酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解制備扁杏杏仁抗氧化肽的最佳工藝條件：酶用量6725U/g、底物濃度3％、酶解溫度60℃、pH8.28，經(jīng)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到的酶解液對(duì)OH的清除率的平均值為84.18％，DH的平均值為20.87％，還原力的平均值為0.743，并采用透析袋、凝膠色譜技術(shù)、高效液相色譜HPLC、半制備液相RP-HPLC對(duì)AAMH進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，并采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀技術(shù)和Edman降解法對(duì)分離純化得到的扁杏杏仁抗氧化肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。
【專利說(shuō)明】
酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及扁杏杏仁抗氧化肽的制備方法，具體涉及一種酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著營(yíng)養(yǎng)學(xué)及生物技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶分解后并不是以游離氨基酸為主要的吸收形式，而是以介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的短肽的形式被機(jī)體吸收。生物活性肽是介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一種短肽，其具有易被人體吸收利用、安全性高、生產(chǎn)成本較低等特點(diǎn)，并充當(dāng)腸道消化過(guò)程中的新陳代謝潛在生理效應(yīng)物。近年來(lái)大量研究表明，利用合適的蛋白酶水解食源性蛋白質(zhì)可制備生物活性肽，并且將能夠清除體內(nèi)自由基的一類生物活性肽稱為抗氧化活性肽，簡(jiǎn)稱抗氧化肽。由于利用蛋白酶從食源性物質(zhì)中制備的抗氧化肽，不僅具有良好的抗氧化活性，而且酶法水解制備的短肽產(chǎn)物具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高、攝入后副作用小、水解條件溫和、產(chǎn)品深度開發(fā)前景廣等特點(diǎn)，廣受國(guó)內(nèi)外學(xué)者青睞。從已有的報(bào)道中可以看出，多種食源性蛋白質(zhì)經(jīng)酶解制得的抗氧化活性肽均具有良好的抗氧化活性，如Moure等研究了經(jīng)超濾酶解后所得的大豆蛋白濃縮物的酶解片斷具有抗氧化性能，其中抗氧化活性最強(qiáng)的是分子量小于1kDa的肽片斷；Chen等人通過(guò)用商業(yè)蛋白酶和堿性蛋白酶制備的花生酶解液，具有很好的抗氧化活性，并且預(yù)測(cè)花生酶解液可作為一種很好的天然抗氧化劑，是一種人類可食用的健康食品；Parrad0等酶解米糠蛋白發(fā)現(xiàn)，由6-30個(gè)氨基酸組成的米糠肽，具極好的抗氧化活性。但是由于蛋白酶具有專一性，單一蛋白酶的作用位點(diǎn)少，肽得率較低，而堿性蛋白酶經(jīng)常被研究者用作工具酶，但由于其在酶解過(guò)程中需要不斷加入NaOH來(lái)維持體系pH的平衡，這對(duì)后續(xù)處理的工作量加大，因此，選用復(fù)合酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)，因?yàn)槔脧?fù)合酶制備生物活性肽，不僅有利于其產(chǎn)率的提高，而且當(dāng)利用內(nèi)切酶與外切酶聯(lián)合制備時(shí)，其所得多肽的苦味物質(zhì)要比單獨(dú)使用內(nèi)切酶制得的多肽的苦味物質(zhì)小。
[0003]扁杏杏仁是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的仁用杏，富含脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等營(yíng)養(yǎng)成分。脫脂后的杏仁柏蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%以上，但目前大部分被用于飼料或制成功能性較差的杏仁粉，經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值和產(chǎn)品附加值均較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0006]酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法，包括如下步驟:
[0007]S1、取扁杏杏仁500g，于45°C恒溫水浴鍋中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并過(guò)80目篩制得扁杏杏仁柏；
[0008]S2、將所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30_60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室溫下不斷攪拌脫脂5h，真空抽濾，回收石油醚，以上工藝重復(fù)3次后，將所得扁杏杏仁柏置于通風(fēng)廚中揮發(fā)有機(jī)溶劑48h，得脫脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存；
