生物反應(yīng)器中的細(xì)胞擴(kuò)增的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于在生物反應(yīng)器中擴(kuò)增細(xì)胞的實(shí)施方式。在一個(gè)實(shí)施方式中，提供了在生物反應(yīng)器中分布細(xì)胞和使細(xì)胞附著至生物反應(yīng)器的特定部分以改善細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的擴(kuò)增的方法。可在被配置為加載、分布、附著和擴(kuò)增細(xì)胞的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)上實(shí)施實(shí)施方式。
【專利說(shuō)明】生物反應(yīng)器中的細(xì)胞擴(kuò)増
[0001] 相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年11月16日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/905,182的名稱為 "在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中加載并且分布細(xì)胞的方法(METHOD OF LOADING AND DISTRIBUTING CELLS IN A BIOREACTOR OF A CELL EXPANSION SYSTEM)" 的優(yōu)先權(quán)，該美 國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文中，就如其全文涵蓋在本申請(qǐng)中一樣。
【背景技術(shù)】
[0003] 干細(xì)胞在各種治療和療法中的潛在應(yīng)用已經(jīng)取得了特別關(guān)注。細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可用 于擴(kuò)增(例如生長(zhǎng))干細(xì)胞以及其它類型的細(xì)胞，諸如骨髓細(xì)胞。從供體細(xì)胞擴(kuò)增的干細(xì)胞 可用于修復(fù)或替換受損的或有缺陷的組織，并且對(duì)于大量疾病都具有廣泛的臨床應(yīng)用。再 生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的最新進(jìn)展證實(shí)了，干細(xì)胞具有很多特性，諸如增殖和自我更新能力、維持非 特化狀態(tài)以及在特定條件下分化成特化細(xì)胞的能力。
[0004] 細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)包括用于擴(kuò)增細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)腔室，諸如細(xì)胞生長(zhǎng)腔室(在本文 中也被稱為"生物反應(yīng)器"）。為了擴(kuò)增細(xì)胞，通常將初始體積的細(xì)胞加載并且分布在生物反 應(yīng)器中。因此，需要一種在與細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)相連的生物反應(yīng)器中加載并且分布細(xì)胞的方法。 本發(fā)明解決了這種需要或其他需要。
[0005] 鑒于這些和其它方面的考慮，進(jìn)行了本發(fā)明的實(shí)施方式。但是，上述相對(duì)具體的問(wèn) 題并不限制本發(fā)明的實(shí)施方式對(duì)其它問(wèn)題的適用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 提供該
【發(fā)明內(nèi)容】
以介紹本發(fā)明的簡(jiǎn)化形式的一些實(shí)施方式的各個(gè)方面，并不用于 確定本發(fā)明的關(guān)鍵或必要元素，也不用于限制權(quán)利要求的范圍。
[0007] 應(yīng)理解本發(fā)明可包括多種不同的變體或?qū)嵤┓绞剑?br/>【發(fā)明內(nèi)容】
并不是要進(jìn)行限制 或包括所有的變體或?qū)嵤┓绞?。?br/>【發(fā)明內(nèi)容】
提供了對(duì)一些可被包括在實(shí)施方式中的特征的 一些概括性描述，還包括了對(duì)可被包括在其他實(shí)施方式中的其他特征的一些更具體的描 述。
[0008] -個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式通常涉及用于在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中加載和分布 細(xì)胞的方法和系統(tǒng)。因此，實(shí)施方式包括可用于向流體中添加多個(gè)細(xì)胞的方法，該流體在細(xì) 胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器內(nèi)以第一速度循環(huán)。在實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器可包括具有多個(gè) 獨(dú)立中空纖維的中空纖維膜，細(xì)胞和其他流體穿過(guò)該具有多個(gè)獨(dú)立中空纖維的中空纖維膜 循環(huán)。最初，流體穿過(guò)生物反應(yīng)器的中空纖維膜循環(huán)，并且將細(xì)胞添加到循環(huán)的流體中。流 體以第一預(yù)定的循環(huán)速度進(jìn)行循環(huán)。在循環(huán)過(guò)程中，生物反應(yīng)器可處于水平位置。在通過(guò)添 加至循環(huán)流體來(lái)加載細(xì)胞后，隨著細(xì)胞流入和流出中空纖維膜的中空纖維，可允許細(xì)胞穿 過(guò)系統(tǒng)循環(huán)并且均勻地分布在系統(tǒng)中。然后，可停止循環(huán)。隨后，在重力的影響下，允許細(xì)胞 沉淀，并且附著至生物反應(yīng)器中的中空纖維的第一區(qū)上。在實(shí)施方式中，可允許細(xì)胞在第一 預(yù)定時(shí)間段期間進(jìn)行沉淀。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以允許細(xì)胞附著 至中空纖維的第一區(qū)上。
[0009] 在第一預(yù)定時(shí)間段之后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度。在生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)之后，允許 生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行額外的沉淀。然后，細(xì)胞可在第二預(yù)定時(shí)間段期間沉淀在中空纖 維的相對(duì)的部分上，可對(duì)該第二預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以允許細(xì)胞附著至該相對(duì)的部分。在 第二預(yù)定時(shí)間段之后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)回到其初始的水平位置，然后細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增程序。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，加載過(guò)程包括額外的步驟。在一些實(shí)施方式中，在生物反應(yīng)器 返回至其初始的水平位置之后，重新啟動(dòng)循環(huán)。可將循環(huán)速度設(shè)置為比第一預(yù)定循環(huán)速度 慢的速度。一旦使還沒(méi)有附著至表面的細(xì)胞進(jìn)行額外的分布，則要進(jìn)行循環(huán)。該循環(huán)應(yīng)持續(xù) 第三預(yù)定時(shí)間段，以允許未附著的細(xì)胞均勻分布在包括生物反應(yīng)器的系統(tǒng)中。然后停止循 環(huán)，以允許生物反應(yīng)器中的細(xì)胞沉淀，并且在一些實(shí)施方式中再次附著至中空纖維的多個(gè) 部分上
[0011] 在允許細(xì)胞進(jìn)行額外沉淀的第四預(yù)定時(shí)間段之后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度。在生 物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)之后，允許生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行額外的沉淀。然后，細(xì)胞可在第五預(yù)定時(shí) 間段期間沉淀在中空纖維的相對(duì)部分上，可對(duì)該第五預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以允許細(xì)胞附 著至中空纖維的相對(duì)部分。在第五預(yù)定時(shí)間段之后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)回到其初始的水平 位置
[0012] 通過(guò)使細(xì)胞在系統(tǒng)中循環(huán)，以再次重復(fù)上述程序，以使任何未附著的細(xì)胞進(jìn)行均 勻分布。但是，每次重新啟動(dòng)循環(huán)，都以比之前循環(huán)慢的速度重新啟動(dòng)。當(dāng)停止循環(huán)時(shí)，允許 細(xì)胞沉淀和附著。使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度，并且允許細(xì)胞沉淀和附著。然后，使生物反應(yīng)器 旋轉(zhuǎn)回到其初始位置。可將循環(huán)、沉淀、旋轉(zhuǎn)、沉淀和旋轉(zhuǎn)的這些步驟重復(fù)預(yù)定的次數(shù)，之 后，已經(jīng)附著成層的附著的細(xì)胞在生物反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0013] 其它實(shí)施方式還涉及用于在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中加載和分布細(xì)胞的方 法和系統(tǒng)。實(shí)施方式包括可用于向流體中添加多個(gè)細(xì)胞的方法，該流體在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的 生物反應(yīng)器內(nèi)以第一速度循環(huán)。在實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器可包括具有多個(gè)獨(dú)立中空纖維 的中空纖維膜，細(xì)胞和其他流體穿過(guò)該具有多個(gè)獨(dú)立中空纖維的中空纖維膜循環(huán)。最初，流 體穿過(guò)生物反應(yīng)器的中空纖維膜循環(huán)，并且將細(xì)胞添加到循環(huán)的流體中。流體以第一預(yù)定 的循環(huán)速度進(jìn)行循環(huán)。在循環(huán)過(guò)程中，生物反應(yīng)器可處于水平位置。在通過(guò)添加至循環(huán)流體 來(lái)加載細(xì)胞后，隨著細(xì)胞流入和流出中空纖維膜的中空纖維，可允許細(xì)胞穿過(guò)系統(tǒng)循環(huán)并 且均勻地分布在系統(tǒng)中。然后，可停止循環(huán)。隨后，在重力的影響下，允許細(xì)胞沉淀，并且附 著至生物反應(yīng)器中的中空纖維的第一區(qū)上。在實(shí)施方式中，可允許細(xì)胞在第一預(yù)定時(shí)間段 期間進(jìn)行沉淀。在一些實(shí)施方式中，可對(duì)預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以允許細(xì)胞附著至中空纖維 的第一區(qū)上。
[0014] 在第一預(yù)定時(shí)間段之后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度。在生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)之后，細(xì)胞 擴(kuò)增程序。如可理解的，之前附著的細(xì)胞可以在中空纖維的頂部上。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)，細(xì)胞可 受到重力影響，而重力可影響細(xì)胞朝中空纖維的底部生長(zhǎng)。
[0015] 在下面的討論中，特別當(dāng)與附圖一起討論時(shí)，本文中示出的實(shí)施方式的其他優(yōu)點(diǎn) 將變得非常明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明的上述及其他優(yōu)點(diǎn)和特征，將參考附圖中示出的具體實(shí)施 方式給出對(duì)本發(fā)明的更具體的描述。應(yīng)理解，這些附圖僅描繪了本發(fā)明的典型實(shí)施方式，因 此不能認(rèn)為限制了本發(fā)明的范圍。通過(guò)使用附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體詳細(xì)地描述和解釋，在 附圖中：
[0017] 圖1A描繪了細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)(CES)的一個(gè)是實(shí)施方式。
[0018] 圖1B描繪了 CES的第二實(shí)施方式。
[0019]圖1C描繪了CES的第三實(shí)施方式。
[0020] 圖1D描繪了在CES的運(yùn)行過(guò)程中，旋轉(zhuǎn)或側(cè)向移動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的搖動(dòng)裝置的實(shí) 施方式。
[0021] 圖2A描繪了中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的實(shí)施方式的側(cè)視圖。.
