本發(fā)明屬于中藥化學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)涉及從中藥消渴安膠囊中篩選發(fā)現(xiàn)的一種具二肽基肽酶4（DPP-4）抑制活性的活性化合物，該活性化合物及其制劑具有潛在的預(yù)防和治療餐后高血糖癥、糖尿病綜合癥中的高血糖癥的作用。

背景技術(shù)：

糖尿病、肥胖癥和高脂血癥在世界范圍人口中的發(fā)病頻率很高并且繼續(xù)增加。在一般人群中，糖尿病是最慢性的疾病之一，其隨著肥胖和年齡的增多而發(fā)生。雖然有用于治療糖尿病綜合癥所開(kāi)發(fā)的藥物，但是今天在對(duì)糖尿病病人的治療中最具有挑戰(zhàn)的目標(biāo)仍然是使血糖水平盡可能地接近正常。另外，餐后高血糖癥和高胰島素血癥是發(fā)生糖尿病大血管并發(fā)癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病是一種慢性代謝紊亂性疾病，其主要的干預(yù)方法是控制飲食、減少攝入性碳水化合物的含量、藥物治療等。人體攝入的碳水化合物經(jīng)過(guò)小腸上皮細(xì)胞的酶（如淀粉酶和α-葡萄糖苷酶）的水解作用生成葡萄糖之后，才被吸收進(jìn)入血液循環(huán)。而DPP-4作為一種絲氨酸蛋白酶，在腸道中高表達(dá)，它能夠分解腸道細(xì)胞分泌的腸促胰島素（GLP-1）。通過(guò)抑制DPP-4活性，而阻斷其分解GLP-1，使GLP-1能夠持續(xù)發(fā)揮刺激胰島素分泌、抑制升糖素、抑制胃排空和讓胰島細(xì)胞重生等作用，從而降低血糖。目前，西格列汀、阿格列汀等DPP-4抑制劑可以抑制DPP-4活性，成為一類(lèi)臨床常用的糖尿病治療藥物。但現(xiàn)有的DPP-4抑制劑大多為化學(xué)合成小分子，源于中藥的DPP-4抑制劑還少見(jiàn)報(bào)道。

消渴安膠囊是能清熱生津、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀的治療2型糖尿病的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有一定的降血糖作用。其處方包括地黃、知母、黃連、人參、丹參、地骨皮、玉竹和枸杞八味藥材。

本發(fā)明涉及從消渴安膠囊中篩選具有顯著DPP-4抑制作用的化合物及其制劑，其可用于制備治療糖尿病藥物。消渴安膠囊的藥品文號(hào)為：國(guó)藥準(zhǔn)字Z19991067，處方為：地黃 知母 黃連 地骨皮 枸杞子 玉竹 人參 丹參。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物及其制備方法與用途，發(fā)現(xiàn)的新物質(zhì)人參皂苷Ro，在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。

具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物，其特征是：該活性化合物為人參皂苷Ro。

具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。

治療糖尿病的藥物，其特征在于由上述中藥活性化合物（人參皂苷Ro）加入藥劑學(xué)上可接受的輔料，按照藥劑學(xué)上記載的制劑制備方法制成。

治療糖尿病的藥物，其特征在于所述的制劑包括液體制劑或固體制劑，但不限于此，包括其它常規(guī)劑型，不一一羅列。

具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物，其特征在于人參皂苷Ro從消渴安膠囊中提取。但不限于此，也可以是其它藥材中提取。

具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物，其特征在于人參皂苷Ro濃度為35－50 μmol/L。

具有DPP-4抑制活性的中藥活性化合物，其特征在于人參皂苷Ro濃度為50 μmol/L。

消渴安膠囊為臨床驗(yàn)證安全有效的抗糖尿病藥物，從中發(fā)現(xiàn)活性化合物用于制備治療糖尿病藥物，在有效性、安全性上能夠得到保障。采用制備液相色譜從消渴安膠囊中獲得人參皂苷Ro，簡(jiǎn)單易得。