[0009]S3、取脫脂扁杏杏仁柏若干，用蒸餾水配置成濃度為2-4%的溶液，置于50°C的恒溫震蕩水浴鍋中，預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)PH至7.5-8.5，按5000-10000U/g的比例加入堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶，堿性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶的酶活比為3: 2，55-65°(:下，酶解2.511后，將酶解液于90°C的水浴鍋滅酶15min，終止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，以4000r/min離心20min，取上清液冷凍干燥即得扁杏杏仁酶解液；
[0010]S5、向經(jīng)處理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，將另一端封好，置于盛有500mL雙蒸水的燒杯中，用磁力攪拌器不斷攪拌，每隔4h換水一次，直到透出液不再有顏色變化，將透出液在50 0C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮液冷凍干燥24h，得到了分子量大于3500Da的組分A和分子量小于3500Da的組分B ；
[0011]S6、將經(jīng)過(guò)處理后的葡聚糖凝膠Sephadex G_25裝柱(1.6 X 60cm);稱取透析袋截留量小于3500Da的組分B的凍干粉若干，溶于雙蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，選用超純水作為洗脫液，并用蒸餾水以0.3mL/min的流速洗脫；將洗脫組分分管收集，每5min收集一管；重復(fù)上樣，合并每次分離時(shí)相同位置的組分峰，將所收集的組分峰冷凍干燥，得組分B1、組分B2、組分B3和組分B4 ；
[0012]S7、將所得4個(gè)組分進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，并將具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分B4配制成濃度為40mg/mL，用葡聚糖凝膠Sephadex G_15繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，按出峰先后順序分別記作組分B4a和組分B4b，分別重復(fù)牧集同一時(shí)間的各組分，并進(jìn)行冷凍干燥；
[0013]S8、將組分 B4b 經(jīng) RP-HPLC (Zorbax SB-C18 4.6 X 250 X 5um) Agilent 1260 分離后，收集得到 10 個(gè)主要組分，分別記作 B4b-1，B4b-2，B4b-3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b-8，B4b-9，B4b-10，重復(fù)進(jìn)樣，多次收集各組分，并分別將其冷凍干燥；
[0014]S9、通過(guò)測(cè)定各組分的DPPH清除率，篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的兩個(gè)組分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜分析法測(cè)得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量為674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法對(duì)組分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，得到組分B4b-4的氨基酸序列為Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;組分B4b_6的氨基酸序列為Ser-Val-Pro-Tyr-Glu0
[0015]優(yōu)選的，酶用量為6725.65U/g、底物濃度為2.98%、酶解溫度為60.54 °C、pH為
8.28 ο
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解制備扁杏杏仁抗氧化肽的最佳工藝條件:酶用量6725U/g、底物濃度3%、酶解溫度60°C、pH8.28，經(jīng)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到的酶解液對(duì)OH的清除率的平均值為84.18%, DH的平均值為20.87%，還原力的平均值為0.743，并采用透析袋、凝膠色譜技術(shù)、高效液相色譜HPLC、半制備液相RP-HPLC對(duì)AAMH進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，并采用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀技術(shù)和Edman降解法對(duì)分離純化得到的扁杏杏仁抗氧化肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定，從而為開發(fā)具有高附加值的扁杏杏仁抗氧化活性肽提供理論基礎(chǔ)和試驗(yàn)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例中AAMH和透析后組分的抗氧化活性示意圖。
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例中sephadex G_25分離AAMH所得成分的示意圖
[0020]圖3為本發(fā)明實(shí)施例中sephadex G_25分離組分的抗氧話活性的示意圖
[0021]圖4為本發(fā)明實(shí)施例中Sephadex G_15分離AAMH所得成分的示意圖。
[0022]圖5為本發(fā)明實(shí)施例中Sephadex G_15分離組分的抗氧化活性的示意圖。
[0023]圖6為本發(fā)明實(shí)施例中組分B4b純度檢測(cè)色譜圖。
