專利名稱：用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針及其制備方法，屬于納米
科技領(lǐng)域與食品安全、生物技術(shù)應(yīng)用等領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核糖體失活蛋白(Ribosome-inactivating Protein, RIP)存在于許多植物中，植 物核糖體失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病蟲害或者惡劣的環(huán)境。根據(jù)核糖體 失活蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，RIP可以分成以下兩種1型，即由一條多肽鏈組成；11型，即雙鏈蛋 白，由兩條肽鏈組成。在雙鏈蛋白中，其中一條是A(active)鏈，具有N_糖苷酶活性；另一 條是B(binding)鏈，為對(duì)半乳糖特異的凝集素，這兩條多肽鏈通過二硫鍵和其它的非共價(jià) 鍵連接。 目前常用的檢測(cè)核糖體失活蛋白的方法主要為免疫分析法和生物質(zhì)譜法。免疫 分析法可以應(yīng)用于測(cè)定各種抗原、半抗原或抗體，具有很高的選擇性和很低的檢出限，主要 分為非放射免疫法和放射免疫法兩種。其中，非放射免疫法又包括熒光免疫法、發(fā)光免疫 法、酶免疫法及電化學(xué)免疫法等。酶聯(lián)免疫分析法，是基于抗體與抗原或半抗原之間的高 選擇性反應(yīng)而建立起來(lái)的一種生物化學(xué)分析法。另一種常用的方法是生物質(zhì)譜法，基質(zhì)輔 助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization，亂DI)所產(chǎn) 生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，且質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。 MALDI-TOF(基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜)質(zhì)譜非常適合于蛋白、多肽、核酸及多 糖等生物大分子的研究。生物質(zhì)譜法需要使用昂貴的基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜或電噴霧 質(zhì)譜，目前普及還較困難；而免疫分析法具有操作方便、便于檢測(cè)生物樣品等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣 泛。 脫嘌呤分析法經(jīng)常也被用來(lái)分析檢測(cè)新的核糖體失活蛋白，檢測(cè)由酸性苯胺催化 在核糖體失活蛋白脫嘌呤位點(diǎn)斷裂產(chǎn)生的核糖體rRNA片段，但核糖體失活蛋白脫嘌呤分 析法的靈敏度取決于核糖體失活蛋白催化核糖體脫嘌呤反應(yīng)的速度常數(shù)，核糖體失活蛋白 脫嘌呤分析法可能出現(xiàn)較高的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。 納米顆粒被廣泛應(yīng)用于蛋白、酶的固定、信號(hào)的檢測(cè)和放大、待測(cè)物的富集和濃 縮。由于納米結(jié)構(gòu)有著優(yōu)異的化學(xué)和物理性能，有著極高的比表面，有利于提高目標(biāo)分子的 吸附能力，并能提高反應(yīng)的速度，因此被廣泛用于納米顆粒探針表面吸附層的制作。納米顆 粒探針的化學(xué)和物理性質(zhì)及其對(duì)生物分子或細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度大幅提高，檢測(cè)的反應(yīng)時(shí)間 也得以縮短，且能實(shí)現(xiàn)高通量的實(shí)時(shí)檢測(cè)分析。 Nam [Nature Protocols, 2007， 2 (6) :1438-1444等報(bào)道了一種基于磁性納米顆 粒的生物條碼(Bio-Bar-Code)方法來(lái)檢驗(yàn)DNA (脫氧核糖核酸)。他們首先將磁性納米顆 粒表面修飾上單克隆抗體并雜交上目標(biāo)DNA，將金納米顆粒修飾上DNA和多克隆抗體，其中 金納米顆粒表面修飾的DNA標(biāo)記物含量要遠(yuǎn)高于多克隆抗體含量，將兩種顆?；旌希?抗體和前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen, PSA)的特異性識(shí)別作用，將金納米顆粒富集到磁性納米顆粒表面，通過磁分離并用二硫蘇糖醇去雜交化分離得到DNA標(biāo)記 物，進(jìn)一步利用金標(biāo)銀染技術(shù)對(duì)信號(hào)量的放大，最后對(duì)DNA標(biāo)記物進(jìn)行定量檢測(cè)，也可實(shí)現(xiàn) 對(duì)目標(biāo)蛋白PSA的檢測(cè)。 FanAnal Chem. ， 2005， 77 (10) :3238 324等固定原始抗體在磁珠上，固定目 標(biāo)抗體在金上，分別處理后兩者結(jié)合使Au變?yōu)锳u3+離子，在發(fā)光胺處理后發(fā)光，從而運(yùn)用化 學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定方法測(cè)定人類免疫血球蛋白G，利用這一方法也可直接制造出測(cè)定人類免 疫血球蛋白G的納米探針。 美國(guó)力口州大學(xué)Angewandte Chemie International Edition, 2008， 47 (35)， 6661-6665利用了一段具有放射性的RNA(核糖核酸)寡鏈，與核糖體中去嘌呤化的莖環(huán)結(jié) 構(gòu)互補(bǔ)配對(duì)，配對(duì)后的結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的熒光效應(yīng)。毒素介導(dǎo)的去嘌呤化過程就被轉(zhuǎn)化為熒 光增強(qiáng)的信號(hào)，可有效的檢測(cè)毒素的酶活性，該檢測(cè)方法也可應(yīng)用于毒素的抑制劑和抗體 研究。 楊運(yùn)云等分析化學(xué)，2007,35(3)， 439-442建立了蓖麻毒素的多抗_毒素_單抗 雙夾心ELISA檢測(cè)(酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定)技術(shù)，將多抗對(duì)抗原的高富集能力與單抗的 高選擇性結(jié)合起來(lái)，以提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的首要問題就是傳統(tǒng)的核糖體失活蛋白檢測(cè)方法靈敏度低、步驟繁
