一種二肽基肽酶iv的熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用，該熒光探針底物具有如下式的結(jié)構(gòu)式： 合成方法以下6-氨基-2-萘甲酸為原料合成。采用所述的二肽基肽酶IV的熒光探針底物，與含二肽基肽酶IV的生物樣品混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除率或其去二肽基產(chǎn)物的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性。本發(fā)明的探針底物作為特異性的DPP-IV單酶的熒光探針底物，該化合物可以用來檢測DPP-IV的活性。
【專利說明】
一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用，特別涉及一種二肽基肽酶IV的 熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用，屬于化學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 二肽基肽酶-IV(DPP-IV，CD26, EC 3.4.14.5)是以二聚體形式存在的11型跨膜 絲氨酸蛋白酶，廣泛分布于哺乳動物臟器的上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，其中在腎臟中表達(dá) 最高，也能以溶解形式存在于體液中。作為重要的I相代謝酶，DPP-IV能特異性地催化多肽 鏈N末端第2位的氨基酸殘基脯氨酸(Pro)或丙氨酸(Ala)肽鍵水解斷裂，從而參與體內(nèi)多 種生物活性多肽的激活、部分或完全失活，如腸促胰島素、神經(jīng)肽、胃泌素釋放肽、生長激素 釋放激素等。DPP-IV也在糖代謝過程中扮演重要角色，已經(jīng)成為了治療2型糖尿病新靶點(diǎn)， 同時也被FDA批準(zhǔn)為重要的藥物作用靶點(diǎn)。另外它還是細(xì)胞膜受體和共刺激分子，從而參與 機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞移行、細(xì)胞黏附和細(xì)胞調(diào)亡過程，故與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相 關(guān)。研究表明，DPP-IV在一些腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如結(jié)腸癌、原發(fā)性肺癌、前列腺癌、卵巢癌 等，利用DPP-IV代謝活化機(jī)制，以DPP-IV為潛在靶點(diǎn)，可以設(shè)計靶向性的抗癌前藥。臨床研 究表明許多疾病如口腔癌、結(jié)腸癌、肺癌、腎病、肝病等會引起患者血液或尿液DPP-IV含量 顯著改變，使血液或尿液中的DPP-IV可作為這些疾病診斷的標(biāo)志物。因此，開發(fā)DPP-IV檢測 方法具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，特別是血液、尿液中DPP-IV活性檢測對疾病的早期診斷，活 細(xì)胞和活組織層面開展DPP-IV實(shí)時定量檢測和功能成像，高效篩選DPP-IV抑制劑作為糖尿 病治療的候選藥物，及DPP-IV功能異常與疾病發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系等研究等。無論是疾病的 診斷和治療，還是對疾病發(fā)病機(jī)理的研究，都必須要借助于精準(zhǔn)高效的檢測手段。傳統(tǒng)的代 謝酶的定量評估技術(shù)主要有以下三種：1)基于抗體的Elisa或Western檢測技術(shù);2)借助LC-MS/MS技術(shù)對目標(biāo)酶特異性肽段進(jìn)行分析及定量的蛋白組學(xué)技術(shù);3)借助特異性探針分子 的目標(biāo)酶活性定量評估技術(shù)。與傳統(tǒng)代謝酶的定量評估技術(shù)相比，熒光探針檢測具有以下 突出優(yōu)勢：1)操作簡單、易高通量;2)高靈敏度、樣品需求量小，檢測靈敏度可達(dá)皮摩爾級； 3)熒光成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對活細(xì)胞或組織水平的精確定位及實(shí)時動態(tài)檢測;4)借助熒光探 針分子可實(shí)現(xiàn)亞毫秒時間和亞納米空間的高分辨率檢測。因此，開發(fā)實(shí)用的DPP-IV熒光探 針檢測具有重要的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物及制備方法及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明所提供的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物，所述的熒光探針底物具有如 下式!.的結(jié)構(gòu)式：