[0024]圖7為本發(fā)明實(shí)施例中半制備RP-HPLC分離組分B4b的圖譜
[0025]圖8為本發(fā)明實(shí)施例中RP-HPLC洗脫組分的抗氧化活性示意圖。
[0026]圖9為本發(fā)明實(shí)施例中組分B4b-4的MALD1-TOF-MS圖譜。
[0027]圖10為本發(fā)明實(shí)施例中組分B4b-6的MALD1-TOF-MS圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0030]S1、取扁杏杏仁500g，于45°C恒溫水浴鍋中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并過(guò)80目篩制得扁杏杏仁柏；
[0031]S2、將所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30_60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室溫下不斷攪拌脫脂5h，真空抽濾，回收石油醚，以上工藝重復(fù)3次后，將所得扁杏杏仁柏置于通風(fēng)廚中揮發(fā)有機(jī)溶劑48h，得脫脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存；
[0032]S3、取脫脂扁杏杏仁柏若干，用蒸餾水配置成濃度為2-4%的溶液，置于50°C的恒溫震蕩水浴鍋中，預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)PH至7.5-8.5，按5000-10000U/g的比例加入堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶，堿性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶的酶活比為3: 2，55-65°(:下，酶解2.511后，將酶解液于90°C的水浴鍋滅酶15min，終止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，以4000r/min離心20min，取上清液冷凍干燥即得扁杏杏仁酶解液；
[0033]S5、向經(jīng)處理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，將另一端封好，置于盛有500mL雙蒸水的燒杯中，用磁力攪拌器不斷攪拌，每隔4h換水一次，直到透出液不再有顏色變化，將透出液在50 0C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮液冷凍干燥24h，得到了分子量大于3500Da的組分A和分子量小于3500Da的組分B ；
[0034]AAMH通過(guò)透析袋初步分離為分子量大于3.5KDa (記為組分A)和小于3.5KDa (記為組分B)兩個(gè)組分。將各個(gè)組分冷凍干燥后，配制成濃度為6mg/mL的溶液，測(cè)定各個(gè)組分的還原能力，.0H清除率以及DPPH清除率，并以相同濃度的AAMH和Vc做對(duì)比。由圖1可以看出，組分A和組分B均具有較強(qiáng)的抗氧化能力，而組分B對(duì).0Η清除能力顯著性高于組分A和原液(P < 0.05)，且在P < 0.05水平上與Vc的清除能力沒有顯著性差異，其.0H的清除率為76.6% ;組分B對(duì)DPPH的清除率和還原力分別為70.2%和0.75，均顯著性高于扁杏杏仁酶解原液(P < 0.05)，由此說(shuō)明，小分子肽具有更好的抗氧化活性，因此選擇分子量小于3.5KDa的肽類，即組分B進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。
[0035]S6、將經(jīng)過(guò)處理后的葡聚糖凝膠Sephadex G_25裝柱(1.6 X 60cm);稱取透析袋截留量小于3500Da的組分B的凍干粉若干，溶于雙蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，選用超純水作為洗脫液，并用蒸餾水以0.3mL/min的流速洗脫；將洗脫組分分管收集，每5min收集一管；重復(fù)上樣，合并每次分離時(shí)相同位置的組分峰，將所收集的組分峰冷凍干燥，得組分B1、組分B2、組分B3和組分B4 ；
[0036]葡聚糖凝膠Sephadex G_25的分離結(jié)果如圖2所示。透析初步分離得到的分子量小于3500Da組分B，經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠S印hadex G_25分離后得到了 4個(gè)組分，按分子量從小到大的順序，分別命名為B1、B2、B3和B4。其中組分84的分子質(zhì)量最小，洗脫體積最大。最后將所收集到的各組分進(jìn)行冷凍干燥。
[0037]測(cè)定組分B1、B2、B3和B4的抗氧化活性，以對(duì).0H和DPPH的清除能力以及還原力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，并以相同濃度Vc的抗氧化活性作為對(duì)照，其結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出各個(gè)組分均具有較強(qiáng)的清除.0H和DPPH能力，也表現(xiàn)出一定的還原能力。Vc及各組分對(duì).0H的清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)?組分B4 > Vc >組分B3 >組分B2 >組分BI，其中清除能力最強(qiáng)的組分B4對(duì).0H清除率為86.8%，在P < 0.05水平上顯著性高于其他3個(gè)組分，略低于Vc的清除率87.7 %。各組分及Vc對(duì)DPPH清除能力由強(qiáng)到弱的順序?yàn)?組分B4 > Vc >組分B2 >組分B3 >組分BI，對(duì)DPPH的清除能力最強(qiáng)的組分B4的清除能力為78.9%，在P < 0.05水平上顯著性高于Vc及其他3個(gè)組分。組分B4的還原力為0.85，在P < 0.05水平上顯著性高于其他3個(gè)組分低于Vc的還原能力。對(duì)抗氧化活性最強(qiáng)的組分B4進(jìn)一步采用葡聚糖凝膠Sephadex G_15進(jìn)行分離純化。
