凍證，在真空度10Pa，_35°C條件下冷凍干燥36h，得到銀杏抗氧化活性肽，得率為51. 39%。當(dāng)銀杏抗氧化活性肽的濃度為1. 0mg/mL時，DPPH自由基清除率為46. 56%, !^2+螯合率為76. 38%，還原能力為0. 509。將銀杏抗氧化活性肽凍干粉配制成45mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為4mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0. 4mL/min,收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-25分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成45mg/mL的溶液， 上kphadexG-10凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為4mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為 0.4mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-IO分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成18mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，上樣量為1. 8mL。以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，洗脫流速為lOmL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的組分1和組分2兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為=Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為 452. 21)和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。當(dāng)濃度為 1. Omg/ mL時，肽段Tyr-Val-Gly-Asp的DPPH自由基清除率為79. 29%, Fe2+螯合率為87. 38%，還原能力為 1. 026 ；肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率為 74. 85%, Fe2+螯合率為91. 73%，還原能力為0. 837。實(shí)施例2在萃取壓力30MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間池的條件下對銀杏種仁粉末(過60目篩)進(jìn)行脫脂，脫脂后油脂含量為0. 95%。稱取脫脂后的銀杏種仁粉末 100g，加入質(zhì)量濃度為2g/L的NaOH溶液2. 6L，置于4°C冰箱中提取12h，每隔30min攪拌一次。提取液經(jīng)過3000r/min離心15min，調(diào)整上清液pH值到4. 62，然后5000r/min離心 20min，得沉淀。將沉淀配制成2%的銀杏種仁蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為9. 0，首先添加2709 堿性蛋白酶，添加量為7000U/g，置于55°C恒溫振蕩水浴槽中酶解證；將酶解液置于90°C水浴中滅酶lOmin，調(diào)節(jié)pH值為3. 0，添加胃蛋白酶的量為9000U/g，置于50°C恒溫振蕩水浴槽中池，將酶解液置于90°C水浴中滅酶15min。滅酶后的酶解液于3000r/min離心lOmin， 收集上清液，在-50°C下預(yù)凍證，在真空度15Pa，_35°C條件下冷凍干燥48h，得到銀杏抗氧化活性肽，得率為53. 51%。當(dāng)銀杏抗氧化活性肽的濃度為1. 0mg/mL時，DPPH自由基清除率為48. 56%，F(xiàn)e2+螯合率為79.沈％，還原能力為0. 537。將銀杏抗氧化活性肽凍干粉配制成50mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為5mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.5mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-25分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成50mg/mL的溶液，上kphadex G-IO凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為5mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0. 5mL/min, 收集抗氧化活性最高的多肽組分。G-10分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成20mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，上樣量為2mL。以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，洗脫流速為lOmL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的組分1和組分2兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為=Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為452. 21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。當(dāng)濃度為 1. Omg/mL 時， 肽段Tyr-Val-Gly-Asp的DPPH自由基清除率為79. 05%，F(xiàn)e2+螯合率為87. 31 %，還原能力為 1. 018 ；肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率為 74. 85%, Fe2+螯合率為92. 14%，還原能力為0. 826。實(shí)施例3在萃取壓力35MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間池的條件下對銀杏種仁粉末(過60目篩)進(jìn)行脫脂，脫脂后油脂含量為0. 95%。稱取脫脂后的銀杏種仁粉末 IOOg,加入質(zhì)量濃度為2g/L的NaOH溶液2. 6L，置于4°C冰箱中提取12h，每隔30min攪拌一次。提取液經(jīng)過3000r/min離心15min，調(diào)整上清液pH值到4. 62，然后5000r/min離心 20min，得沉淀。將沉淀配制成2g/L的銀杏種仁蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為9. 5，首先添加2709 堿性蛋白酶，添加量為7500U/g，置于55°C恒溫振蕩水浴槽中酶解4h ；將酶解液置于90°C水浴中滅酶lOmin，調(diào)節(jié)pH值為3. 0，添加胃蛋白酶的量為9500U/g，置于50°C恒溫振蕩水浴槽中池，將酶解液置于90°C水浴中滅酶15min。滅酶后的酶解液于3000r/min離心15min， 收集上清液，在-50°C下預(yù)凍證，在真空度20Pa，-40°C條件下冷凍干燥48h，得到銀杏抗氧化活性肽，得率為50. 79%。當(dāng)銀杏抗氧化活性肽的濃度為1. Omg/mL時，DPPH自由基清除率為47. 34%，F(xiàn)e2+螯合率為76. 98%，還原能力為0. 