R為甲基或乙基或丙基或丁基。
[0005] 本發(fā)明所提供的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的制備方法，包括以下步驟： (1) 以下式職?所示的6-氨基-2-萘甲酸為起始原料，經(jīng)過酸催化酯化反應(yīng)合成下式III: 所示的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物，反應(yīng)式如下：
(2) 采用式II；!所示的1當(dāng)量的6-氨基-2-萘甲酸酯類化合物在0.5-2當(dāng)量的N-羥基苯并 三氮唑、0.5-2當(dāng)量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、1-3當(dāng)量的2-(7_偶 氮苯并三氮唑）_N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯存在下，與1-3當(dāng)量的叔丁氧羰基甘氨酸 基脯氨酸，在20_30°C攪拌反應(yīng)24-48小時，生產(chǎn)式B所示的產(chǎn)物，反應(yīng)式如下：
(3 )將步驟(2 )生成的產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，再經(jīng)三氟乙酸酸催化，20-30 °C攪拌反應(yīng)4-10 小時脫除叔丁氧羰基生成式I所示的二肽基肽酶IV的熒光探針底物;反應(yīng)式如下：
上述各反應(yīng)式中，R為甲基或乙基或丙基或丁基。
[0006] 本發(fā)明的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的應(yīng)用，所述的探針底物具有式I所 述的結(jié)構(gòu)式，采用式I所示的化合物作為二肽基肽酶IV的熒光探針底物，與含二肽基肽酶IV 的生物樣品混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除率或其去二肽基產(chǎn) 物的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性。
[0007] 本發(fā)明的一種二肽基肽酶IV的熒光探針底物的應(yīng)用，所述的探針底物具有式I所 述的結(jié)構(gòu)式，所述的探針底物可用于DPP-IV抑制劑或誘導(dǎo)劑的快速篩選;或DPP-IV抑制及 誘導(dǎo)能力的定量評估， 進(jìn)一步的，上述應(yīng)用中具體的測定方法如下： A探針底物濃度為1/10~10 Km，Km為酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時所對應(yīng)的 底物濃度； B以PBS緩沖液作為DPP-IV孵育體系，孵育體系pH值介于5.5~10.5之間，孵育溫度在20 ~60°C之間，在該體系中加入步驟A濃度的探針底物進(jìn)行反應(yīng)； C. 反應(yīng)時間為5~120分鐘，確保以上底物相應(yīng)的N-去二肽基化產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物 轉(zhuǎn)化率不超過20%時終止反應(yīng)； D. 測定單位時間內(nèi)底物減少量或N-去二肽基化產(chǎn)物生成量作為DPP-IV活性的評價指 標(biāo)； 進(jìn)一步的，步驟B中孵育溫度為37 °C，孵育體系pH值為7.4。
[0008] 本發(fā)明的積極有益技術(shù)效果在于:本發(fā)明的探針底物作為特異性的DPP-IV單酶的 熒光探針底物，該化合物可以用來檢測DPP-IV的活性，尤其適合用于對細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、哺 乳動物細(xì)胞以及酵母菌克隆表達(dá)體系生產(chǎn)的DPP-IV的酶活測定，以及多種哺乳動物組織器 官來源的微粒體、S-9等制備物中DPP-IV的活性標(biāo)定。選用本發(fā)明的探針底物及測定方法檢 測DPP-IV單酶體外活性具有以下突出優(yōu)勢： (1) 特異性:該探針底物可被DPP-IV高特異性地代謝成一個代謝產(chǎn)物，即N-去二肽化 產(chǎn)物； (2) 廉價易得:GP-ANC可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡單易行； (3) 易高通量檢測:可在實(shí)驗(yàn)室常見各類熒光酶標(biāo)儀及臨床大生化儀上測定，可利用 96或386微孔板進(jìn)行批量檢測。