冗的問題。本發(fā)明通過研制核糖體失活蛋白的納米顆粒探針，將納米顆粒大比表面積的高 富集能力與單抗對(duì)抗原的高選擇性結(jié)合起來(lái)，以提高檢測(cè)核糖體失活蛋白的靈敏度和特異 性。
本發(fā)明之一的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針采用如下技術(shù)方案
—種用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針，包括基體納米顆粒和核糖體失活 蛋白抗體，其特征在于 ①采用具有生物親和效應(yīng)的納米顆粒作為基體納米顆粒，經(jīng)表面修飾后能夠與目 標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合，并排除物理吸附的干擾； ②采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特
異性作用力，用于對(duì)目標(biāo)核糖體失活蛋白的偶聯(lián)及檢測(cè)。 其中， 所述的基體納米顆粒，包括聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆?；蚣{米金顆粒；
所述的基體納米顆粒為顆粒均勻的單分散納米顆粒；所述的基體納米顆粒經(jīng)聚氧 乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑(即F108-PDS)進(jìn)行過表面修飾。
所述的捕捉抗體即鼠抗人免疫球蛋白免疫球蛋白IgG單克隆抗體分子量在 25-35kDa之間； 所述的捕捉抗體即鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體經(jīng)3-(2-吡啶二巰基)丙酸 n-羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行過位點(diǎn)化學(xué)修飾； 所述的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體通過抗原_抗體的特異性作用力，能夠 作為捕捉抗體作用于偶聯(lián)目標(biāo)核糖體失活蛋白分子。
所述的納米顆粒探針可以通過下述步驟制得
①用聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑對(duì)基體納米顆粒進(jìn)行表面 修飾； ②用3-(2_吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯對(duì)鼠抗人免疫球蛋白IgG單 克隆抗體進(jìn)行位點(diǎn)化學(xué)修飾； ③將經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)修飾后的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體與經(jīng)表面修飾后的 基體納米顆粒，通過恒溫反應(yīng)制得納米顆粒探針懸浮液粗品； ④采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，分離出 基體納米顆粒基體，得到具有特異性的納米顆粒探針，即偶聯(lián)了抗體且能夠用于目標(biāo)蛋白 檢測(cè)的納米顆粒探針。 本發(fā)明之二的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法是 本發(fā)明的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法包括如下步驟 ①基體納米顆粒表面修飾利用表面修飾劑對(duì)選自聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠
顆?；蛘呒{米金的基體納米顆粒表面進(jìn)行修飾，減少表面非特異性物理吸附； ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)的化學(xué)修飾加入3-(2_吡啶二巰基)
丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯至鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體中進(jìn)行位點(diǎn)的化學(xué)修飾； ③納米顆粒探針懸浮液粗品的制備將步驟①經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒與步
驟②經(jīng)位點(diǎn)化學(xué)修飾后的免疫球蛋白IgG單克隆抗體進(jìn)行恒溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20-50°C，
pH值至7. 0-8. 5之間，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-5h，即得到納米顆粒探針懸浮液粗品； ④納米顆粒探針的分離將步驟③得到的恒溫反應(yīng)產(chǎn)物采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，
在離心力場(chǎng)的作用下，采用含有濃度0. 01-5%的FL-70表面活性劑作為流動(dòng)相，根據(jù)顆粒