人參皂苷Ro制備方法步驟如下：

（1）原料：消渴安膠囊內(nèi)容物。

（2） 取消渴安膠囊內(nèi)容物120 g，加入10倍量甲醇超聲提取1h。過(guò)濾，50℃下旋蒸至浸膏狀，用100mL超純水復(fù)溶。復(fù)溶液用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離，依次用水、40%乙醇和95%乙醇洗脫，分別得到B01、B02和B03組分。B03組分進(jìn)一步用制備液相進(jìn)行分離，流動(dòng)相：水（A）-乙腈（B）；流速：10 mL ? min^-1；柱溫：30℃；洗脫梯度：0 ~ 60 min（30% ~ 75% B），60 ~ 63 min（75% ~ 85% B），63 ~ 65 min（80% ~ 100% B），65 ~ 75 min（100% ~ 100% B）。取保留時(shí)間為37分鐘的色譜峰，即得。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明提供的中藥有效組分化學(xué)成分簡(jiǎn)單明確，在藥理研究上更易于闡明其作用機(jī)制。

2、本發(fā)明提供的方法首次從消渴安膠囊中得到具有DPP-4抑制活性的人參皂苷Ro，為糖尿病的防治提供新的藥物選擇。

3、消渴安膠囊為臨床驗(yàn)證安全有效的抗糖尿病藥物，從中發(fā)現(xiàn)活性化合物用于制備治療糖尿病藥物，在有效性、安全性上能夠得到保障。

附圖說(shuō)明

圖1為人參皂苷Ro對(duì)DPP-4的抑制作用。

圖2為人參皂苷Ro抑制DPP-4量效關(guān)系。

圖3為人參皂苷Ro對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。

圖4為人參皂苷Ro對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞總膽固醇含量的影響。

圖5為人參皂苷Ro對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞甘油三酯含量的影響。

圖6為人參皂苷Ro對(duì)胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，該實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而并非對(duì)本發(fā)明的限制。

實(shí)施例一DPP-4抑制活性的測(cè)定

采用課題組建立的DPP-4抑制劑篩選方法，將人參皂苷Ro制成1 mmol/L濃度的溶液；將陽(yáng)性藥抑二肽素A制成1 mmol/L濃度的溶液。取96孔板，加50 μmol/L 底物20μL，人參皂苷Ro溶液5 μL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 μL，混勻后37℃下孵育30min，在激發(fā)波長(zhǎng)320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。計(jì)算人參皂苷Ro對(duì)DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，樣品溶液，反應(yīng)底物溶液均以0.5 mmol/L，pH 7.0 HEPES緩沖液配制。

I_給藥組：含底物和酶，并且加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度值；

I_{給藥空白組}：含底物和待測(cè)樣品，不加酶的熒光強(qiáng)度值；

I_{對(duì)照組}：含底物和酶，但不加入待測(cè)樣品反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度值；

I_空白組：只含有底物，不含酶和待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度值。

人參皂苷Ro在50 μmol/L濃度下抑制率為55.73%。相同條件下，陽(yáng)性藥物抑二肽素A在5 μmol/L濃度下抑制率為48.60%。見(jiàn)圖1。

實(shí)施例二中藥活性化合物制劑

取實(shí)施例一的中藥活性化合物0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料后移至滴丸滴灌中，藥液滴至6~8℃液體石蠟中，除油，制得滴丸400粒。

實(shí)施例三中藥活性化合物制劑

取實(shí)施例以的中藥活性化合物0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水1L，上述組分混合均勻后，冷凍干燥，分裝500支，即得。

實(shí)施例四人參皂苷Ro對(duì)DPP-4抑制活性的量效考察

取96孔板，加50 μmol/L 底物20μL，0.1 U/mL DPP-4酶溶液5 μL以及一定體積濃度為1 mmol/L人參皂苷Ro溶液，使得人參皂苷Ro終濃度分別為5、10、25、35、50 μmol/L，反應(yīng)總體積為100 μL。混勻后37℃下孵育30min，在激發(fā)波長(zhǎng)320 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度值。計(jì)算人參皂苷Ro各濃度對(duì)DPP-4活性的抑制率。其中酶溶液，樣品溶液，反應(yīng)底物溶液均以0.5 mmol/L，pH 7.0 HEPES緩沖液配制。

