專利名稱：用23s核糖體基因探針陣列檢測水生動物病原菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌檢驗技術(shù)，具體地講是運用核酸分子雜交反應(yīng)檢測致病細(xì)菌，特別是水生動物病原菌(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細(xì)菌)的技術(shù)。
背景技術(shù)：
目前，水生動物病原微生物檢測方法基本上依靠生化鑒定和培養(yǎng)鑒定。這些鑒定費時費力，并且又是在種水平的鑒定上結(jié)果并不可靠。隨著分子生物學(xué)鑒定方法的發(fā)展，基于這些方法的細(xì)菌分類正在逐漸被修正。這一狀況從側(cè)面說明了建立分子生物學(xué)鑒定方法的必要性。相關(guān)研究在國際上已廣泛開展，國內(nèi)這方面研究也在逐漸興起。
在水生動物病原微生物檢測方面，國內(nèi)基本上采用的是生化方法，鮮有芯片或微陣列應(yīng)用的文獻(xiàn)報道，國際上雖有水生動物致病微生物檢驗芯片的研究報道，但其檢測的范圍并不全面。從技術(shù)層面講，目前細(xì)菌分子檢測運用最多DNA靶點是16S rRNA基因。但在許多情況下，相近種之間在16S rRNA基因序列上的差異非常有限(同屬的細(xì)菌16S rRNA基因序列差別基本上小于4％相似度)，并且有時候這些差別位點分布比較均勻。所以用16S rRNA基因上的差別位點設(shè)計相近種鑒別探針難度較大，而且鑒別效果往往不理想。23S rRNA可變區(qū)域多，分子量更大，與16S rRNA基因相比變異位點豐富而集中，但在種的水平上具有保守性。再加上一般細(xì)菌都有多個拷貝的rRNA操縱子，使得利用23S設(shè)計種特異性探針非常便利，并且大大提高了探針的特異性。
DNA微陣列在水生動物疫病檢測方面有廣泛的應(yīng)用前景，能夠大大提高檢驗的效率，節(jié)省人力，時間。真正能夠做到一次檢驗給出可能感染的病原微生物的感染狀況的全面信息，并且結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡便快速。

發(fā)明內(nèi)容
目前我國尚沒有在水生動物疫病檢測方面運用寡核苷酸微陣列檢測病原菌的標(biāo)準(zhǔn)方法，依然沿用了增菌法、PCR方法、熒光PCR方法檢測水生動物疫病病原菌。增菌法需要經(jīng)過前增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等經(jīng)典的檢驗方法檢測目標(biāo)菌。試驗時間長，處理樣品量小，而且靈敏度和特異性都相對較低。而PCR方法、熒光PCR方法檢測通量低，一次只能實現(xiàn)一種病原菌的檢驗。
針對上述情況，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供了一種運用寡核苷酸微陣列檢測病原菌技術(shù)檢測水生動物疫病病原菌的方法(包括殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、鮰魚愛德華氏菌、殺魚腸球菌、鏈球菌、嗜冷屈撓桿菌、柱狀屈撓桿菌、多殺巴斯德氏菌、殺魚巴斯德氏菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、丁香組假單胞菌、霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌、哈維弧菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、弗氏弧菌、溶藻弧菌等23種細(xì)菌)為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的首先用生物信息學(xué)方法設(shè)計特異性探針序列如下序列一(氣單胞菌屬通用探針AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(殺鮭氣單胞菌探針Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA
序列四(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌屬通用探針CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探針Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鮰魚愛德華氏菌探針Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(殺魚腸球菌探針Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(鏈球菌屬通用探針Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(惡臭假單胞菌探針1Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(惡臭假單胞菌探針2Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(熒光假單胞菌探針1Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(熒光假單胞菌探針2Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香組假單胞菌探針Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈維弧菌探針1Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈維弧菌探針2Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈維弧菌探針3Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探針V.parp21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探針1Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探針2Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探針Vflfup21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探針Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT其中D代表堿基A或G或T中的任意一個；W代表堿基A或T中的任意一個。然后PCR擴(kuò)增待測樣品中全部微生物的23S rRNA基因內(nèi)的部分DNA片斷，同時進(jìn)行地高辛標(biāo)記時所使用的PCR引物寡核苷酸序列如下