[0038]S7、將所得4個(gè)組分進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，并將具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分B4配制成濃度為40mg/mL，用葡聚糖凝膠Sephadex G_15繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，按出峰先后順序分別記作組分B4a和組分B4b，分別重復(fù)收集同一時(shí)間的各組分，并進(jìn)行冷凍干燥；
[0039]將經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G_25分離得到的抗氧化活性最強(qiáng)的組分B4用截留量小于1500Da的葡聚糖凝膠Sephadex G_15進(jìn)一步進(jìn)行分離，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，組分B4又被分離成2種主要組分和其他一些小組分，將這兩個(gè)主要組分按出峰先后順序分別記作組分B4a和組分B4b，分別重復(fù)收集同一時(shí)間的各組分，并進(jìn)行冷凍干燥，其抗氧化活性如圖5所示。由圖5可以看出，葡聚糖凝膠Sephadex G_15分離得到的各組分對(duì).0Η和DPPH有較好的清除能力，同時(shí)各組分也體現(xiàn)出一定的還原能力。組分B4b對(duì).0Η的清除率和還原力分別為79.3%和0.75，接近于Vc的清除率88.8%和還原力0.89，且顯著性高于組分B4a(p < 0.05);組分B4b對(duì)DPPH的清除率為74.6%，與Vc沒有顯著性差異，且顯著性高于組分Ma (P < 0.05)。綜上所述，組分Mb的抗氧化能力優(yōu)于組分B4a，同時(shí)組分B4b較組分B4a出峰晚，分子量小。
[0040]S8、將組分 Mb 經(jīng) RP-HPLC (Zorbax SB-C18 4.6 X 250 X 5um) Agilent 1260 分離后，收集得到 10 個(gè)主要組分，分別記作 B4b-1，B4b-2，B4b-3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b-8，B4b-9，B4b-10，重復(fù)進(jìn)樣，多次收集各組分，并分別將其冷凍干燥；
[0041]S9、通過(guò)測(cè)定各組分的DPPH清除率，篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的兩個(gè)組分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜分析法測(cè)得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量為674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法對(duì)組分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，得到組分B4b-4的氨基酸序列為Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;組分B4b_6的氨基酸序列為Ser-Val-Pro-Tyr-Gluο
[0042]應(yīng)用高效液相色譜HPLC，對(duì)分離純化得到的組分Mb進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。圖6顯示，雖然只有一個(gè)主峰，但雜峰也比較多，說(shuō)明樣品不是單一成分，其純度達(dá)不到后續(xù)分析所需在95%以上的純度，因此需要進(jìn)一步分離純化。
[0043]本具體實(shí)施通過(guò)對(duì)DH模型進(jìn)行典型性分析，確定最優(yōu)條件下OH.的清除率、水解度和還原力。通過(guò)用Design Expert7.0軟件分析，獲得堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解制備扁杏杏仁抗氧化肽的最優(yōu)條件如下:酶用量為6725.65U/g、底物濃度為2.98%、酶解溫度為60.540C、pH為8.28，酶解液對(duì)OH.清除率的理論值為85.64%,水解度的理論值為21.46%,還原力的理論值為0.759。為檢驗(yàn)響應(yīng)面方法的可行性，并綜合考慮實(shí)際操作的便利性，將工藝參數(shù)修正為:酶用量6725U/g、底物濃度30Z0、溫度60°C、pH8.28，經(jīng)3次平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到OH.的清除率為84.18%, DH的平均值為20.87%，還原力的平均值為0.743，分別與理論值相差1.7%,2.75%和2.22%，屬于允許誤差范圍，說(shuō)明利用該模型對(duì)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶解制備扁杏杏仁抗氧化肽的工藝參數(shù)優(yōu)化是可行的，得到的工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0044]如圖7所示，扁杏杏仁抗氧化肽的組分B4b經(jīng)RP-HPLC(Zorbax SB-C18