[0022]圖2B描繪了在圖2A中示出的中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的實(shí)施方式的側(cè)剖視圖。
[0023] 圖3描繪了生物反應(yīng)器的另一實(shí)施方式的側(cè)剖視圖，示出穿過(guò)生物反應(yīng)器的循環(huán) 路徑。
[0024] 圖4示出根據(jù)實(shí)施方式的CES的一部分的透視圖，該CES包括可拆卸地附接的生物 反應(yīng)器。
[0025] 圖5示出用于在根據(jù)實(shí)施方式的CES中擴(kuò)增細(xì)胞的方法的流程圖。
[0026] 圖6示出用于加載、分布、附著和擴(kuò)增細(xì)胞的程序的流程圖，在一些實(shí)施方式中，該 程序包括可在圖5示出的流程圖的方法中使用的步驟。
[0027] 圖7是用于加載、分布、附著和擴(kuò)增細(xì)胞的程序的流程圖，在一些實(shí)施方式中，該程 序包括可在圖5示出的流程圖的方法中使用的步驟
[0028]圖8示出處于第一取向的生物反應(yīng)器的實(shí)施方式的正視圖。
[0029]圖9示出圖8的生物反應(yīng)器的正視圖，其中示出的生物反應(yīng)器自圖8的視圖旋轉(zhuǎn)了 約90度。
[0030]圖10是圖8的生物反應(yīng)器的正視圖，其中示出的生物反應(yīng)器自圖8的視圖旋轉(zhuǎn)了約 180 度。
[0031]圖11是圖8的生物反應(yīng)器的正視圖，其中示出的生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)回到圖8示出的初 始取向。
[0032]圖12示出圖8的生物反應(yīng)器的正視圖，其中示出的生物反應(yīng)器自圖8的視圖旋轉(zhuǎn)了 約90度，并且自圖9的視圖旋轉(zhuǎn)了約180度。
[0033] 圖13A至圖13C示出隨著執(zhí)行在根據(jù)實(shí)施方式的生物反應(yīng)器中分布、附著和擴(kuò)增細(xì) 胞的程序的步驟，可作為生物反應(yīng)器的部件的中空纖維的(與中心軸線垂直的)橫截面。
[0034] 圖13D和圖13E示出隨著執(zhí)行在根據(jù)實(shí)施方式的生物反應(yīng)器中分布、附著和擴(kuò)增細(xì) 胞的程序的步驟，可作為生物反應(yīng)器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線平行）。
[0035] 圖14A至圖14D示出隨著執(zhí)行在根據(jù)另一實(shí)施方式的生物反應(yīng)器中分布、附著和擴(kuò) 增細(xì)胞的程序的步驟，可作為生物反應(yīng)器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線垂直）。 [00 36]圖15A至圖15F不出隨著執(zhí)行在根據(jù)又一實(shí)施方式的生物反應(yīng)器中分布、附著和擴(kuò) 增細(xì)胞的程序的步驟，可作為生物反應(yīng)器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線垂直）。
[0037]圖16示出生物反應(yīng)器的橫截面，其中示出多個(gè)中空纖維和中空纖維區(qū)域，含細(xì)胞 的液體可穿過(guò)該多個(gè)中空纖維和中空纖維區(qū)域以不同的流速循環(huán)。
[0038] 圖17示出可用于實(shí)施多個(gè)實(shí)施方式的基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)的框圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 通過(guò)參考以下詳細(xì)描述以及附圖中描繪的實(shí)施方式，可進(jìn)一步理解本發(fā)明的原 理。應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管相對(duì)于【具體實(shí)施方式】，下文示出并描述了具體特征，但是本發(fā)明并 不限于下文所述的實(shí)施方式。總體來(lái)講，本公開(kāi)涉及在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器中分布 多個(gè)細(xì)胞的方法。如下所述，在生物反應(yīng)器中分布細(xì)胞的方法可包括:將細(xì)胞加載至生物反 應(yīng)器中；使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)，以及維持生物反應(yīng)器靜止在特定的取向處。
[0040] 在圖1A描繪了示例性細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)(CES)的示意圖。CES10包括第一流體循環(huán)路徑 12和第二流體循環(huán)路徑14。第一流體流動(dòng)路徑16具有與中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24(在本文 中也被稱為"生物反應(yīng)器"）流體相連的至少相對(duì)端部18和20。具體地，相對(duì)端部18與細(xì)胞生 長(zhǎng)腔室24的第一入口 22流體相連，而相對(duì)端部20與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24的第一出口 28流體相 連。第一循環(huán)路徑12中的流體流經(jīng)布置在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24中的中空纖維膜的中空纖維的內(nèi) 部(細(xì)胞生長(zhǎng)腔室和中空纖維膜將在下文中進(jìn)行更加詳細(xì)地描述）。此外，第一流體流動(dòng)控 制器30與第一流體流動(dòng)路徑16可操作地相連，并且控制第一循環(huán)路徑12中流體的流動(dòng)。
[0041] 第二流體循環(huán)路徑14包括第二流體流動(dòng)路徑34、細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24以及第二流體流 動(dòng)控制器32。第二流體流動(dòng)路徑34具有至少相對(duì)端部36和38。第二流體流動(dòng)路徑34的相對(duì) 端部36和38分別與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24的進(jìn)入端口 40和排出端口 42流體相連。流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室24的流體與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室24中的中空纖維膜的外部相接觸。第二流體循環(huán)路徑14與第二 流體流動(dòng)控制器32可操作地相連。
[0042] 因此，通過(guò)中空纖維膜，第一流體循環(huán)路徑12和第二流體循環(huán)路徑14在細(xì)胞生長(zhǎng) 腔室24中是分離的。第一流體循環(huán)路徑12中的流體流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中的中空纖維的內(nèi)毛 細(xì)管（"1C"）空間。因此，第一循環(huán)路徑12被稱為"1C環(huán)路"。第二循環(huán)路徑14中的流體流經(jīng)細(xì) 胞生長(zhǎng)腔室中的外毛細(xì)管（"EC")空間。因此，第二流體循環(huán)路徑14被稱為"EC環(huán)路"。第一流 體循環(huán)路徑12中的流體能以相對(duì)于第二流體循環(huán)路徑14中的流體流動(dòng)的順流或逆流的方 向流動(dòng)。
[0043]流體進(jìn)入路徑44與第一流體循環(huán)路徑12流體相連。流體進(jìn)入路徑44允許流體進(jìn)入 第一流體循環(huán)路徑12,而流體排出路徑46允許流體離開(kāi)CES10。第三流體流動(dòng)控制器48與流 體進(jìn)入路徑44可操作地相聯(lián)?；蛘撸谌黧w流動(dòng)控制器48可與第一排出路徑46可替代地 相聯(lián)。
[0044] 本文中所使用的流體流動(dòng)控制器可為栗、閥、夾具或它們的組合。多個(gè)栗、閥和夾 具可以任何的組合來(lái)布置。在各個(gè)實(shí)施方式中，流體流動(dòng)控制器是蠕動(dòng)栗或包括蠕動(dòng)栗。在 其他實(shí)施方式中，流體循環(huán)路徑、進(jìn)入端口和排出端口可以由任意材料的管子構(gòu)成。
[0045] 各組件在本文中被稱為"可操作地相聯(lián)/相連"。如本文所使用的，"可操作地相聯(lián)/ 相連"是指組件以可操作的方式連接在一起，并且涵蓋其中組件直接連接的實(shí)施方式以及 其中在兩個(gè)連接的組件之間放置有額外的組件的實(shí)施方式。"可操作地相聯(lián)/相連的"組件 可為"流體相連"。"流體相連"是指將組件連接在一起，以使得能在它們之間運(yùn)輸流體。"流 體相連"涵蓋其中在兩個(gè)流體相連的組件之間放置有額外的組件的實(shí)施方式，以及其中組 件之間是直接相連的實(shí)施方式。流體相連的組件可包括不與流體相接觸，而與其它組件相 接觸以操控系統(tǒng)的組件(例如，通過(guò)壓縮管的外部來(lái)栗送流體穿過(guò)柔性管子的蠕動(dòng)栗）。
[0046]通常來(lái)講，任何類型的流體(包括緩沖液、含蛋白的流體以及含細(xì)胞的流體)都可 流經(jīng)各循環(huán)路徑、進(jìn)入路徑以及排出路徑。如本文所使用的，"流體"、"介質(zhì)"以及"流體介 質(zhì)"是可互換使用的。