引物序列1(23S rRNA基因片段擴(kuò)增前引物P23forward)GCGATTTCYG AAYGGGGRAACCC引物序列2(23S rRNA基因片段擴(kuò)增后引物P23reverse)TTCGCCTTTCCCTCACGGTA CT其中Y代表堿基C或T中的任意一個；R代表堿基A或G中的任意一個。運用寡核苷酸微陣列檢測多種水生動物病原菌的方法包括以下步驟1.設(shè)計特異性寡核苷酸探針，用于分子雜交-酶聯(lián)免疫顯色檢測；2.PCR擴(kuò)增待測樣品中全部原核微生物的23S rRNA基因的部分DNA片斷，同時進(jìn)行地高辛標(biāo)記；3.將設(shè)計的特異性寡核苷酸基因探針點在帶有正電荷的尼龍膜(Amersham公司，美國)上，組成探針微陣列，微陣列的點制按圖1中的順序和位置，在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘；本專利申請書的所有附圖中的點所對應(yīng)的探針均和圖1中所示一樣為1陽性對照2陰性對照3氣單胞菌屬通用探針AFp1CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG4殺鮭氣單胞菌探針Asal1TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG5嗜水氣單胞菌探針Ahyr1TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA6豚鼠氣單胞菌探針Acav1TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA7梭菌屬通用探針CloFp CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA8產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA9肉毒梭菌探針Cbot1GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC10鮰魚愛德華氏菌探針Eict1ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT11殺魚腸球菌探針Eserp1ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA12鏈球菌屬通用探針I(yè)IEser&Strp1TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC13嗜冷屈撓桿菌探針FleFpTAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG14柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC15柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC16多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG17多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC18殺魚巴斯德氏菌探針PpispCTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC19惡臭假單胞菌探針1Pputp1GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT20惡臭假單胞菌探針2Pputp2CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG21熒光假單胞菌探針1Pflup1GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT22熒光假單胞菌探針2Pflup2CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG23丁香組假單胞菌探針Psyrp2ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA24霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG25霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT26霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vcmap13GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG
27哈維弧菌探針1Vharp11CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG28哈維弧菌探針2Vharp12GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA29哈維弧菌探針3Vharp21TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA30創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG31創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp21TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG32副溶血弧菌探針Vparp21TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC33河流弗氏弧菌探針1Vflfup11TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT34河流弗氏弧菌探針2Vflfup12TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG35溶藻弧菌探針Vflfup21AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG36溶藻弧菌探針Valgp21AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT4.雜交和雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
PCR反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10mol/L 2μL序列三十六(引物) 10μmol/L 2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水 33.1μL總體積 50μLPCR方法中擴(kuò)增程序為1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃2min將濃度為1mmol/L的寡核苷酸探針溶液0.1μL點在帶有正電荷的尼龍膜上，在長波紫外燈下進(jìn)行交聯(lián)5-10分鐘。