4.6 X 250 X 5um(Agilent.USA) Agilent 1260 (Agilent.USA)分離后，收集得到 10 個(gè)主要組分，分別記作 B4b-1，B4b-2，B4b_3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b_8，B4b_9，B4b_10，重復(fù)進(jìn)樣，多次收集各組分，并分別將其冷凍干燥。圖8為扁杏杏仁抗氧化肽，經(jīng)RP-HPLC分離得到的各組分的抗氧化活性測(cè)定結(jié)果。由圖7可以看出組分B4b-6對(duì)DPPH的清除能力最強(qiáng)，達(dá)到了 80.2%，組分B4b-4次之，其對(duì)DPPH.的清除能力為76.9%。并進(jìn)行下一步的結(jié)構(gòu)鑒定分析。
[0045]扁杏杏仁抗氧化肽組分B4b_4和組分B4b_6的質(zhì)譜分析如圖9和圖10所示，MALD1-T0F-MS試驗(yàn)結(jié)果顯示，分別在分子量為674.1Da和567.9Da左右有一個(gè)比較大的峰。
[0046]經(jīng)測(cè)定，扁杏杏仁抗氧化肽組分B4b_4的氨基酸序列為Val-Leu-Tyr-1It-Trp ;組分B4b-6的氨基酸序列為Ser-Val-Pro-Tyr-Glu，與MALD1-TOF-MS測(cè)得的分子質(zhì)量相符。
[0047]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、取扁杏杏仁500g，于45°C恒溫水浴鍋中浸泡2h，手工去皮，置于50°C的干燥箱中烘干，粉碎并過(guò)80目篩制得扁杏杏仁柏； 52、將所得的扁杏杏仁柏和石油醚在30-60°C下，以1: 5(W/V)的比例混合，在室溫下不斷攪拌脫脂5h，真空抽濾，回收石油醚，以上工藝重復(fù)3次后，將所得扁杏杏仁柏置于通風(fēng)廚中揮發(fā)有機(jī)溶劑48h，得脫脂扁杏杏仁柏，在4°C下保存； 53、取脫脂扁杏杏仁柏若干，用蒸餾水配置成濃度為2-4%的溶液，置于50°C的恒溫震蕩水浴鍋中，預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)PH至7.5-8.5，按5000_10000U/g的比例加入堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶復(fù)合酶，堿性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶的酶活比為3: 2，55-65°C下，酶解2.5h后，將酶解液于90°C的水浴鍋滅酶15min，終止反應(yīng)，待冷卻至室溫后，以4000r/min離心20min，取上清液冷凍干燥即得扁杏杏仁酶解液； 55、向經(jīng)處理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，將另一端封好，置于盛有500mL雙蒸水的燒杯中，用磁力攪拌器不斷攪拌，每隔4h換水一次，直到透出液不再有顏色變化，將透出液在50 °C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，將濃縮液冷凍干燥24h，得到了分子量大于3500Da的組分A和分子量小于3500Da的組分B ； 56、將經(jīng)過(guò)處理后的葡聚糖凝膠S印hadexG_25裝柱；稱取透析袋截留量小于3500Da的組分B的凍干粉若干，溶于雙蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，選用超純水作為洗脫液，并用蒸餾水以0.3mL/min的流速洗脫；將洗脫組分分管收集，每5min收集一管；重復(fù)上樣，合并每次分離時(shí)相同位置的組分峰，將所收集的組分峰冷凍干燥，得組分B1、組分B2、組分B3和組分B4 ； 57、將所得4個(gè)組分進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，并將具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分B4配制成濃度為40mg/mL，用葡聚糖凝膠Sephadex G_15繼續(xù)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，按出峰先后順序分別記作組分B4a和組分B4b，分別重復(fù)收集同一時(shí)間的各組分，并進(jìn)行冷凍干燥； 58、將組分B4b經(jīng)RP-HPLCAgilent 1260分離后，收集得到10個(gè)主要組分，分別記作B4b-1，B4b-2，B4b_3，B4b_4，B4b_5，B4b_6，B4b_7，B4b_8，B4b_9，B4b_10，重復(fù)進(jìn)樣，多次收集各組分，并分別將其冷凍干燥； 59、通過(guò)測(cè)定各組分的DPPH清除率，篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的兩個(gè)組分B4b-4和B4b-6 ;采用MALD1-TOF-MS質(zhì)譜分析法測(cè)得抗氧化活性肽B4b_4和B4b_6的分子量為674.1Da和567.9Da ;采用Edman降解法對(duì)組分B4b_4和B4b_6的N-端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定，得到組分B4b-4的氨基酸序列為Val-Leu-Tyr-1lt-Trp ;組分B4b_6的氨基酸序列為Ser-Val-Pro-Tyr-Glu02.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種酶解扁杏杏仁制備扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，酶用量為6725.65U/g、底物濃度為2.98%、酶解溫度為60.54°C、pH為8.28。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK105886587SQ201510469332
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年7月30日
【發(fā)明人】張海生
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)