[0047]圖1B描繪了更詳細(xì)的細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)800XES800包括第一流體循環(huán)路徑802(也被 稱為"內(nèi)毛細(xì)管環(huán)路"或"1C環(huán)路"），以及第二流體循環(huán)路徑804(也被稱為"外毛細(xì)管環(huán)路" 或"EC環(huán)路"）。第一流體流動(dòng)路徑806通過(guò)第一流體循環(huán)路徑802與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801流體相 連。流體通過(guò)1C進(jìn)入端口 801A流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801，流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801中的中空纖維， 并且經(jīng)由1C排出端口801B流出。壓力傳感器810測(cè)量離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801的介質(zhì)的壓力。 除了壓力以外，傳感器810在實(shí)施方式中也可為在運(yùn)行期間檢測(cè)介質(zhì)壓力和溫度的溫度傳 感器。介質(zhì)流經(jīng)可用于控制介質(zhì)流速(例如在1C環(huán)路中的循環(huán)速度）的1C循環(huán)栗812 JC循環(huán) 栗812可沿第一方向栗送流體，或沿與第一方向相對(duì)的第二方向栗送流體。排出端口 801B可 用作相反方向上的入口。進(jìn)入IC環(huán)路802的介質(zhì)可經(jīng)過(guò)閥814進(jìn)入。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知 曉的，可將額外的閥和/或其他裝置放置在各位置，以沿流體路徑的多個(gè)部分隔離和/或測(cè) 量介質(zhì)的特性。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，示出的示意圖代表CES800的各元件的一種可能的配 置，而且對(duì)示出的示意圖的修改在一個(gè)或多個(gè)所示的實(shí)施方式的范圍內(nèi)。
[0048] 對(duì)于1C環(huán)路802,可在運(yùn)行期間從樣品線圈818中獲得介質(zhì)樣品。隨后介質(zhì)返回至 1C進(jìn)入端口 801A，以完成流體循環(huán)路徑802?？蓪⒃诩?xì)胞生長(zhǎng)腔室801中生長(zhǎng)/擴(kuò)增的細(xì)胞沖 出細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801，通過(guò)閥898和管線897進(jìn)入收獲袋899。或者，當(dāng)閥898關(guān)閉時(shí)，細(xì)胞可在 腔室801內(nèi)重新分布以用于進(jìn)一步的生長(zhǎng)或加載。
[0049] 第二流體循環(huán)路徑804中的流體經(jīng)由EC進(jìn)入端口 801C進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801，并且 經(jīng)由EC排出端口 801D離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801。在EC環(huán)路804中的介質(zhì)與在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801 中的中空纖維的外部相接觸，從而允許小分子分散進(jìn)入中空纖維內(nèi)或分散出中空纖維，該 中空纖維可在腔室801內(nèi)。
[0050]在介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801的EC空間之前，布置在第二流體循環(huán)路徑804中的壓 力/溫度傳感器824允許測(cè)量介質(zhì)的壓力和溫度。在介質(zhì)離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801之后，傳感器 826允許測(cè)量在第二流體循環(huán)路徑804中的介質(zhì)的壓力和溫度。對(duì)于EC環(huán)路804,可在運(yùn)行期 間從樣品端口 830或樣品線圈中獲得介質(zhì)樣品。
[0051 ]在離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801的EC排出端口 801D之后，在第二流體循環(huán)路徑804中的流 體穿過(guò)EC循環(huán)栗828到達(dá)氣體運(yùn)輸模塊832AC循環(huán)栗828也可沿相對(duì)方向栗送流體。第二流 體流動(dòng)路徑822經(jīng)由氣體運(yùn)輸模塊832的進(jìn)入端口 832A和排出端口 832B與氣體運(yùn)輸模塊832 流體相連。在運(yùn)行中，流體介質(zhì)經(jīng)由進(jìn)入端口 832A流入氣體運(yùn)輸模塊832中，并且經(jīng)由排出 端口 832B離開(kāi)氣體運(yùn)輸模塊832。氣體運(yùn)輸模塊832將氧加入到CES800的介質(zhì)中并且去除 CES800的介質(zhì)中的氣泡。在各實(shí)施方式中，在第二流體循環(huán)路徑804中的介質(zhì)與進(jìn)入氣體運(yùn) 輸模塊832中的氣體相平衡。氣體運(yùn)輸模塊832可為本領(lǐng)域已知的任意合適尺寸的裝置，并 且用于氧合或氣體運(yùn)輸?？諝饣驓怏w經(jīng)由過(guò)濾器838流入氣體運(yùn)輸模塊832,并且通過(guò)過(guò)濾 器840流出氧合器或氣體運(yùn)輸裝置832。過(guò)濾器838和過(guò)濾器840降低或防止氧合器832和相 關(guān)介質(zhì)的污染。在啟動(dòng)順序的多個(gè)部分期間，從CES800排出的空氣或氣體可經(jīng)由氣體運(yùn)輸 模塊832排放到大氣中。
[0052]在描繪的CES800的配置中，在第一流體循環(huán)路徑802和第二流體循環(huán)路徑804中的 流體介質(zhì)沿相同的方向（順流配置)流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801。還可將CES800配置成以逆流構(gòu) 造流動(dòng)。
[0053]根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方式，包括細(xì)胞(來(lái)自諸如細(xì)胞容器(例如袋子)的源)的介質(zhì)可 附接在附接點(diǎn)862處，并且來(lái)自介質(zhì)源的流體介質(zhì)可附接在附接點(diǎn)846處。可經(jīng)由第一流體 流動(dòng)路徑806,將細(xì)胞和介質(zhì)引入到第一流體循環(huán)路徑802中。附接點(diǎn)862經(jīng)由閥864與第一 流體流動(dòng)路徑806流體相連，附接點(diǎn)846經(jīng)由閥850與第一流體流動(dòng)路徑806流體相連。試劑 源可與點(diǎn)844流體連接，并且經(jīng)由閥848與流體進(jìn)入路徑842相關(guān)聯(lián)，或經(jīng)由閥848和閥872與 第^流體進(jìn)入路徑874相關(guān)聯(lián)。
[0054] 空氣去除腔室(ARC)856與第一循環(huán)路徑802流體相連?？諝馊コ皇?56可包括一 個(gè)或多個(gè)傳感器(包括上傳感器和下傳感器），以在空氣去除腔室856內(nèi)的特定測(cè)量位置處 檢測(cè)空氣、流體的缺乏，和/或氣體/流體界面(例如空氣/流體界面）。例如，超聲波傳感器可 用在靠近空氣去除腔室856的底部和/或頂部處，以檢測(cè)這些位置處的空氣、流體，和/或氣 體/流體界面。在不脫離本公開(kāi)的精神和范圍的情況下，實(shí)施方式提供了多種其它類型的傳 感器的應(yīng)用。例如，根據(jù)本公開(kāi)的實(shí)施方式，可使用光學(xué)傳感器。在啟動(dòng)順序的多個(gè)部分期 間或其它方案中，從CES800中排出的空氣或氣體能夠經(jīng)由管線858從空氣閥860排出進(jìn)入大 氣，其中管線858與空氣去除腔室856流體相連。
[0055] EC介質(zhì)源可附接至EC介質(zhì)附接點(diǎn)868,沖洗液源可附接至沖洗液附接點(diǎn)866,以將 EC介質(zhì)和/或沖洗液添加到第一流體流動(dòng)路徑或第二流體流動(dòng)路徑中。附接點(diǎn)866可與閥 870流體相連，其中閥870經(jīng)由閥872和第一流體進(jìn)入路徑842與第一流體循環(huán)路徑802流體 相連?；蛘撸ㄟ^(guò)打開(kāi)閥870和閉合閥872，附接點(diǎn)866可經(jīng)由第二流體進(jìn)入路徑874和EC進(jìn)入 路徑884與第二流體循環(huán)路徑804流體相連。同樣地，附接點(diǎn)868與閥876流體相連，其中閥 876可經(jīng)由第一流體進(jìn)入路徑842和閥872與第一流體循環(huán)路徑802流體相連?；蛘撸ㄟ^(guò)打 開(kāi)閥876和閉合閥分配器872,流體容器868可與第二流體進(jìn)入路徑874流體相連。