其地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物與寡核苷酸探針雜交方法如下*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴(kuò)增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是該方法具有檢測準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的特點，可以快速、準(zhǔn)確的鑒定特異的目標(biāo)細(xì)菌。首先，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時間；而且DNA-DNA的雜交鑒定方法較生理生化的鑒定方法更為準(zhǔn)確，不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，這將填補(bǔ)使用DNA分子雜交的鑒定方法進(jìn)行水生動物疫病病原菌檢測的空白。


圖1微陣列的探針位置示意圖。
圖2實施例1某批次活魚的微陣列檢測檢出殺鮭氣單胞菌的結(jié)果。
圖3實施例2某批次活魚的微陣列檢測檢出嗜水氣單胞菌的結(jié)果。
圖4實施例3某批次活魚的微陣列檢測檢出豚鼠氣單胞菌的結(jié)果。
圖5實施例4某批次活魚的微陣列檢測檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌的結(jié)果。
圖6實施例5某批次活魚的微陣列檢測檢出肉毒梭菌的結(jié)果。
圖7實施例6某批次活魚的微陣列檢測檢出鮰魚愛德華氏菌的結(jié)果。
圖8實施例7某批次活魚的微陣列檢測檢出殺魚腸球菌的結(jié)果。
圖9實施例8某批次活魚的微陣列檢測檢出乙型溶血型鏈球菌的結(jié)果。
圖10實施例9某批次活魚的微陣列檢測檢出嗜冷屈撓桿菌的結(jié)果。
圖11實施例10某批次活魚的微陣列檢測檢出柱狀屈撓桿菌的結(jié)果。
圖12實施例11某批次活魚的微陣列檢測檢出多殺巴斯德氏菌的結(jié)果。
圖13實施例12某批次活魚的微陣列檢測檢出殺魚巴斯德氏菌的結(jié)果。
圖14實施例13某批次活魚的微陣列檢測檢出惡臭假單胞菌的結(jié)果。
圖15實施例14某批次活魚的微陣列檢測檢出熒光假單胞菌的結(jié)果。
圖16實施例15某批次活魚的微陣列檢測檢出霍亂弧菌的結(jié)果。
圖17實施例16某批次活魚的微陣列檢測檢出擬態(tài)弧菌的結(jié)果。
圖18實施例17某批次活魚的微陣列檢測檢出哈維弧菌的結(jié)果。
圖19實施例18某批次活魚的微陣列檢測檢出創(chuàng)傷弧菌的結(jié)果。
圖20實施例19某批次活魚的微陣列檢測檢出副溶血弧菌的結(jié)果。
圖21實施例20某批次活魚的微陣列檢測檢出河流弧菌的結(jié)果。
圖22實施例21某批次活魚的微陣列檢測檢出弗氏弧菌的結(jié)果。
圖23實施例22某批次活魚的微陣列檢測檢出溶藻弧菌的結(jié)果。
具體實施例方式
實施例1樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出殺鮭氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提取樣品魚鱗片下表皮、腎組織、肝組織、心臟各一克，勻漿后混合振蕩，取勻漿液1mL在冰浴中靜置5分鐘，然后在室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去上清液，加入100μL溶菌酶溶液，37℃保溫10分鐘，補(bǔ)加TE緩沖液500μl，振蕩混勻。加同體積Tris飽和酚pH值8.0，強(qiáng)烈振蕩，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，吸取上清液，重復(fù)酚抽提。吸取上清液，加入0.1倍體積的乙酸鈉(2mol/L)，混勻，再加等體積的冰乙醇，混勻后低溫靜置30分鐘，于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。棄去上清，加70％冰乙醇振蕩洗滌一次，室溫下12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清。加入50μLTE溶液，置-20℃保存。
2.PCR擴(kuò)增23S基因片段成分 濃度 加樣量PCR緩沖液 10倍 5μLMgCl220mmol/L 5μLTaq DNA聚合酶 5u/μL0.3μL引物1 10μmol/L 2μL引物2 10μmol/L 2μLdNTPs 每種 10mmol/L 0.3μLDIG-dNTPs DIG-dUTP 1mmol/L 0.3μLDNA樣品 2μL雙蒸水3 3.1μL總體積 50μLPCR方法中擴(kuò)增程序為1)95℃10min2)95℃30s3)55℃20s4)72℃30s5)回到第2)-4)步，重復(fù)5次6)95℃30s7)68℃30s8)回到第6)-7)步，重復(fù)25次9)72℃2min3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交*預(yù)雜交預(yù)雜交液先預(yù)熱到雜交溫度(50℃)，把點入寡核苷酸探針的尼龍膜放入塑料袋，加入預(yù)雜交液，封好口。預(yù)雜交30min，50℃。
*擴(kuò)增PCR產(chǎn)物熱變性DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物加熱到95℃，10min，迅速插入冰浴。
*地高辛標(biāo)記靶DNA分子與尼龍膜雜交把預(yù)雜交好的芯片裝入塑料袋，加入變性的DIG標(biāo)記的PCR產(chǎn)物10uL，再加入1mL雜交液，封好口。50℃，雜交1hr，溫和攪動。
4.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三(3氣單胞菌屬通用探針3AFp1)探針位點四(殺鮭氣單胞菌探針4)均深藍(lán)色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有殺鮭氣單胞菌，見圖2。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有殺鮭氣單胞菌。這說明殺鮭氣單胞菌寡核苷酸探針的陽性結(jié)果是有效的。
實施例2樣本某批次出口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出嗜水氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三(氣單胞菌屬通用探針AFp1)、探針位點五(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)均為深藍(lán)色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有嗜水氣單胞菌探針，見圖3。
2天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有嗜水氣單胞菌。這說明寡核苷酸探針位點三、探針位點五陽性結(jié)果是有效的。
實施例3樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出豚鼠氣單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三(氣單胞菌屬通用探針AFp1)、探針位點六(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)均深藍(lán)色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有豚鼠氣單胞菌，見圖4。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有豚鼠氣單胞菌。這說明寡核苷酸探針位點三、探針位點六的陽性結(jié)果是有效的。