【附圖說明】
[0009] 圖1是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的合成路線。
[0010] 圖2是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的1H-NMR譜圖。
[0011]圖3是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的13C-NMR譜圖。
[0012 ]圖4.是6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的選擇性圖。
[0013] 圖5是DPP-IV的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，提供本發(fā)明的實(shí)施實(shí)例，這些實(shí)施實(shí)例僅僅是 對本發(fā)明的闡述，不限制本發(fā)明的范圍。
[0015] 本發(fā)明實(shí)施例中所采用的設(shè)備及其型號為:熒光發(fā)射/激發(fā)光譜是由SynergyHl全 功能微孔板檢測儀檢測完成;NMR譜圖是由核磁共振波譜儀（Avance II 400MHz)檢測完 成。本發(fā)明中Boc-Gly-Pro-OH指N-[叔丁氧羰基]甘氨酰-L-脯氨酸，其中文同義詞還有： B0C-甘氨酸-L-脯氨酸;Boc指叔丁氧羰基. 實(shí)施例1:6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯(GP-ANC)的合成，即式i中的R為甲 基，附圖1給出了其合成路線。
[0016] 附圖1中化合物2的合成 室溫下，將6-氨基-2-萘甲酸(561.2 mg, 3 mmol)加入甲醇(50 mL)溶液中，攪拌下滴 加濃硫酸(0.5 mL)，加完后回流反應(yīng)，反應(yīng)完畢后，除溶劑，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值至7-8,每次采用50 mL乙酸乙酯萃取，共萃取3次，采用30 mL水洗、30 mL飽和氯化鈉溶液洗，采 用無水硫酸鈉干燥，干燥充分后，蒸除溶劑，得附圖1中的化合物2，為淡褐色固體，產(chǎn)率85_ 95%,ESI-MS m/z 188.1 [M+H]+； 附圖1中化合物3的合成： 室溫，將化合物2(201.2 11^，11111]1〇1)、1'|-[叔丁氧羰基]甘氨酰-1-脯氨酸即13〇〇-617-Pro_OH(544.6 mg, 2.0 mmol)，、N_羥基苯并三氣挫（135.2 mg, 1 mmol)、l_乙基_(3_二甲 基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（191.8mg，1 mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_ 四甲基脲六氟磷酸酯(760.4 mg, 2.0 mmol)依次加入到N，N-二甲基甲酰胺（10 mL)溶液中 反應(yīng)，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應(yīng)，反應(yīng)36 h后，反應(yīng)體系冷卻到0-5 °C，加水(25 mL)，每次采 用30 mL乙酸乙酯萃取，共萃取三次，合并有機(jī)相每次采用15 mL水洗，水洗三次，采用20ml 的5%碳酸氫鈉溶液洗乙醇，15ml水洗一次、20ml飽和氯化鈉溶液洗一次，無水硫酸鈉干燥， 蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱層析（二氯甲烷/甲醇=50/1)得化合物3,為淡黃色固體，產(chǎn)率80_ 90%，，ESI-MS m/z 202.1 [M+H]+; 附圖1化合物4(GP-ANC)的合成： 室溫，將化合物3(227.8 mg，0.5 mmol)加入到二氯甲烷（16 mL)與三氟乙酸(4 mL)混 合溶液中反應(yīng)，薄板層析(TLC)監(jiān)測反應(yīng)。