[0056] 在1C環(huán)路802中，最初可通過(guò)1C進(jìn)入栗854向前推動(dòng)流體。在EC環(huán)路804中，最初可 通過(guò)EC進(jìn)入栗878向前推動(dòng)流體?？諝鈾z測(cè)器880(諸如超聲波傳感器）也可與EC進(jìn)入路徑 884相關(guān)聯(lián)。
[0057]在至少一個(gè)實(shí)施方式中，第一流體循環(huán)路徑802和第二流體循環(huán)路徑804與廢物管 線888連接。當(dāng)閥890打開(kāi)時(shí)，1C介質(zhì)可流經(jīng)廢物管線888，到達(dá)廢物袋886。同樣地，當(dāng)閥892 打開(kāi)時(shí)，EC介質(zhì)可流至廢物袋886。
[0058]在細(xì)胞已經(jīng)在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801中生長(zhǎng)后，可經(jīng)由細(xì)胞收獲路徑897來(lái)收獲生長(zhǎng)的 細(xì)胞。此時(shí)，在閥898是打開(kāi)的情況下，可通過(guò)栗送含細(xì)胞的1C介質(zhì)，使其經(jīng)過(guò)細(xì)胞收獲路徑 897進(jìn)入細(xì)胞收獲袋899，收獲來(lái)自細(xì)胞生長(zhǎng)腔室801的細(xì)胞。
[0059] CES800的各組件也可被包含或封裝在機(jī)器或殼體899(諸如細(xì)胞擴(kuò)增器）內(nèi)，其中， 該機(jī)器將細(xì)胞和介質(zhì)維持在預(yù)定溫度。進(jìn)一步需要注意的是，在實(shí)施方式中，CES 800的組 件可與其它CES(諸如CES10(圖1A)或CES900(圖1C))的組件組合。在其它實(shí)施方式中，CES可 包括比圖1A至圖1C中所示出少的部件，而且這樣的實(shí)施方式仍然在本公開(kāi)的范圍內(nèi)。
[0060]圖1C描繪了 CES的另一實(shí)施方式。CES900包括第一流體循環(huán)路徑902(也被稱為"內(nèi) 毛細(xì)管（1C)環(huán)路"）以及第二流體循環(huán)路徑904(也被稱為"外毛細(xì)管環(huán)路"或"EC環(huán)路"）。
[0061] 第一流體流動(dòng)路徑906通過(guò)第一流體循環(huán)路徑902與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908流體相連。 流體通過(guò)進(jìn)入端口 910流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908中，流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908中的中空纖維，并且 經(jīng)由排出端口 907離開(kāi)。壓力計(jì)917測(cè)量離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908的介質(zhì)的壓力。介質(zhì)流經(jīng)可用 于控制介質(zhì)流速的閥913和栗911。在運(yùn)行期間，可從樣品端口 905或樣品線圈909獲得介質(zhì) 樣品。布置在第一流體循環(huán)路徑902中的壓力/溫度計(jì)915允許在運(yùn)行期間檢測(cè)介質(zhì)的壓力 和溫度。隨后，介質(zhì)返回至進(jìn)入端口910,以完成流體循環(huán)路徑902?？蓪⒃诩?xì)胞生長(zhǎng)腔室908 中擴(kuò)增的細(xì)胞沖出細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908或重新分布在中空纖維中，以用于進(jìn)一步的生長(zhǎng)。 [0062] 第二流體循環(huán)路徑904包括第二流體流動(dòng)路徑912,該第二流體流動(dòng)路徑912與環(huán) 路中的細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908流體相連。第二流體循環(huán)路徑904中的流體經(jīng)由進(jìn)入端口 914進(jìn)入 細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908,并且經(jīng)由排出端口 916離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908。介質(zhì)與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908 中的中空纖維的外部相接觸，允許小分子擴(kuò)散進(jìn)入中空纖維和從中空纖維擴(kuò)散出來(lái)。
[0063]在介質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908的EC空間之前，布置在第二循環(huán)路徑904中的壓力/ 溫度計(jì)919允許測(cè)量介質(zhì)的壓力和溫度。在介質(zhì)離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908之后，壓力計(jì)921允許 測(cè)量在第二循環(huán)路徑904中的介質(zhì)的壓力。
[0064]在離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908的排出端口 916之后，第二流體循環(huán)路徑904中的流體穿 過(guò)栗920和閥922到達(dá)氧合器918。第二流體流動(dòng)路徑912經(jīng)由氧合器進(jìn)入端口 924和氧合器 排出端口926與氧合器918流體相連。在運(yùn)行中，流體介質(zhì)經(jīng)由氧合器進(jìn)入端口924流入氧合 器918中，并且經(jīng)由氧合器排出端口926離開(kāi)氧合器918。
[0065]氧合器918將氧加入到CES900中的介質(zhì)中。在各實(shí)施方式中，第二流體循環(huán)路徑 904中的介質(zhì)與進(jìn)入氧合器918的氣體相平衡。氧合器可為本領(lǐng)域已知的任意氧合器。氣體 經(jīng)由過(guò)濾器928流入氧合器918中，并且通過(guò)過(guò)濾器930流出氧合器918。過(guò)濾器928和過(guò)濾器 930降低或防止氧合器918和相關(guān)介質(zhì)的污染。
[0066]在描繪的CES900的配置中，第一循環(huán)路徑902和第二循環(huán)路徑904中的流體介質(zhì)沿 相同的方向（順流配置)流經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，CES900也可配置 為逆流構(gòu)造。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，相應(yīng)的進(jìn)入端口和排出端口可布置在細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室908中的任何位置處。
[0067]可經(jīng)由第一流體進(jìn)入路徑932,將細(xì)胞和流體介質(zhì)引入至流體循環(huán)路徑902中。流 體容器934和流體容器936分別經(jīng)由閥938和閥940與第一流體進(jìn)入路徑932流體相連。同樣 地，細(xì)胞容器942經(jīng)由閥943與第一流體循環(huán)路徑902流體相連。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞和 流體可經(jīng)過(guò)熱交換器944、栗946，進(jìn)入滴注腔室(dr ip chamber) 948中。在來(lái)自容器942的細(xì) 胞經(jīng)過(guò)熱交換器944的實(shí)施方式中，要使用額外的管線(未示出）來(lái)連接容器942和熱交換器 944。滴注腔室948與第一流體循環(huán)路徑902流體相連。來(lái)自滴注腔室948的溢出物可經(jīng)由閥 952從溢出物管線950流出滴注腔室948。
[0068] 可從流體容器954和流體容器956,將額外流體添加到第一流體循環(huán)路徑902或第 二流體循環(huán)路徑904中。流體容器954與閥958流體相連，其中，閥958經(jīng)由閥964、路徑960和 路徑932與第一流體循環(huán)路徑902流體相連?；蛘?，流體容器954與第二流體進(jìn)入路徑962流 體相連。同樣地，流體容器956與閥966流體相連，其中閥966經(jīng)由第一流體進(jìn)入路徑960與第 一流體循環(huán)路徑902流體相連。或者，流體容器956與第二流體進(jìn)入路徑962流體相連。
[0069]第二流體進(jìn)入路徑962被配置為，允許流體在進(jìn)入滴注腔室970前流經(jīng)熱交換器 944、栗968。第二流體進(jìn)入路徑962延續(xù)至第二流體循環(huán)路徑904。溢出的流體可經(jīng)由溢出物 管線972通過(guò)閥974流出，到達(dá)廢物容器976。
[0070] 可經(jīng)由細(xì)胞收獲路徑978收獲細(xì)胞。當(dāng)閥982打開(kāi)時(shí)，可通過(guò)栗送含細(xì)胞的介質(zhì)穿 過(guò)細(xì)胞收獲路徑978到達(dá)細(xì)胞收獲袋980，收獲來(lái)自細(xì)胞生長(zhǎng)腔室908的細(xì)胞。
[0071] 第一流體循環(huán)路徑902和第二流體循環(huán)路徑904通過(guò)連接器路徑984相連。當(dāng)閥986 打開(kāi)時(shí)，介質(zhì)可流經(jīng)在第一循環(huán)路徑902和第二循環(huán)路徑904之間的連接器路徑984。同樣 地，栗990可將介質(zhì)栗送穿過(guò)在第一流體循環(huán)路徑902和第二流體循環(huán)路徑904之間的另一 連接器路徑988。