526。將銀杏抗氧化活性肽凍干粉配制成45mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為6mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.4mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-25分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成45mg/mL的溶液，上kphadex G-IO凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為6mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0. 6mL/min, 收集抗氧化活性最高的多肽組分。G-IO分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成22mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，上樣量為1. 8mL。以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，洗脫流速為lOmL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的組分1和組分2兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為=Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為452. 21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。當(dāng)濃度為 1. Omg/mL 時， 肽段Tyr-Val-Gly-Asp的DPPH自由基清除率為80. 04%，F(xiàn)e2+螯合率為87. 15%，還原能力為 1. 033 ；肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率為 74. 36%, Fe2+螯合率為91. 57%，還原能力為0. 828。實(shí)施例4在萃取壓力35MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間4h的條件下對銀杏種仁粉末(過60目篩)進(jìn)行脫脂，脫脂后油脂含量為0. 95%。稱取脫脂后的銀杏種仁粉末 100g，加入質(zhì)量濃度為0. 2%的NaOH溶液2. 6L，置于4°C冰箱中提取12h，每隔30min攪拌一次。提取液經(jīng)過3000r/min離心15min，調(diào)整上清液pH值到4. 62，然后5000r/min離心 20min，得沉淀。將沉淀配制成2g/L的銀杏種仁蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為9. 5，首先添加2709 堿性蛋白酶，添加量為6500U/g，置于55°C恒溫振蕩水浴槽中酶解證；將酶解液置于90°C水浴中滅酶lOmin，調(diào)節(jié)pH值為3. 5，添加胃蛋白酶的量為9000U/g，置于50°C恒溫振蕩水浴槽中池，將酶解液置于90°C水浴中滅酶lOmin。滅酶后的酶解液于3000r/min離心15min， 收集上清液，在-50°C下預(yù)凍證，在真空度15Pa，-40°C條件下冷凍干燥36h，得到銀杏抗氧化活性肽，得率為50.對％。當(dāng)銀杏抗氧化活性肽的濃度為1. Omg/mL時，DPPH自由基清除率為46. 88%，F(xiàn)e2+螯合率為77. 06%，還原能力為0. 519。將銀杏抗氧化活性肽凍干粉配制成55mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為4mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.4mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-25分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成55mg/mL的溶液，上kphadex G-IO凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為4mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0. 4mL/min,收集抗氧化活性最高的多肽組分。G-IO分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成22mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，上樣量為2mL。以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，洗脫流速為llmL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的組分1和組分2兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為=Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為452. 21) 和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。當(dāng)濃度為 1. Omg/mL 時， 肽段Tyr-Val-Gly-Asp的DPPH自由基清除率為79. 17%，F(xiàn)e2+螯合率為87. 31%，還原能力為 1. 022 ；肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率為 74. 97%, Fe2+螯合率為92. 12%，還原能力為0. 841。實(shí)施例5在萃取壓力30MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間4h的條件下對銀杏種仁粉末(過60目篩)進(jìn)行脫脂，脫脂后油脂含量為0.95%。稱取脫脂后的銀杏種仁粉末100g，加入質(zhì)量濃度為2g/L的NaOH溶液2. 6L，置于4°C冰箱中提取12h，每隔30min攪拌一次。提取液經(jīng)過3000r/min離心15min，調(diào)整上清液pH值到4. 62，然后5000r/min離心20min，得沉淀。將沉淀配制成20g/L的銀杏種仁蛋白溶液，調(diào)節(jié)pH值為9. 0，首先添加 2709堿性蛋白酶，添加量為7000U/g，置于55°C恒溫振蕩水浴槽中酶解4h ；將酶解液置于 900C水浴中滅酶15min，調(diào)節(jié)pH值為3. 0，添加胃蛋白酶的量為9500U/g，置于50°C恒溫振蕩水浴槽中2h，將酶解液置于90°C水浴中滅酶15min。滅酶后的酶解液于3000r/min離心 lOmin，收集上清液，在-50°C下預(yù)凍證，在真空度15Pa，_45°C條件下冷凍干燥36h，得到銀杏抗氧化活性肽，得率為51. 93%。當(dāng)銀杏抗氧化活性肽的濃度為1. Omg/mL時，DPPH自由基清除率為47. 13%, !^2+螯合率為77. 57%，還原能力為0. 528。將銀杏抗氧化活性肽凍干粉配制成50mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為6mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.4mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-25分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成45mg/mL的溶液， 上kphadexG-10凝膠柱進(jìn)行分離純化，上樣量為6mL。