反應(yīng)6 h后，蒸除反應(yīng)溶劑，粗產(chǎn)物加入15 mL水 中，飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值=7-8,每次采用25 mL二氯甲烷萃取，共萃取三次，合并有機(jī) 相采用15ml水進(jìn)行水洗，20ml的飽和氯化鈉溶液洗，無水硫酸鈉干燥，蒸除溶劑，粗產(chǎn)物柱 層析(二氯甲烷/甲醇=4/1)得化合物4，即GP-ANC，產(chǎn)率80-90%，其核磁譜圖如附圖2、附圖 3所示，該產(chǎn)物為白色固體，化合物4的核磁共振波譜具體如下： 4 NMR (400 MHz, CDC13) <?10.03 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.97 (d, J= 7.8 Hz, 1H), 7.91 (brs, 2H), 7.73 (d, J= 6.9 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J= 7.9 Hz, 1H), 4.38 (brs, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.65 (brs, 1H), 3.31 (brs, 1H), 2.86 (brs, 1H), 2.54 (brs, 1H), 1.88 (brs, 2H), 1.66 (brs, 1H), 1.43 (brs, 1H). 13C 匪R (101 MHz, CDC13) S 171.4， 165.4， 161.6, 137.5, 135.9, 130.5, 129.5, 127.7, 126.0, 120.8, 117.9, 116.4, 115.0, 61.2， 52.3， 46.2， 40.7， 29.4， 24.3. ESI-MS m/z 356.2 [M+H]+。
[0017]實(shí)施例2:附圖1中的化合物4(6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯，GP-ANC) 體外測定人重組DPP-IV單酶的選擇性 (1) 預(yù)先準(zhǔn)備198 yL DPP-IV代謝反應(yīng)體系，包括pH值7.4的roS緩沖液(50 mM)、碳酸 酐酶(〇八，10邱/1111)，胰蛋白酶（1^5^;[11，10辟/1111)，胃蛋白酶（口6口8；[11，10邱/1111)，丁酰膽 堿酯酶(BChE，10 yg/mL)，乙酰膽堿酯酶(AChE，10 yg/mL)，羧酸酯酶(hCEl，hCE2，10 yg/ 1^)，人血清白蛋白（擬3，10邱/11110，重組人0??-1父單酶（1辟/1111)，重組人0??-￥111單酶 (1 yg/mL)，重組人成纖維細(xì)胞活化蛋白單酶（FAP，1 yg/mL)，重組人DPP-IV單酶（1 yg/ mL)于37°C條件下震蕩預(yù)孵3分鐘； (2) 向反應(yīng)體系中加入2 yL濃度為10 mM的GP-ANC起始反應(yīng)； (3) 30分鐘后，加入200 yL冰乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)； (4) 用高速冷凍離心機(jī)在4°C，20，000 X g的條件下，高速離心20分鐘后，取上清，進(jìn)行熒 光檢測(Ex = 310/330 nm，Em = 385/445 nm);結(jié)果如附圖4所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GP-ANC為 探針地物的重組人DPP-IV酶的選擇性較好。
[0018]實(shí)施例3:附圖1中的化合物4(6-(甘氨酸-脯氨酸)-氨基-2-萘甲酸甲酯，GP-ANC) 體外測定DPP-IV的檢測下限測定 實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)儀上使用96孔板進(jìn)行測定，GP-ANC 100 yM，DPP-IV單酶0.5 yg/mL~1.2 y g/mL，pH值7.4的roS緩沖液50 mM，總體積為200 yL，37°C下孵育1 h后通過熒光酶標(biāo)儀分 析，每組的平均值與不加 DPP-IV的對照組比較，通過產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度與DPP-IV含量做標(biāo)準(zhǔn) 曲線，如附圖5所示，計算結(jié)果表明DPP-IV的檢測下限為1 ng/mL。
[0019] 實(shí)施例4:作為DPP-IV抑制劑篩選 以GP-ANC的水解代謝為探針反應(yīng)，借助人腸微粒體體外孵育體系，測定五環(huán)三萜化合 物甘草次酸、熊果酸、齊墩果酸、白樺脂酸、對DPP-IV抑制的IC50: a. 200微升體外代謝反應(yīng)體系中，含有pH為7.4的磷酸緩沖液，人腸微粒體蛋白濃度為 10 μg/ml，抑制劑終濃度范圍為O.OlyM-lOOyM，于37°C條件下震蕩預(yù)孵10分鐘； b. 向反應(yīng)體系中加入底物(終濃度100yM)，起始反應(yīng);于37°C條件下反應(yīng)30分鐘后，加 入200 yl乙腈，劇烈震蕩后，終止反應(yīng)； c. 采用高速冷凍離心機(jī)，在20,000 Xg的條件下，高速離心上述體系5分鐘后，取上 清，進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測分析;對代謝水解產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測，檢測數(shù)據(jù)如下表一所示，從所得 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，白樺脂酸對DPP-IV具有一定的抑制活性。