[0072] CES900的各組件可被容納在培養(yǎng)箱999內(nèi)。培養(yǎng)箱999將細(xì)胞和介質(zhì)維持在恒定溫 度。
[0073]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，任意數(shù)目的流體容器(例如介質(zhì)袋)能夠以任意組合與 CES900流體相連。還應(yīng)注意到的是，滴注腔室948的位置或獨(dú)立于滴注腔室948的傳感器可 位于CES900中進(jìn)入端口 910之前的任意位置處。
[0074] CES800和CES900可包括額外的組件。例如，可在CES上的蠕動(dòng)栗的位置處增加一個(gè) 或多個(gè)栗環(huán)路(未示出）。栗環(huán)路可由聚氨酯(PU)(可獲自Tygothane C-210A)制成?；蛘撸?可包括作為一次性部件的盒子(cassette)，該盒子用于組織管線并且也可包括蠕動(dòng)栗的管 道環(huán)路。
[0075] 在一些實(shí)施方式中還可提供可拆卸的流動(dòng)線路(本文中也可稱為"可拆卸的循環(huán) 模塊"）?？刹鹦兜牧鲃?dòng)線路可為細(xì)胞擴(kuò)增模塊的一部分，該細(xì)胞擴(kuò)增模塊被配置為附接至 CES的更永久的固定部件。通常來(lái)講，CES的固定部件包括蠕動(dòng)栗。在各實(shí)施方式中，CES的固 定部件可包括閥和/或夾具。
[0076] 可拆卸的流動(dòng)線路可包括具有至少兩個(gè)端部的第一流體流動(dòng)路徑。第一端部被配 置為與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的第一端部流體相連，第一流體流動(dòng)路徑的第二端部被配置為與細(xì)胞 生長(zhǎng)腔室的第二端部流體相連。
[0077] 同樣地，可拆卸的流動(dòng)線路可包括具有至少兩個(gè)端部的第二流體流動(dòng)路徑?？刹?卸的流動(dòng)線路的一部分可被配置為與氧合器和/或生物反應(yīng)器流體相連?？刹鹦兜牧鲃?dòng)線 路可包括被配置為與氧合器和細(xì)胞生長(zhǎng)腔室流體相連的第二流體流動(dòng)路徑。
[0078] 在各實(shí)施方式中，可拆卸的流動(dòng)線路可拆卸地且一次性地安裝至流體流動(dòng)控制 器?？刹鹦兜牧鲃?dòng)線路可包括與CES的多個(gè)部件連接的可拆卸的流體導(dǎo)管(例如柔性管子）。
[0079] 在其他實(shí)施方式中，可拆卸的流動(dòng)線路可包括細(xì)胞生長(zhǎng)腔室、氧合器以及用于容 納介質(zhì)和細(xì)胞的袋子。在各實(shí)施方式中，多個(gè)組件可連接在一起，或是相互隔開(kāi)的?；蛘撸?拆卸的流動(dòng)線路可包括被配置為與流體流通控制器(諸如閥、栗及其組合)附接的一個(gè)或多 個(gè)部分。在使用蠕動(dòng)栗的變形中，可拆卸的線路模塊可包括蠕動(dòng)環(huán)路，該蠕動(dòng)環(huán)路被配置為 環(huán)繞管道的蠕動(dòng)部分安裝。在各實(shí)施方式中，蠕動(dòng)環(huán)路可被配置為與循環(huán)路徑、進(jìn)入路徑和 排出路徑流體相連?？刹鹦兜牧鲃?dòng)線路也可組合在套件(kit)中，該套件具有將它組裝或附 接至流體流動(dòng)控制器(諸如栗和閥）的說(shuō)明書(shū)。
[0080] 實(shí)施方式提供了使用許多不同的方法將細(xì)胞引入至CES的生物反應(yīng)器中。如下文 中進(jìn)行的更詳細(xì)地描述，實(shí)施方式包括在生物反應(yīng)器中分布細(xì)胞以促進(jìn)細(xì)胞一致擴(kuò)增的方 法和系統(tǒng)。
[0081]根據(jù)實(shí)施方式，細(xì)胞可在1C環(huán)路或EC環(huán)路中生長(zhǎng)（"擴(kuò)增"）。貼壁細(xì)胞和非貼壁的 懸浮細(xì)胞都可進(jìn)行擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)腔室纖維的管腔可涂覆有纖連蛋白。 將無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子(例如，無(wú)鈣和鎂）的PBS加入至CES系統(tǒng)中。在將貼壁細(xì)胞引入至細(xì)胞生長(zhǎng) 腔室，例如腔室24、801或908中之后，將它們孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使它們附著至中空纖維。 循環(huán)1C介質(zhì)和EC介質(zhì)，以確保為細(xì)胞供應(yīng)足夠的營(yíng)養(yǎng)。
[0082] 可將1C環(huán)路和EC環(huán)路的流速調(diào)節(jié)至特定值。在各實(shí)施方式中，可將1C環(huán)路和EC環(huán) 路的流速獨(dú)立地設(shè)置為約2mL/分鐘、約4mL/分鐘、約6mL/分鐘、約8mL/分鐘、約10mL/分鐘、 約15mL/分鐘、約20mL/分鐘、約25mL/分鐘、約30mL/分鐘、約35mL/分鐘、約40mL/分鐘、約 45mL/分鐘、約50mL/分鐘、約60mL/分鐘、約70mL/分鐘、約80mL/分鐘、約90mL/分鐘、約 100mL/分鐘、約200mL/分鐘、約300mL/分鐘、約400mL/分鐘或約500mL/分鐘。在各實(shí)施方式 中，可將1C線路環(huán)路的流速設(shè)置為約10mL/分鐘至約20mL/分鐘，可將EC線路環(huán)路的流速設(shè) 置為20mL/分鐘至約30mL/分鐘（允許介質(zhì)流經(jīng)氧合器并且重建氧的水平）?？梢暂^低的流速 (例如，在一些實(shí)施方式中為0. lmL/分鐘)將額外的介質(zhì)栗入至CES中，以更換通過(guò)氣體交換 模塊(諸如，氣體交換器/氧合器832和918)蒸發(fā)的介質(zhì)。在各實(shí)施方式中，EC環(huán)路去除細(xì)胞 廢物，并且1C環(huán)路在介質(zhì)中包含生長(zhǎng)因子。
[0083] CES在不同的生長(zhǎng)條件和標(biāo)準(zhǔn)中可提供很大的靈活性。通過(guò)使介質(zhì)持續(xù)循環(huán)，可以 使細(xì)胞在1C環(huán)路中保持懸浮?；蛘?，可停止介質(zhì)的循環(huán)，以使細(xì)胞沉淀。通過(guò)超濾可將新鮮 的介質(zhì)加入至1C環(huán)路中，以在不去除細(xì)胞的情況下容納超額體積。EC介質(zhì)的循環(huán)允許氣體、 營(yíng)養(yǎng)物、廢棄產(chǎn)物進(jìn)行交換，并且允許在不去除細(xì)胞的情況下添加新介質(zhì)。
[0084] 擴(kuò)增的細(xì)胞可包括貼壁細(xì)胞、非貼壁細(xì)胞或現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞的任意組合的共培 養(yǎng)?？稍贑ES的實(shí)施方式中生長(zhǎng)的細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括(非限制性的)干細(xì)胞(例如間充 質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞等）、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、祖細(xì)胞、其他完全分化的細(xì)胞，以及它們的組 合。
[0085] 在實(shí)施方式中，為了收獲貼壁細(xì)胞，可將1C介質(zhì)和EC介質(zhì)替換成無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子的 介質(zhì)（例如，無(wú)二價(jià)陽(yáng)離子的PBS)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可將胰蛋白酶加載至第一循環(huán)路徑 中，并且與貼壁細(xì)胞一起孵育一段時(shí)間（在一些實(shí)施方式中，一起孵育約5分鐘至約10分 鐘）。隨后，可從系統(tǒng)中沖洗掉胰蛋白酶。通過(guò)增加流過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的流速向細(xì)胞施加剪 切力，并且可將從細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中釋放的貼壁細(xì)胞栗入至細(xì)胞收獲袋中。
[0086] 當(dāng)擴(kuò)增非貼壁細(xì)胞時(shí)，可從循環(huán)1C線路沖洗出細(xì)胞。貼壁細(xì)胞保持在細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室中，而去除了非貼壁細(xì)胞。
[0087] CES可用于進(jìn)行各種細(xì)胞擴(kuò)增方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，可擴(kuò)增接種的細(xì)胞群。將 細(xì)胞引入或接種至CES中。在某些情況下，可使中空纖維的管腔處于允許細(xì)胞附著的適當(dāng)條 件。隨后，將細(xì)胞加入至細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中，并且貼壁細(xì)胞附著至中空纖維，而非貼壁細(xì)胞(例 如造血干細(xì)胞或HSC)并不附著?？蓮南到y(tǒng)中沖洗出非貼壁細(xì)胞。在孵育一段時(shí)間之后，貼壁 細(xì)胞可被釋放并收獲。