尺寸、質(zhì)量的差異，從納米顆粒探針懸浮液粗品中分離出沒有完成反應(yīng)的反應(yīng)原料或基體
納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品。 在具體實(shí)施中， 所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯 嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L ; 所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾劑 3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0. 01-5g/L，pH值為7. 0_8. 5 ;在鼠 抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團(tuán)，然后利用特異性分離純化 柱分離除去過量的修飾劑； 所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，利用濃度為 0. 01-5%的FL-70表面活性劑的流動(dòng)相，在離心力場(chǎng)500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探 針懸浮液粗品中分離出過剩的反應(yīng)原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆 粒探針產(chǎn)品。 本發(fā)明之三的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的用途是 本發(fā)明的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針可以應(yīng)用于痕量目標(biāo)核糖體
失活蛋白的檢測(cè)；如應(yīng)用于痕量目標(biāo)蓖麻毒蛋白的檢測(cè)。 本發(fā)明是綜合利用納米技術(shù)、免疫技術(shù)，應(yīng)用于食品安全、生物反恐等領(lǐng)域中目標(biāo)
核糖體失活蛋白分子的檢測(cè)，具有快速便攜、特異、痕量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。 ①本發(fā)明首次建立了利用納米技術(shù)應(yīng)用核糖體失活蛋白分子痕量檢測(cè)的方法。
②本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測(cè)方法，如脫嘌 呤分析法相比，具有操作程序簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，便于推廣應(yīng)用，能以如納米探針試紙、納米 磁珠等多種形式應(yīng)用于核糖體失活蛋白現(xiàn)場(chǎng)陽(yáng)性樣品的快速篩查。 ③本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測(cè)方法，如脫嘌 呤分析法相比，利用了抗原抗體的特異性結(jié)合特點(diǎn)，具有特異性高的優(yōu)點(diǎn)，研制出的納米課 題探針只對(duì)目標(biāo)核糖體失活蛋白分子響應(yīng)，能夠規(guī)避其它分子的干擾，解決了同類產(chǎn)品中 特異性不高的問題。 ④本發(fā)明研制出的納米顆粒探針與核糖體失活蛋白的其它常規(guī)檢測(cè)方法，如脫嘌
呤分析法相比，本發(fā)明利用了納米顆粒的表面效應(yīng)，即使樣品中痕量的目標(biāo)分子也可以經(jīng)
過納米顆粒的表面富集起來(lái)，可有效實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)的目標(biāo)，檢測(cè)下限可達(dá)1. 0 ii g/L。 ⑤本發(fā)明為研制核糖體失活蛋白納米探針奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
本發(fā)明為其它類似痕量目標(biāo)蛋白的檢測(cè)，起到了良好的借鑒作用。 綜上所述，本發(fā)明研制的納米顆粒探針具有高靈敏度、特異性、操作簡(jiǎn)便，研制工
藝簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，解決了目前核糖體失活蛋白檢測(cè)技術(shù)中的局限。


圖1本發(fā)明原理示意圖， 其中，l :核糖體失活蛋白(RIP) ;2 :鼠抗人免疫球蛋白(IgG) ;3 :聚氧乙烯-聚氧
丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(F108-PDS) ;4 :聚苯乙烯基體納米顆粒(PS bar印article)
圖2沉降場(chǎng)流分離技術(shù)流程圖， 其中，l :泵(Pump) ;2 :進(jìn)樣(Injection) ;3 :通道(Channel) ;4 :檢領(lǐng)lj器 (Detector) 圖3典型納米顆粒探針分離譜圖。 其中，F(xiàn)108表示聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物；IgG表示鼠抗人免疫 球蛋白；RIP表示核糖體失活蛋白。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要內(nèi)容 ①基體納米顆粒表面修飾技術(shù) 按比例分別稱取一定體積的修飾劑F108-PDS(0. 01-10g/L)加入到基體納米顆粒 懸浮液中，室溫下振蕩后使顆粒表面物理吸附足夠量的修飾劑，再在一定條件下離心分離 沒有結(jié)合或結(jié)合不緊密的修飾劑，棄去上清液后用磷酸緩沖液重新稀釋納米顆粒。