以去離子水為洗脫液，洗脫流速為 0.4mL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。將kphadex G-10分離得到的活性最高的組分進(jìn)行多次收集，冷凍干燥，然后配制成20mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化，上樣量為2. 2mL。以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，洗脫流速為llmL/min，收集抗氧化活性最高的多肽組分。采用液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜對純化后得到的組分1和組分2兩個肽段進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，兩個肽段的氨基酸序列分別為=Tyr-Val-Gly-Asp (分子量為 452. 21)和 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His (分子量為 988. 49)。當(dāng)濃度為 1. Omg/ mL時，肽段Tyr-Val-Gly-Asp的DPPH自由基清除率為78. 65%, Fe2+螯合率為86. 87%，還原能力為 1. 033 ；肽段 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His 的 DPPH 自由基清除率為 74. 27%, Fe2+螯合率為91. 46%，還原能力為0. 829。
權(quán)利要求
1.一種銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，以油脂含量不大于0.95%的銀杏種仁粉末為原料，堿法提取銀杏種仁蛋白質(zhì)，然后采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對所述銀杏種仁蛋白質(zhì)進(jìn)行分步水解，提純得到銀杏抗氧化活性肽。
2.如權(quán)利要求1所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，油脂含量不大于 0. 95%的銀杏種仁粉末是將冷凍干燥、粉碎得到的銀杏種仁粉末超臨界流體萃取法脫脂得到。
3.如權(quán)利要求2所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，冷凍干燥銀杏種仁粉末的條件為在真空度10 20Pa，不高于_35°C條件下冷凍干燥36 48h，超臨界流體萃取法脫脂的參數(shù)為萃取壓力30 35MPa，萃取溫度50°C，CO2流量20L/h，萃取時間3 4h。
4.如權(quán)利要求1所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，所述堿法提取蛋白質(zhì)的方法為在油脂含量不大于0. 95%的銀杏種仁粉末中加入質(zhì)量濃度為1.5 2. 5g/ L的NaOH溶液，銀杏種仁粉末與NaOH溶液的質(zhì)量體積比1 25 1 30g/ml，提取溫度 3 5°C，提取時間為11 13h，然后離心，取上清液，調(diào)整pH值到等電點(diǎn)，分離得到沉淀即為銀杏種仁蛋白質(zhì)。
5.如權(quán)利要求1所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，所述堿性蛋白酶為2709堿性蛋白酶，對所述銀杏種仁蛋白質(zhì)進(jìn)行分步水解的方法為a.2709堿性蛋白酶酶解將銀杏種仁蛋白配制成濃度為18 22g/L的蛋白水溶液，調(diào)節(jié)pH值為8. 5 9. 5，以銀杏種仁蛋白的質(zhì)量為基準(zhǔn)，2709堿性蛋白酶添加量為6500 7500U 56°C酶解4 證，滅酶，得到一次酶解液；b.胃蛋白酶酶解將一次酶解液的PH值調(diào)整為2. 5 3. 5，以銀杏種仁蛋白的質(zhì)量為基準(zhǔn)，添加胃蛋白酶的量為8500 9500U · g^,49 51°C酶解1. 5 2. 5h，滅酶，得到二次酶解液。
6.如權(quán)利要求1所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，分步水解后提純的方法為離心二次酶解液得到上清液，經(jīng)過冷凍干燥，得到具有抗氧化活性的銀杏抗氧化肽。
7.如權(quán)利要求6所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，所述分步水解后提純過程中的冷凍干燥的方法為預(yù)凍溫度為-50°C，真空度為10 20Pa，凍干溫度低于-35 °C，凍干時間36 48h。
8.如權(quán)利要求6或7所述的銀杏抗氧化活性肽的制備方法，其特征在于，分步水解后提純的方法為離心二次酶解液得到上清液，經(jīng)過冷凍干燥，得到具有抗氧化活性的銀杏抗氧化肽，將銀杏抗氧化活性肽配制成45 55mg/mL的溶液，上kphadex G-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，去離子水洗脫，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選的抗氧化活性最高的多肽組分，冷凍干燥，然后配制成45 55mg/mL的溶液，上kphadex G-IO凝膠柱進(jìn)行分離純化，去離子水洗脫，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選的抗氧化活性最高的多肽組分，冷凍干燥，然后配制成18 22mg/mL的溶液，采用半制備型液相色譜進(jìn)行分離純化， 以10%乙腈+0. 1% TFA為洗脫液，收集以DPPH自由基清除率為檢測指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的兩種組分，經(jīng)冷凍干燥得到具有抗氧化活性的第一多肽組分和第二多肽組分。
9.一種銀杏抗氧化活性肽，其序列為Tyr-Val-Gly-Asp。
10.一種銀杏抗氧化活性肽，其序列為 Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-HiS。
全文摘要
本發(fā)明涉及銀杏抗氧化活性肽及其制備方法。所述銀杏抗氧化活性肽的制備方法，以油脂含量不大于0.95％的銀杏種仁粉末為原料，堿法提取銀杏種仁蛋白質(zhì)，然后采用堿性蛋白酶和胃蛋白酶對所述銀杏種仁蛋白質(zhì)進(jìn)行分步水解，提純得到銀杏抗氧化活性肽。銀杏抗氧化活性肽，其序列為Tyr-Val-Gly-Asp，或者Leu-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Ala-Val-His。本發(fā)明以銀杏種仁為原料制備銀杏抗氧化活性肽，所得產(chǎn)品具有較高的抗氧化活性，能夠清除自由基，抑制亞油酸過氧化活性，具有較好的還原能力。本發(fā)明技術(shù)設(shè)計(jì)科學(xué)合理，可以實(shí)現(xiàn)銀杏種仁的綜合利用和提高其附加值，對銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。
文檔編號C07K1/16GK102337318SQ201110210119
公開日2012年2月1日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者吳彩娥, 曹福亮, 李婷婷, 范龔健, 賈韶千 申請人:南京林業(yè)大學(xué)