[0088] 在實(shí)施方式中，細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的細(xì)胞生長(zhǎng)腔室包括中空纖維膜，中空纖維膜由將 第一流體循環(huán)路徑和第二流體循環(huán)路徑隔開(kāi)的多個(gè)半通透的中空纖維組成。
[0089] CES可包括一裝置，該裝置通過(guò)將其附接至旋轉(zhuǎn)和/或側(cè)向搖動(dòng)的裝置，被配置為 相對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的其它組件移動(dòng)或"搖動(dòng)"細(xì)胞生長(zhǎng)腔室。圖1D示出了這樣的一個(gè)裝 置，其中，生物反應(yīng)器400與兩個(gè)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)組件和一個(gè)側(cè)向搖動(dòng)組件旋轉(zhuǎn)相連。
[0090]第一旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)裝置組件402使生物反應(yīng)器400繞生物反應(yīng)器的中心軸線410旋轉(zhuǎn)。 生物反應(yīng)器400還與側(cè)向搖動(dòng)裝置404連接。旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)裝置組件402與生物反應(yīng)器400旋轉(zhuǎn)相 聯(lián)。旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)裝置402隨后使生物反應(yīng)器400繞生物反應(yīng)器的中心軸線410旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)可沿順 時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行或沿逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行。生物反應(yīng)器400可沿單一方向繞中心軸線410以順時(shí)針 方向或逆時(shí)針?lè)较蜻B續(xù)地旋轉(zhuǎn)。或者，生物反應(yīng)器400可以交替的方式旋轉(zhuǎn)，繞中心軸線410 首先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，隨后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)。
[0091 ] CES還可包括第二旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)組件，該第二旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)組件使生物反應(yīng)器400繞旋轉(zhuǎn)軸 線412旋轉(zhuǎn)。旋轉(zhuǎn)軸線412穿過(guò)生物反應(yīng)器400的中心點(diǎn)并且與中心軸線410正交。生物反應(yīng) 器400可沿單一方向繞旋轉(zhuǎn)軸線412以順時(shí)針?lè)较蚧蚰鏁r(shí)針?lè)较蜻B續(xù)地旋轉(zhuǎn)?；蛘?，生物反 應(yīng)器400可以交替的方式旋轉(zhuǎn)，繞旋轉(zhuǎn)軸線412首先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，隨后逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)。在各實(shí)施 方式中，生物反應(yīng)器400也可繞旋轉(zhuǎn)軸線412旋轉(zhuǎn)，并且位于相對(duì)于重力的水平取向或豎直 取向上。
[0092] 側(cè)向搖動(dòng)組件404與生物反應(yīng)器400側(cè)向相聯(lián)。側(cè)向搖動(dòng)組件404的平面沿-X方向 和-y方向側(cè)向移動(dòng)。因此，隨著含細(xì)胞的介質(zhì)在中空纖維中的運(yùn)動(dòng)，降低了細(xì)胞在生物反應(yīng) 器400中的沉淀。
[0093] 搖動(dòng)裝置的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)和/或側(cè)向移動(dòng)可降低裝置內(nèi)細(xì)胞的沉淀并且降低細(xì)胞被捕 獲在生物反應(yīng)器400的一部分內(nèi)的可能性。根據(jù)斯托克（Stoke)定律，細(xì)胞在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室 (例如生物反應(yīng)器400)中的沉淀速度與細(xì)胞和懸浮液介質(zhì)之間的密度差異成比例。在某些 實(shí)施方式中，進(jìn)行如上所述的重復(fù)的具有暫停的180°旋轉(zhuǎn)(快）（具有30秒的總組合時(shí)間)使 非貼壁的血紅細(xì)胞保持懸浮。在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行約180°的最小旋轉(zhuǎn);然而，在其它實(shí) 施方式中，可利用高達(dá)360°或更大角度的旋轉(zhuǎn)?？瑟?dú)立地或以任意組合使用不同的搖動(dòng)組 件。例如，使生物反應(yīng)器400繞中心軸線410旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)部件可與使生物反應(yīng)器400繞軸線 412旋轉(zhuǎn)的搖動(dòng)組件相組合。同樣地，也可以以任意組合，獨(dú)立地進(jìn)行繞不同軸線的順時(shí)針 旋轉(zhuǎn)和逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)。
[0094] 應(yīng)注意，上述搖動(dòng)裝置和它們的組件可應(yīng)用在使用任意適當(dāng)結(jié)構(gòu)的實(shí)施方式中。 例如，在實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)可用作搖動(dòng)裝置，或搖動(dòng)裝置的組件（例如402和 404)。在一個(gè)實(shí)施方式中，搖動(dòng)裝置可使用于2013年3月19日遞交的美國(guó)專利8，339，245，名 稱為《細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)及其使用方法（ROTATION SYSTEM FOR CELL GROWTH CHAMBER OF A CELL EXPANSION SYSTEM AND METHOD OF USE THEREFOR)》中 示出和描述的實(shí)施方式中的搖動(dòng)裝置，該專利通過(guò)引用而整體并入本文中，就如其全文呈 現(xiàn)在本申請(qǐng)中一樣。
[0095]圖2B和圖2A中描繪了細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的實(shí)施方式，其中描繪了中空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室200(可被稱為"生物反應(yīng)器"）的側(cè)剖視圖和側(cè)視圖。細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200被裝在細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室殼體202中。細(xì)胞生長(zhǎng)腔室殼體202進(jìn)一步包括四個(gè)開(kāi)口或端口：進(jìn)入端口 204、排出端口 206、進(jìn)入端口 208和排出端口 210。
[0096]第一循環(huán)路徑中的流體通過(guò)進(jìn)入端口 204進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200，進(jìn)入且穿過(guò)多個(gè) 中空纖維212的內(nèi)毛細(xì)管側(cè)（在各實(shí)施方式中被稱為，中空纖維膜的內(nèi)毛細(xì)管（"1C"）側(cè)或 "1C空間"），并且通過(guò)排出端口206流出細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200。術(shù)語(yǔ)"中空纖維"、"中空纖維毛細(xì) 管"以及"毛細(xì)管"可互換使用。多個(gè)中空纖維212-起被稱為"膜"。第二循環(huán)路徑中的流體 通過(guò)進(jìn)入端口 208流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中，與中空纖維212的外部(也被稱為膜的"EC側(cè)"或"EC 空間"）相接觸，并經(jīng)由排出端口 210離開(kāi)細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200。細(xì)胞可被包含在第一循環(huán)路徑 或第二循環(huán)路徑內(nèi)，并且可在膜的1C側(cè)或EC側(cè)。
[0097]盡管細(xì)胞生長(zhǎng)腔室殼體202的形狀被描繪為圓柱形，但是它可具有本領(lǐng)域已知的 任意形狀。細(xì)胞生長(zhǎng)腔室殼體202可由任意類型的生物相容性聚合物材料制成。其它各種細(xì) 胞生長(zhǎng)腔室殼體可具有不同的形狀和尺寸。