②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾 利用的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(濃度為0. 01_5g/L)，對(duì)抗 體活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，按兩者比例(0. 1-1.5)分別稱取一定體積(1-20 PL)的修飾劑加入 到抗體溶液中。在20-5(TC溫度下反應(yīng)后，利用特異性色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及一 些小分子反應(yīng)。 ③納米顆粒探針的制備 將經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)修飾后的抗體與經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒恒溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20-50°C，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-5h，pH值至7. 0_8. 5之間，即得到具有特異性的納米顆粒探針。
④納米顆粒探針的分離 采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，可分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，采用含 有FL-70表面活性劑的流動(dòng)相，在離心力場(chǎng)等外場(chǎng)的作用下，根據(jù)顆粒尺寸、質(zhì)量等差異， 不同粒徑的納米顆粒在通道厚度內(nèi)呈一定的分布，在通道壁附近的流體會(huì)比在中心處流得 慢；不同粒徑的納米顆粒在通道中的流速差別會(huì)導(dǎo)致其相應(yīng)的保留時(shí)間較大的差異，從而 實(shí)現(xiàn)基體納米顆粒與偶聯(lián)抗體的納米顆粒探針的分離。 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒 探針及其制備過程。 ①利用修飾劑F108-PDS對(duì)聚苯乙烯表面進(jìn)行修飾
(1)配制F108-PDS溶液，濃度為0. 01-lOg/L ; (2)配制濃度為1-10% (w/v)、粒徑為20-1000nm的聚苯乙烯納米顆?；w懸浮 液； (3)稱取5-20 ii L的F108-PDS溶液加入到基體納米顆粒懸浮液中，反應(yīng)后使基體 納米顆粒表面偶聯(lián)； (4)離心分離沒有結(jié)合或結(jié)合不緊密的F108-PDS溶液； (5)棄去上清液后用1. 0-5. OmL磷酸緩沖液(pH = 7. 4)重新稀釋。 ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾 (1)配制濃度為0. 01-5g/L的3-(2_吡啶二巰基)丙酸n_羥基琥珀酰亞胺酯溶 液； (2)配制鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體溶液，濃度為0. 2-2. 5mg/mL ; (3)稱取l-20yL的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n_羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入到抗
體溶液中，在20-5(TC溫度下反應(yīng)； (4)利用NAP色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及一些小分子。
③納米顆粒探針的制備 (1)將經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)修飾后的抗體加入經(jīng)表面修飾后的納米顆粒，渦旋混合；
(2)在20-5(TC溫度下恒溫反應(yīng)0. 5-5h， pH值至7. 0_8. 5之間；
(3)離心分離沒有結(jié)合或結(jié)合不緊密的反應(yīng)溶液； (4)棄去上清液后用1. 0-5. OmL磷酸緩沖液(pH = 7. 4)重新稀釋，即得到具有特
異性的納米顆粒探針。 ④納米顆粒探針的分離 ①配制濃度為0. 01-5%的FL-70表面活性劑的流動(dòng)相； ②開啟流動(dòng)相泵，調(diào)節(jié)流量至0. 5-2. 5mL/min，打開檢測(cè)器，調(diào)節(jié)檢測(cè)波長(zhǎng)至 200-300nm ; ③用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣5-50 ii L ;
④開啟沉降場(chǎng)流分離儀； ⑤在設(shè)定波長(zhǎng)下，收集整個(gè)峰的流出液，實(shí)現(xiàn)納米顆粒探針與納米顆?；w的分 離。 實(shí)施例1
用于蓖麻毒蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針及其制備 ①利用修飾劑F108-PDS對(duì)聚苯乙烯基體納米顆粒進(jìn)行表面修飾 按比例分別稱取一定體積的修飾劑F108-PDS(0. 01_10g/L)加入到粒徑為290nm
的聚苯乙烯納米顆粒懸浮液中，室溫下振蕩足夠時(shí)間后使顆粒表面物理吸附足夠量的修飾
劑，再在一定條件下離心分離沒有結(jié)合或結(jié)合不緊密的修飾劑，棄去上清液后用磷酸緩沖
液重新稀釋納米顆粒。 ②鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾 利用的3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(濃度為0. 01_5g/L)，對(duì)抗 體活性位點(diǎn)進(jìn)行修飾，按兩者比例(0. 1-1.5)分別稱取一定體積(1-20 PL)的修飾劑加入 到抗體溶液中。在20-5(TC溫度下反應(yīng)后，利用特異性色譜柱柱分離除去過量的修飾劑及 一些小分子反應(yīng)。加入二硫蘇糖醇(DTT)通過雙硫鍵將兩個(gè)蛋白連接在一起，其決定了連 接后的蛋白復(fù)合體具有很大的不穩(wěn)定性。DTT的用途之一是作為巰基化DNA的還原劑和去 保護(hù)劑。巰基化DNA末端硫原子在溶液中趨向于形成二聚體，特別是在氧氣存在的情況下。 這種二聚化大大降低了一些偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。