人參皂苷Ro在5、10、25、35、50 μmol/L濃度下抑制率分別為5.49%、13.48%、32.55%、46.65%、56.76%。見(jiàn)圖2。

實(shí)施例五對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

3T3-L1前脂肪細(xì)胞以2×10⁴個(gè)/孔接種于24孔板，置于37℃、含5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)，將培養(yǎng)液換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液1培養(yǎng)48 h；隨后，換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液2繼續(xù)培養(yǎng)48 h；之后將培養(yǎng)液換成3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)液3，每48 h換液一次，直至模型組約有75%的細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，共誘導(dǎo)分化10-12天。在更換誘導(dǎo)液的同時(shí)加入一定體積含人參皂苷Ro的培養(yǎng)液，使得人參皂苷Ro濃度為25 μmol·L^-1。實(shí)驗(yàn)另設(shè)對(duì)照組（不進(jìn)行誘導(dǎo)分化）、模型組和陽(yáng)性藥組（含有300 μmol·L^-1西他列?。?。

誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定1 h，之后PBS漂洗1次，油紅O染色0.5-1 h后，70%乙醇水溶液清洗2次，吸盡液體后，于顯微鏡下拍攝圖片。

人參皂苷Ro在25 μmol/L濃度下能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。見(jiàn)圖3。

實(shí)施例六對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞總膽固醇和甘油三酯含量的影響

誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞后，吸去原培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，每孔加入250 μL細(xì)胞裂解液（所有操作于冰上完成）。反復(fù)吹打細(xì)胞，使得細(xì)胞裂解完全，然后吸出每孔液體，4℃、12000 rpm離心10 min，取上清用于細(xì)胞蛋白定量及甘油三酯、總膽固醇含量的測(cè)定。

甘油三酯和總膽固醇含量測(cè)定：取100 μL細(xì)胞蛋白于96孔板中，加入100 μL甘油三酯（或總膽固醇）含量測(cè)定工作液，37℃振搖5 min，于550 nm處測(cè)定吸光度。

最后結(jié)果以甘油三酯（或總膽固醇）含量除以細(xì)胞蛋白含量表示。

25 μmol/L人參皂苷Ro能顯著降低脂肪細(xì)胞中總膽固醇和甘油三酯含量，使得3T3-L1脂肪細(xì)胞中總膽固醇和甘油三酯含量分別為0.63mmol/g蛋白和0.66mmol/g蛋白，與模型組相比有顯著性差異（P<0.01）。見(jiàn)圖4、5。

實(shí)施例七對(duì)胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞葡萄糖消耗作用的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BNL CL.2細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，2×10⁴個(gè)/孔接種于96孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，使細(xì)胞貼壁。24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，之后加入一定體積的含胰島素和各藥物的DMEM，總體積為100 μL，使得胰島素濃度為1 μmol·L^-1、人參皂苷Ro濃度為25μmol·L^-1。實(shí)驗(yàn)另設(shè)無(wú)細(xì)胞空白組（不含細(xì)胞）、溶劑對(duì)照組（含0.1% DMSO）、模型組（含1μmol·L^-1胰島素）和陽(yáng)性對(duì)照組（含300μmol·L^-1西他列汀和1μmol·L^-1胰島素）。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，取各孔10 μL上清于新的96孔板中，用于測(cè)定葡萄糖含量。之后將原96孔板中的培養(yǎng)基吸盡，避光加入100 μL含0.5 mg · mL^-1 MTT的培養(yǎng)液，繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4 h后，吸去含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，37℃震搖10 min后，酶標(biāo)儀580 nm處測(cè)定各孔吸光度。本部分實(shí)驗(yàn)使用的DMEM均為不含血清的低糖無(wú)酚紅DMEM。

葡萄糖含量測(cè)定：將葡萄糖測(cè)定試劑盒中的R₁工作液和R₂工作液等體積混合后，取200 μL混合液加入含有10 μL上清的96孔板中，37℃孵育30 min后，酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)定各孔吸光度。以無(wú)細(xì)胞空白組的葡萄糖含量減去其他各組葡萄糖含量即為各組細(xì)胞的葡萄糖消耗量，最后除以各組細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)的吸光度進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的校正。

25 μmol/L人參皂苷Ro作用于胰島素抵抗的BNL CL.2細(xì)胞后，葡萄糖消耗量增加，且與模型組相比有顯著性差異（P<0.01）。見(jiàn)圖6。