[0098] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知曉的是，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞生長(zhǎng)腔室"并不意味著在CES中生長(zhǎng)或擴(kuò) 增的所有細(xì)胞都生長(zhǎng)在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中。在許多實(shí)施方式中，貼壁細(xì)胞可附著至布置在生 長(zhǎng)腔室中的膜，或可生長(zhǎng)在相關(guān)聯(lián)的管道內(nèi)。非貼壁細(xì)胞(也被稱為"懸浮細(xì)胞"）也可生長(zhǎng)。 細(xì)胞可在第一流體循環(huán)路徑或第二流體循環(huán)路徑內(nèi)的其它區(qū)域中生長(zhǎng)。
[0099] 例如，中空纖維212的端部可通過(guò)連接材料（在本文也被稱為"灌封"或"灌封材 料"）在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200的側(cè)面被灌封。灌封可為用于粘合中空纖維212的任意合適的材 料，只要不阻塞介質(zhì)和細(xì)胞進(jìn)入中空纖維中的流動(dòng)，并且穿過(guò)1C進(jìn)入端口流入細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室200中的液體僅流入中空纖維212中。示例性的灌封材料包括但并不限于聚氨酯以及其它 合適的粘合或粘著組分。在各實(shí)施方式中，也可在每一端部通過(guò)垂直于中空纖維212的中心 軸線切割中空纖維212和灌封，以使流體流入和流出1C側(cè)。端部帽214和端部帽216被布置在 細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的端部。
[0100]經(jīng)由進(jìn)入端口 208進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)腔室200的流體與中空纖維212的外部相接觸。中 空纖維細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的這一部分也被稱為"外毛細(xì)管(EC)空間"。小分子(例如水、氧、乳酸 鹽等)可穿過(guò)中空纖維212從中空纖維的內(nèi)部擴(kuò)散至EC空間，或從EC空間擴(kuò)散至1C空間。大 分子量的分子諸如生長(zhǎng)因子通常太大而不能穿過(guò)中空纖維212,從而保持在中空纖維的1C 空間中。在細(xì)胞生長(zhǎng)在1C空間中的實(shí)施方式中，EC空間用作介質(zhì)儲(chǔ)存器，以為細(xì)胞供應(yīng)營(yíng)養(yǎng) 物并且除去細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物。根據(jù)需要可更換介質(zhì)。介質(zhì)也可穿過(guò)氧合器循環(huán)，以交換所 需的氣體。
[0101] 在各實(shí)施方式中，可通過(guò)各種方法(包括注射)將細(xì)胞加載至中空纖維212中。也可 從流體容器(例如袋子），將細(xì)胞引入到細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中，其中該流體容器可與細(xì)胞生長(zhǎng)腔 室流體相連。
[0102] 中空纖維212被配置為允許細(xì)胞生長(zhǎng)在纖維的內(nèi)毛細(xì)管空間（即，中空纖維管腔的 內(nèi)部）中。中空纖維212足夠大，能允許細(xì)胞附著在管腔上，而基本上不阻礙介質(zhì)穿過(guò)中空纖 維管腔的流動(dòng)。在各實(shí)施方式中，中空纖維的內(nèi)直徑可大于或等于約10000微米、約9000微 米、約8000微米、約7000微米、約6000微米、約5000微米、約4000微米、約3000微米、約2000微 米、約1000微米、約900微米、約800微米、約700微米、約650微米、約600微米、約550微米、約 500微米、約450微米、約400微米、約350微米、約300微米、約250微米、約200微米、約150微米 或甚至約100微米。同樣地，中空纖維的外直徑可小于或等于約10000微米、約9000微米、約 8000微米、約7000微米、約6000微米、約5000微米、約4000微米、約3000微米、約2000微米、約 1000微米、約900微米、約800微米、約700微米、約650微米、約700微米、約650微米、約600微 米、約550微米、約500微米、約450微米、約400微米、約350微米、約300微米、約250微米、約 200微米、約150微米或甚至約100微米。在一些實(shí)施方式中，中空纖維壁的厚度應(yīng)當(dāng)足以允 許小分子進(jìn)行擴(kuò)散。
[0103]只要中空纖維能與細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的進(jìn)入端口和排出端口流體相連，則可在細(xì)胞生 長(zhǎng)腔室中使用任意數(shù)目的中空纖維。在各實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)腔室可包括數(shù)目大于或等 于約 1000、約 2000、約 3000、約 4000、約 5000、約 6000、約 7000、約 8000、約 9000、約 10000、約 11000或約12000個(gè)中空纖維。在其它實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)腔室可包括數(shù)目小于或等于約 12000、約11000、約 10000、約 9000、約 8000、約 7000、約 6000、約 5000、約 4000、約 3000 或甚至 約2000個(gè)中空纖維。在其它各實(shí)施方式中，中空纖維的長(zhǎng)度可大于或等于約100毫米、約200 毫米、約300毫米、約400毫米、約500毫米、約600毫米、約700毫米、約800毫米或約900毫米。 在實(shí)施方式中，細(xì)胞生長(zhǎng)腔室含有約9000個(gè)中空纖維，這些中空纖維具有約295_的平均長(zhǎng) 度、215微米的平均內(nèi)直徑以及315微米的平均外直徑。
[0104]中空纖維可由任何能形成如下尺寸的材料構(gòu)成，該尺寸足以形成能夠?qū)⒁后w從細(xì) 胞生長(zhǎng)腔室進(jìn)入端口運(yùn)輸至細(xì)胞生長(zhǎng)腔室排出端口的纖維。在各實(shí)施方式中，中空纖維可 由塑料附著材料構(gòu)成，該塑料附著材料能夠粘合某些種類的細(xì)胞，諸如貼壁干細(xì)胞(例如 MSC)。在各其它實(shí)施方式中，中空纖維可經(jīng)諸如纖連蛋白的化合物進(jìn)行處理，以形成附著表 面。
[0105] 在某些實(shí)施方式中，中空纖維可由半通透的生物相容性聚合材料制成。這樣的一 種可使用的聚合材料為聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的共混物(在本文中也被稱為 "PA/PAES/PVP"）。半通透膜允許營(yíng)養(yǎng)物、廢物和溶解的氣體穿過(guò)在EC空間和IC空間之間的 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移。在各實(shí)施方式中，選擇中空纖維膜的分子轉(zhuǎn)移特性，以最大限度地降低從中空 纖維中丟失細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的昂貴試劑(諸如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子），同時(shí)允許代謝廢棄產(chǎn) 物穿過(guò)膜擴(kuò)散進(jìn)入中空纖維管腔側(cè)而被去除。
[0106] 在某些變型中，每一PA/PAES/PVP中空纖維的一個(gè)外層的特征在于，具有限定表面 粗糙度的均勻且開(kāi)孔的結(jié)構(gòu)?？椎拈_(kāi)口尺寸可在約0.5微米至3微米的范圍內(nèi)，并且在纖維 外表面上的孔的數(shù)目可在約10000個(gè)孔/mm 2至約150000個(gè)孔/mm2的范圍內(nèi)。該外層具有約1 微米至約10微米的厚度。在每個(gè)中空纖維中的下一層為具有海綿結(jié)構(gòu)形式的第二層，并且 在實(shí)施方式中具有約1微米至約15微米的厚度。該第二層可用作外層的支撐。緊挨著第二層 的第三層可具有指狀結(jié)構(gòu)的形式。該第三層提供了機(jī)械穩(wěn)定性和高孔隙體積，使得膜在穿 過(guò)膜運(yùn)輸分子時(shí)具有較低的阻力。在使用期間，指狀孔隙充滿流體，并且與具有較低空隙體 積的海綿填充結(jié)構(gòu)的基質(zhì)相比，該流體為擴(kuò)散和對(duì)流給出了較低的阻力。該第三層可具有 約20微米至約60微米的厚度。
[0107] 在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，中空纖維膜可包括在約65wt%至95wt%之間的至少一種 疏水性聚合物，以及在約5wt %至約35wt %之間的至少一種親水性聚合物。疏水性聚合物可 選自由聚酰胺（PA)、聚芳酰胺(PAA)、聚芳醚砜(PAES)、聚醚砜(PES)、聚砜(PSU)、聚芳砜 (PASU)、聚碳酸酯(PC)、聚醚、聚氨酯(PUR)、聚醚酰亞胺，以及任意上述聚合物的共聚物混 合物(諸如聚醚砜，或聚芳醚砜和聚酰胺的混合物)所組成的組。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，親 水性聚合物可選自由聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、聚乙二醇(PEG )、聚乙二醇單酯、水溶性纖維衍 生物、聚山梨醇酯和聚乙烯-聚丙烯氧化物共聚物所組成的組。