實施例4樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出產(chǎn)氣莢膜梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點七(梭菌屬通用探針CloFp)、探針位點八(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)均深藍(lán)色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌，見圖5。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有產(chǎn)氣莢膜梭菌。這說明寡核苷酸探針位點七、探針位點八的陽性結(jié)果是有效的。
實施例5樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出肉毒梭菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點七(梭菌屬通用探針CloFp)、探針位點九(肉毒梭菌探針Cbot1)均深藍(lán)色點即為陽性雜交結(jié)果，表明樣品中含有肉毒梭菌，見圖6。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有肉毒梭菌。這說明寡核苷酸探針位點七、探針位點九的陽性結(jié)果是有效的。
實施例6樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出鮰魚愛德華氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十(鮰魚愛德華氏菌探針Eict1)表明樣品中含有肉毒梭菌，見圖7。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有鮰魚愛德華氏菌。這說明寡核苷酸探針位點十的陽性結(jié)果是有效的。
實施例7樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出殺魚腸球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十一(殺魚腸球菌探針Eserp1)表明樣品中含有殺魚腸球菌，見圖8。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有殺魚腸球菌。這說明寡核苷酸探針位點十一的陽性結(jié)果是有效的。
實施例8樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出乙型溶血型鏈球菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十二(鏈球菌屬通用探針I(yè)IEser&Strp1)表明樣品中含有鏈球菌，見圖9。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有鏈球菌。這說明寡核苷酸探針位點十二的陽性結(jié)果是有效的。
實施例9樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出嗜冷屈撓桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十三(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)表明樣品中含有嗜冷屈撓桿菌，見圖10。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含有嗜冷屈撓桿菌。這說明寡核苷酸探針位點十三的陽性結(jié)果是有效的。
實施例10樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出柱狀屈撓桿菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十四(柱狀屈撓桿菌探針1Fclup1)十五(柱狀屈撓桿菌探針2Fclup2)表明樣品中含有柱狀屈撓桿菌，見圖11。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含柱狀屈撓桿菌菌。這說明寡核苷酸探針位點十四，十五的陽性結(jié)果是有效的。
實施例11樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出多殺巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十六(多殺巴斯德氏菌探針1Pmulp1)探針位點十七(多殺巴斯德氏菌探針2Pmulp2)表明樣品中含有多殺巴斯德氏菌菌，見圖12。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含多殺巴斯德氏菌。這說明寡核苷酸探針位點十四的陽性結(jié)果是有效的。
實施例12樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出殺魚巴斯德氏菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十八(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)表明樣品中含有殺魚巴斯德氏菌，見圖13。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含殺魚巴斯德氏菌。這說明寡核苷酸探針位點十八的陽性結(jié)果是有效的。
實施例13樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出惡臭假單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點十九(惡臭假單胞菌探針1Pputpl)探針位點二十(惡臭假單胞菌探針2Pputp2)表明樣品中含有惡臭假單胞菌，見圖14。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含惡臭假單胞菌。這說明寡核苷酸探針位點十九，二十的陽性結(jié)果是有效的。
實施例14樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出熒光假單胞菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例1
2.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十一(熒光假單胞菌探針1Pflup1)二十二(熒光假單胞菌探針2Pflup2)表明樣品中含有熒光假單胞菌，見圖15。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含熒光假單胞菌菌。這說明寡核苷酸探針位點二十一，二十二的陽性結(jié)果是有效的。