③納米顆粒探針的制備 將經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)修飾后的抗體與經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒恒溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度 為20-5(TC，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-5h，pH值至7. 0_8. 5之間，即得到具有特異性的納米顆粒探針。
④納米顆粒探針的分離 采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，可分離流體中范圍為20nm-lym的懸浮物顆粒，采用含
有FL-70表面活性劑的流動(dòng)相，在離心力場(chǎng)的作用下，根據(jù)顆粒尺寸、質(zhì)量等差異，不同粒
徑的納米顆粒在通道厚度內(nèi)呈一定的分布，在通道壁附近的流體會(huì)比在中心處流得慢；不
同粒徑的納米顆粒在通道中的流速差別會(huì)導(dǎo)致其相應(yīng)的保留時(shí)間較大的差異，能夠?qū)崿F(xiàn)基
體納米顆粒與偶聯(lián)抗體的納米顆粒探針的分離，得到具有特異性的納米探針顆粒。 ⑤蓖麻毒蛋白的檢測(cè) 配制一系列濃度(0. 5-10. 0 ii g/L)的水樣、土壤、奶粉和血液蓖麻毒素加標(biāo)樣品， 用研制的測(cè)定蓖麻毒蛋白的納米顆粒探針測(cè)定樣品，結(jié)果均為陽(yáng)性；未受污染的水樣、土 壤、奶粉和血液均未能檢出蓖麻毒素，顯示為陰性。
對(duì)比例 實(shí)驗(yàn)對(duì)比了脫嘌呤分析法測(cè)定蓖麻毒蛋白，該方法出現(xiàn)較高的假陰性和假陽(yáng)性結(jié) 果。實(shí)驗(yàn)表明現(xiàn)有的脫嘌呤分析法過程復(fù)雜，為了使核糖體底物產(chǎn)生的核糖體核糖核酸的 片段譜帶成像顯現(xiàn)出來(lái)，需要首先將核糖體核糖核酸用含核糖體失活蛋白的樣品進(jìn)行脫嘌 呤反應(yīng)，然后經(jīng)過兩次萃取，兩次沉淀和干燥，兩次再溶解，最后用苯胺化學(xué)裂解，且每一步 萃取，干燥，溶解和化學(xué)裂解的產(chǎn)率都可能很低。
權(quán)利要求
一種用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針，包括基體納米顆粒和核糖體失活蛋白抗體，其特征在于①采用具有生物親和效應(yīng)的納米顆粒作為基體納米顆粒，經(jīng)表面修飾后能夠與目標(biāo)蛋白抗體特異性結(jié)合，并排除物理吸附的干擾；②采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特異性作用力，用于對(duì)目標(biāo)核糖體失活蛋白的偶聯(lián)及檢測(cè)。
2. 如權(quán)利要求1所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的探針，其特征在于① 所述的基體納米顆粒，包括聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆粒或納米金顆粒；② 所述的基體納米顆粒為顆粒均勻的單分散納米顆粒；③ 所述的基體納米顆粒經(jīng)聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑進(jìn)行過表 面修飾。
3. 如權(quán)利要求1所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的探針，其特征在于① 所述的捕捉抗體分子量在25-35kDa之間；② 所述的捕捉抗體經(jīng)3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行過位點(diǎn)化學(xué) 修飾。
4. 如權(quán)利要求1 3之一所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針，其特征在 于，所述的納米顆粒探針通過下述步驟制得① 用聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物修飾劑對(duì)基體納米顆粒進(jìn)行表面修飾；② 用3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯對(duì)鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆 抗體進(jìn)行位點(diǎn)化學(xué)修飾；③ 將經(jīng)結(jié)合位點(diǎn)修飾后的鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體與經(jīng)表面修飾后的基體 納米顆粒，通過恒溫反應(yīng)制得納米顆粒探針懸浮液粗品；④ 采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，分離流體中范圍為20nm-l ii m的懸浮物顆粒，分離出基體 納米顆?；w，得到具有特異性的納米顆粒探針，即偶聯(lián)了抗體且能夠用于目標(biāo)蛋白檢測(cè) 的納米顆粒探針。