[0020] 在詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式之后，熟悉該項(xiàng)技術(shù)的人士可清楚地了解，在不脫 離上述申請專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí) 施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍，且本發(fā)明亦不 受限于說明書中所舉實(shí)例的實(shí)施方式。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種二膚基膚酶IV的巧光探針底物，其特征在于:所述的巧光探針底物具有如下式I 的結(jié)構(gòu)式：R為甲基或乙基或丙基或下基。2. -種二膚基膚酶IV的巧光探針底物的制備方法，其特征在于包括W下步驟： (1) W下式燃所示的6-氨基-2-糞甲酸為起始原料，經(jīng)過酸催化醋化反應(yīng)合成下式狂I所 示的6-氨基-2-糞甲酸醋類化合物，反應(yīng)式如下：(2) 采用式ni所示的1當(dāng)量的6-氨基-2-糞甲酸醋類化合物在0.5-2當(dāng)量的N-徑基苯并 Ξ氮挫、0.5-2當(dāng)量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽、1-3當(dāng)量的2-(7-偶 氮苯并Ξ氮挫)-N，N，N'，N'-四甲基脈六氣憐酸醋存在下，與1-3當(dāng)量的叔下氧幾基甘氨酸 基脯氨酸，在20-30°C攬拌反應(yīng)24-48小時，生產(chǎn)式妓所示的產(chǎn)物，反應(yīng)式如下：(3) 將步驟(2)生成的產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化，再經(jīng)Ξ氣乙酸酸催化，20-30°C攬拌反應(yīng)4-10 小時脫除叔下氧幾基生成式I所示的二膚基膚酶IV的巧光探針底物;反應(yīng)式如下：上述各反應(yīng)式中，R為甲基或乙基或丙基或下基。3. -種二膚基膚酶IV的巧光探針底物的應(yīng)用，所述的探針底物具有式;f所述的結(jié)構(gòu)式， 其特征在于:采用式I所示的化合物作為二膚基膚酶IV的巧光探針底物，與含二膚基膚酶IV 的生物樣品混合后進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除率或去二膚基產(chǎn)物 的生成率來定量測定不同生物體系中DPP-IV的活性。4. 一種二膚基膚酶IV的巧光探針底物的應(yīng)用，所述的探針底物具有式I所述的結(jié)構(gòu)式， 其特征在于:所述的探針底物可用于DPP-IV抑制劑或誘導(dǎo)劑的快速篩選;或DPP-IV抑制及 誘導(dǎo)能力的定量評估。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種二膚基膚酶IV的巧光探針底物的應(yīng)用，其特征在于： 上述應(yīng)用中具體的測定方法如下： A探針底物濃度為1/10~10 Km，Km為酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時所對應(yīng)的底 物濃度； B WPBS緩沖液作為DPP-IV解育體系，解育體系抑值介于5.5~10.5之間，解育溫度在20 ~60°C之間，在該體系中加入步驟A濃度的探針底物進(jìn)行反應(yīng)； C. 反應(yīng)時間為5~120分鐘，確保W上底物相應(yīng)的N-去二膚基化產(chǎn)物達(dá)到定量限且底物 轉(zhuǎn)化率不超過20%時終止反應(yīng)； D. 測定單位時間內(nèi)底物減少量或N-去二膚基化產(chǎn)物生成量作為DPP-IV活性的評價指 標(biāo)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種二膚基膚酶IV的巧光探針底物的應(yīng)用，其特征在于:步驟 B中解育溫度為37°C，解育體系pH值為7.4。
【文檔編號】C12Q1/37GK105968170SQ201610335328
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】劉林, 夏寧
【申請人】安陽師范學(xué)院