實施例15樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出霍亂弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)探針位點二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)探針位點二十五(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vchmip13)表明樣品中含有霍亂弧菌，見圖16。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含霍亂弧菌。這說明寡核苷酸探針位點二十三，二十四，二十五的陽性結(jié)果是有效的。
實施例16樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出擬態(tài)弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1Vchmip11)探針位點二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2Vchmip12)探針位點二十五(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3Vchmip13)表明樣品中含有擬態(tài)弧菌，見圖17。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含擬態(tài)弧菌。這說明寡核苷酸探針位點二十三，二十四，二十五的陽性結(jié)果是有效的。
實施例17樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出哈維弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例1
3.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點二十七(哈維弧菌探針1Vharp11)探針位點二十八(哈維弧菌探針2Vharp12)探針位點二十九(哈維弧菌探針3Vharp13)表明樣品中含有擬態(tài)弧菌，見圖18。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含哈維弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，二十七，二十八，二十九的陽性結(jié)果是有效的。
實施例18樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出創(chuàng)傷弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十(創(chuàng)傷弧菌探針1Vvulp11)探針位點三十一(創(chuàng)傷弧菌探針2Vvulp 21)表明樣品中含有創(chuàng)傷弧菌，見圖19。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含創(chuàng)傷弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，三十，三十一的陽性結(jié)果是有效的。
實施例19樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出副溶血弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十二(副溶血弧菌探針Vparp 21)表明樣品中含有副溶血弧菌，見圖20。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中含副溶血弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，三十二的陽性結(jié)果是有效的。
實施例20樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出河流弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十三(河流弗氏弧菌探針1Vflfup11)探針位點三十四(河流弗氏弧菌探針2Vflfup12)表明樣品中含有河流弧菌，見圖21。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中河流弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，三十三，三十四的陽性結(jié)果是有效的。
實施例21樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出弗氏弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十三(河流弗氏弧菌探針1Vflfup11)探針位點三十四(河流弗氏弧菌探針2Vflfup12)表明樣品中含有弗氏弧菌，見圖22。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中弗氏弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，三十三，三十四的陽性結(jié)果是有效的。
實施例22樣本某批次進(jìn)口活魚。常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測出溶藻弧菌疑似菌落。
1.DNA抽提同實施例12.PCR擴(kuò)增23S基因片段同實施例13.靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物與尼龍膜上探針的雜交同實施例14.雜交陽性斑點的酶聯(lián)免疫顯色雜交斑點的酶聯(lián)免疫顯色按照Roche公司地高辛DNA標(biāo)記與檢測試劑盒說明進(jìn)行。
*結(jié)果判讀判讀雜交結(jié)果尼龍膜上探針位點三十五(溶藻弧菌探針Vflfup 21)探針位點三十六(溶藻弧菌探針Valgp21)表明樣品中含有溶藻弧菌，見圖23。
5天后，常規(guī)微生物培養(yǎng)經(jīng)使用生化檢測儀得出結(jié)論被測樣品中溶藻弧菌。這說明寡核苷酸探針位點，三十五，三十六的陽性結(jié)果是有效的。
SEQUENCE LISTING<110>南開大學(xué)<120>用23S核糖體基因探針陣列檢測水生動物病原菌的方法<130>20060716<160>36<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>21
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<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>32tctggaaagg accgcgaaac ag 22<210>33<211>22<212>DNA<213>溶藻弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(22)<400>33agccgacagc gcatgttcag tg 22<210>34<211>26<212>DNA<213>溶藻弧菌<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<400>34aactgacgac gcatattcag tgaaat 26