5. —種如權(quán)利要求1 4之一的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方 法，包括如下步驟① 基體納米顆粒表面修飾利用表面修飾劑對(duì)選自聚苯乙烯納米顆粒、納米磁珠顆粒 或者納米金的基體納米顆粒表面進(jìn)行修飾，減少表面非特異性物理吸附；② 鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)的化學(xué)修飾加入3-(2_吡啶二巰基)丙酸 n-羥基琥珀酰亞胺酯至鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體中進(jìn)行位點(diǎn)的化學(xué)修飾；③ 納米顆粒探針懸浮液粗品的制備將步驟①經(jīng)表面修飾后的基體納米顆粒與步驟②經(jīng)位點(diǎn)化學(xué)修飾后的免疫球蛋白IgG單克隆抗體進(jìn)行恒溫反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20-5(TC，pH值 至7. 0-8. 5之間，反應(yīng)時(shí)間為0. 5-5h，即得到納米顆粒探針懸浮液粗品；④ 納米顆粒探針的分離將步驟③得到的恒溫反應(yīng)產(chǎn)物采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，在離心力場(chǎng)的作用下，采用含有濃度0. 01-5%的FL-70表面活性劑作為流動(dòng)相，根據(jù)顆粒尺寸、 質(zhì)量的差異，從納米顆粒探針懸浮液粗品中分離出沒有完成反應(yīng)的反應(yīng)原料或基體納米顆 粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品。
6. 如權(quán)利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法，其特征在于所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L。
7. 如權(quán)利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法，其特征 在于所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修 飾，修飾劑3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0.01-5g/L， pH值為 7. 0-8.5 ;在鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團(tuán)，然后利用特 異性分離純化柱分離除去過量的修飾劑。
8. 如權(quán)利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法，其特征 在于所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，含有濃度為0. 01-5%的 FL-70表面活性劑的流動(dòng)相，在離心力場(chǎng)500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探針懸浮液 粗品中分離出過剩的反應(yīng)原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品
9. 如權(quán)利要求5所述的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針的制備方法，其特征在于所述的步驟①中，基體納米顆粒的表面修飾劑為聚氧乙烯_聚氧丙烯_聚氧乙烯嵌段共聚物，修飾劑的濃度為0. 01-10g/L ;所述的步驟②中，鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾劑 3-(2-吡啶二巰基)丙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的濃度為0. 01-5g/L，pH值為7. 0_8. 5 ;在鼠 抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體蛋白上引入吡啶二硫化物基團(tuán)，然后利用特異性分離純化 柱分離除去過量的修飾劑；所述步驟④的納米顆粒探針的分離采用沉降場(chǎng)流分離技術(shù)，利用濃度為0. 01-5%的 FL-70表面活性劑的流動(dòng)相，在離心力場(chǎng)500-3000rpm的作用下，從納米顆粒探針懸浮液 粗品中分離出過剩的反應(yīng)原料或基體納米顆粒，得到偶聯(lián)有特異性抗體的納米顆粒探針產(chǎn)品
10. —種如權(quán)利要求1 4之一的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針在痕量目 標(biāo)核糖體失活蛋白的檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為一種用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針及其制法和用途。本發(fā)明采用具有生物親和效應(yīng)的納米顆粒作為基體，經(jīng)表面修飾后能夠與目標(biāo)蛋白抗體結(jié)合，并排除物理吸附的干擾；同時(shí)采用鼠抗人免疫球蛋白IgG單克隆抗體作為捕捉抗體，通過抗體-抗原間的特異性作用力，用于對(duì)目標(biāo)核糖體失活蛋白偶聯(lián)。本發(fā)明涉及的用于核糖體失活蛋白檢測(cè)的納米顆粒探針將納米顆粒大比表面積的高富集能力與單抗對(duì)抗原的高選擇性結(jié)合起來(lái)，大大提高了檢測(cè)核糖體失活蛋白的靈敏度和特異性。本發(fā)明是綜合利用納米技術(shù)、免疫技術(shù)，應(yīng)用于食品安全、生物反恐等領(lǐng)域中目標(biāo)核糖體失活蛋白分子的檢測(cè)。具有快速便攜、特異、痕量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101738480SQ20091017672
公開日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2009年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月18日
發(fā)明者全燦, 劉軍, 李紅梅 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院