<210>35<211>23<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(23)<400>35gcgatttcyg aayggggraa ccc 23<210>36<211>22<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>primer_bind<222>(1)..(22)<400>36ttcgcctttc cctcacggta ct 2權(quán)利要求
1.一種用23S核糖體基因探針陣列檢測水生動物病原菌的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)設(shè)計特異性寡核苷酸探針，用于寡核苷酸微陣列檢測檢測，所設(shè)計的特異性寡核苷酸探針序列如下序列一(氣單胞菌屬通用探針AFp1)CTCAGTAGCGGCGAGCGAACG序列二(殺鮭氣單胞菌探針Asal1)TATCGTTACATGAATACATAGTGTAACGAG序列三(嗜水氣單胞菌探針Ahyr1)TAAGTGAATACATAGCTTAACGAGGCGA序列四(豚鼠氣單胞菌探針Acav1)TTACTGAATACATAGGTAATAGAGGCGA序列五(梭菌屬通用探針CloFp)CCAGAGTACCACGAGACACGTGAAA序列六(產(chǎn)氣莢膜梭菌探針Cper1)AAGTGGAGGCTATTGTAACTGAAGAGAA序列七(肉毒梭菌探針Cbot1)GAGAAATTATGGTTAACCGAACACAAC序列八(鲴魚愛德化氏菌探針Eict1)ACGAAGGTGCACAGCTGTGAGTT序列九(殺魚腸球菌探針Eserp1)ACTATGTTATGCATAGTATCCGTAAGTGAA序列十(鏈球菌屬通用探針Strp1)TATAGAAGAATTACCTGGGAAGGTAAGC序列十一(嗜冷屈撓桿菌探針FleFp)TAGCCCAAACCDAWGTTGTTACGG序列十二(柱狀屈撓桿菌探針1 Fclup1)ACTTTCCAGTAAATTCTAATTCTATCCGC序列十三(柱狀屈撓桿菌探針2 Fclup2)ATAAGTAATAGAAGATAACGATAGTGGTATCC序列十四(多殺巴斯德氏菌探針1 Pmulp1)AGTAAGTTTTAGCTAGCATATTAGAGGAATTG序列十五(多殺巴斯德氏菌探針2 Pmulp2)GTACTCGAAAGTATGTTAGTGGAACTAAGC序列十六(殺魚巴斯德氏菌探針Ppisp)CTTAAGCTAATCTTGCGTTAGGTGAAC序列十七(惡臭假單胞菌探針1 Pputp1)GACCAGCCCTTAAGTTGATTTGAGAT序列十八(惡臭假單胞菌探針2 Pputp2)CCGTACACGAAAATCTCTTGTCAATG序列十九(熒光假單胞菌探針1 Pflup1)GACTAGCCCTTAAGTGGCTTTGAGAT序列二十(熒光假單胞菌探針2 Pflup2)CCTGTACGCGAAAATCTCTTAGTCATG序列二十一(丁香組假單胞菌探針Psyrp2)ACGCGAAAATCCCTTTGCAATGAA序列二十二(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針1 Vchmip11)ACTCGGTGAAGTAGGTGAACAAGCTGG序列二十三(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針2 Vchmip12)GAAGTAGGTGAACAAGCTGGAAAGCT序列二十四(霍亂弧菌及擬態(tài)弧菌探針3 Vcmap13)GCTGGAAAGCTTGGCGATACAG序列二十五(哈維弧菌探針1 Vharp11)CTTTTTATGCGTCAGGTGAAACTTCTG序列二十六(哈維弧菌探針2 Vharp12)GTGAAACTTCTGGAAAGTTGTGCGATA序列二十七(哈維弧菌探針3 Vharp21)TAACCGGCAACGCATATAAAGTGAA序列二十八(創(chuàng)傷弧菌探針1 Vvulp11)AAGCTTTACATGTGTTAGACGAACGG序列二十九(創(chuàng)傷弧菌探針2 Vvulp 21)TTGTAGATGCATGTTCAGTGAAATCG序列三十(副溶血弧菌探針V.parp 21)TTGACGACGTGTGTTCAGTGAAATC序列三十一(河流弧菌及弗氏弧菌探針1 Vflfup11)TTTACATGCGTCAGGTGAAGGTTCT序列三十二(河流弧菌及弗氏弧菌探針2 Vflfup12)TCTGGAAAGGACCGCGAAACAG序列三十三(溶藻弧菌探針Vflfup 21)AGCCGACAGCGCATGTTCAGTG序列三十四(溶藻弧菌探針Valgp21)AACTGACGACGCATATTCAGTGAAAT(2)PCR擴(kuò)增待測樣品中全部原核微生物的23s rRNA基因內(nèi)的DNA片段，同時進(jìn)行地高辛標(biāo)記；(3)將寡核苷酸微陣列和地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行分子雜交；(4)雜交結(jié)果通過酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)顯色；(5)顯色結(jié)果用肉眼觀察，可發(fā)現(xiàn)進(jìn)行雜交的特異性探針位點顯色。
2.運用23S核糖體基因探針陣列檢測多種水生動物病原菌的方法在檢測水生動物病原菌方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用23S核糖體基因探針陣列檢驗多種能夠?qū)е滤鷦游飩魅静〔≡姆椒?，其技術(shù)原理為分子雜交——酶聯(lián)免疫顯色技術(shù)，屬于細(xì)菌檢測技術(shù)，其技術(shù)方案是用生物信息學(xué)方法設(shè)計特異性探針，包括設(shè)計篩選的34條用作探針的寡核苷酸序列以及與之配套的PCR和雜交反應(yīng)條件。通過PCR擴(kuò)增并用地高辛標(biāo)記細(xì)菌23srRNA基因內(nèi)部分序列，并用該PCR產(chǎn)物和一組特異性的寡核苷酸探針雜交，經(jīng)酶聯(lián)免疫顯色顯色后，可以從待測樣品中，精確檢測出是否存在水生動物傳染病病原菌。該方法的優(yōu)點是，省去了重復(fù)的細(xì)菌培養(yǎng)篩選環(huán)節(jié)，節(jié)約時間；分子雜交鑒定方法不受培養(yǎng)條件和細(xì)菌生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。
文檔編號G01N21/77GK1877328SQ20061001476
公開日2006年12月13日 申請日期2006年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者黃熙泰, 侯艷梅, 劉寅, 張立懷, 鄭澤軍, 高旗利, 周浩, 董志珍, 李永君, 王玉玲, 魏曉娜, 霍蕾 申請人:南開大學(xué), 中華人民共和國天津出入境檢驗檢疫局