[0108]根據(jù)要在細(xì)胞生長(zhǎng)腔室中擴(kuò)增的細(xì)胞的類型，可使用諸如纖連蛋白的物質(zhì)對(duì)聚合 物纖維進(jìn)行處理，以增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或細(xì)胞對(duì)膜的附著。
[0109] 現(xiàn)參考圖3,示出了另一細(xì)胞生長(zhǎng)腔室的實(shí)施例，生物反應(yīng)器300的側(cè)剖視圖。生物 反應(yīng)器300具有縱軸線LA-LA，并且包括生物反應(yīng)器殼體304。在至少一個(gè)實(shí)施方式中，生物 反應(yīng)器殼體304包括四個(gè)開(kāi)口或端口 ： 1C進(jìn)入端口 308、1C排出端口320、EC進(jìn)入端口 328以及 EC排出端口 332。
[0110] 第一循環(huán)路徑中的流體通過(guò)在生物反應(yīng)器300的第一縱向端部312處的1C進(jìn)入端 口 308進(jìn)入生物反應(yīng)器300,進(jìn)入且穿過(guò)多個(gè)中空纖維316的內(nèi)毛細(xì)管側(cè)(在各種實(shí)施方式中 被稱為中空纖維膜的內(nèi)毛細(xì)管（"1C"）側(cè)或"1C空間"）并且通過(guò)位于生物反應(yīng)器300的第二 縱向端部324處的1C排出端口 320流出生物反應(yīng)器300。第二循環(huán)路徑中的流體通過(guò)EC進(jìn)入 端口328流入生物反應(yīng)器300中，與中空纖維316的外毛細(xì)管側(cè)或外部(也被稱為膜的"EC側(cè)" 或"EC空間"）相接觸，并且經(jīng)由EC排出端口 332離開(kāi)生物反應(yīng)器300。經(jīng)由EC進(jìn)入端口 328進(jìn) 入生物反應(yīng)器的流體與中空纖維的外部相接觸。小分子(例如水、氧、乳酸鹽等)可穿過(guò)中空 纖維從中空纖維的內(nèi)部擴(kuò)散至EC空間，或從EC空間擴(kuò)散至1C空間。大分子量的分子諸如生 長(zhǎng)因子通常太大而不能穿過(guò)中空纖維，從而保持在中空纖維的1C空間內(nèi)?？梢愿鶕?jù)需要更 換介質(zhì)。介質(zhì)也可穿過(guò)氧合器循環(huán)，以交換所需的氣體。細(xì)胞也可被包含在第一循環(huán)路徑 和/或第二循環(huán)路徑中，并且可在膜的1C側(cè)和/或EC側(cè)。通過(guò)示例性且非限制性的方式，在一 個(gè)實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器300可包括約11520個(gè)具有215X 10_6m的內(nèi)直徑(ID)的纖維。
[0111] 盡管生物反應(yīng)器殼體304被描繪為圓柱形，但是其可具有各種形狀，諸如長(zhǎng)方體。 生物反應(yīng)器殼體304可由任意類型的生物相容性聚合物材料制成，包括基本透明的材料，以 允許觀察者觀察多個(gè)中空纖維316中的一個(gè)或多個(gè)以及在生物反應(yīng)器殼體304內(nèi)的流體。各 種其它的生物反應(yīng)器殼體可具有不同的形狀和尺寸。
[0112] 現(xiàn)在參考圖4,示出了CES430的一部分的透視圖，該CES430的一部分包括CES430的 主體408的后部434。為了清晰起見(jiàn)，主體408的前部未示出，然而，前部諸如通過(guò)鉸鏈438附 接至后部434，從而允許前部包括門或艙口，可打開(kāi)該門或艙口以進(jìn)入CES430的生物反應(yīng)器 300。管道和取樣端口 420的線管416可附接至生物反應(yīng)器300。在生物反應(yīng)器300附近的環(huán)境 為溫控的，以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供合適的條件。
[0113] 現(xiàn)在參考圖5,示出了描述與使用CES相關(guān)的細(xì)胞擴(kuò)增程序的一個(gè)實(shí)施方式的流程 圖500,其中包括與在生物反應(yīng)器(例如生物反應(yīng)器300)中加載和分布細(xì)胞相關(guān)的步驟，下 面將進(jìn)行進(jìn)一步描述。盡管CES(例如CES430)的特征被描述為執(zhí)行流程圖500的一些步驟， 但是本發(fā)明并不限于此。事實(shí)上，一些實(shí)施方式中，可利用具有不同的特征的其它CES，這些 特征未在本文中描述或在上面描述(例如CES10、CES800或CES900)。因此，參考CES430(諸如 生物反應(yīng)器300)的特征僅提供用于解釋說(shuō)明的目的，流程圖500并不限于用于任何特定的 CES〇
[0114] 流程圖500起始于502并且轉(zhuǎn)到504,其中生物反應(yīng)器300和任意相關(guān)聯(lián)的管道以及 相關(guān)的結(jié)構(gòu)與主體408連接，以提供可操作的CES430。一旦與主體408連接，在508處，利用合 適的預(yù)補(bǔ)液(priming fluid)(諸如生理鹽水）啟動(dòng)生物反應(yīng)器300和其相關(guān)聯(lián)的管道和相 關(guān)的結(jié)構(gòu)。在512處，將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300中，并且進(jìn)行分布。
[0115] 在實(shí)施方式中，細(xì)胞的加載和分布涉及許多子步驟，例如，在一些實(shí)施方式中，步 驟512額外地包括可選子步驟:在可選子步驟516處，使生物反應(yīng)器300定向在第一取向；隨 后，在可選子步驟520處，將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300中并且進(jìn)行分布。在可選子步驟524 處，可允許細(xì)胞附著至生物反應(yīng)器。
[0116] 將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300中并且進(jìn)行分布之后，在528處細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。也就 是說(shuō)，允許生物反應(yīng)器300中的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即生長(zhǎng)和/或增殖。在532處，對(duì)是否需要將額 外的細(xì)胞加入至生物反應(yīng)器300中，和/或是否需要旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器300以在生物反應(yīng)器300 內(nèi)分布細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果需要將額外的細(xì)胞加載至生物反應(yīng)器300中，和/或如果需要在 生物反應(yīng)器300中進(jìn)行細(xì)胞的分布，則隨后流程圖500返回至步驟512。如果不需要加入細(xì)胞 和/或不需要旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器300,則在536處對(duì)細(xì)胞擴(kuò)增程序528是否完成進(jìn)行評(píng)價(jià)。如本 文所使用的，如果已經(jīng)達(dá)到了足夠數(shù)目的細(xì)胞和/或已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞特性的改變，則確定細(xì) 胞擴(kuò)增程序完成。如果細(xì)胞擴(kuò)增程序528完成，則在540處收獲細(xì)胞。如果細(xì)胞擴(kuò)增程序528 沒(méi)有完成，則隨后允許在528處繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增程序。流程圖500終止于544。
[0117] 現(xiàn)在將提供與程序有關(guān)的其他細(xì)節(jié)，該程序在一些實(shí)施方式中，可用于在生物反 應(yīng)器和CES中加載、分布和擴(kuò)增細(xì)胞，例如步驟512和步驟528(圖5)。圖6和圖7示出可用于加 載、分布、附著和擴(kuò)增細(xì)胞的一些程序的流程圖。可作為流程圖500的程序的一部分進(jìn)行這 些程序，例如上述步驟(例如步驟512和步驟528)的子步驟。在其他實(shí)施方式中，可在不考慮 流程圖500中所述步驟的情況下，執(zhí)行流程圖600和流程圖700所述的程序。此外，下面可將 流程圖600和流程圖700中的步驟描述為通過(guò)CES或其部分(例如CES10、CES800、CES900)來(lái) 執(zhí)行或關(guān)于CES或其部分（例如CES10、CES800、CES900)來(lái)執(zhí)行，其中CES或其部分（例如 CES10、CES800、CES900)包括多個(gè)組件(例如用作搖動(dòng)組件402和搖動(dòng)組件404的馬達(dá)）、生物 反應(yīng)器(例如生物反應(yīng)器24、生物反應(yīng)器300、生物反應(yīng)器400、生物反應(yīng)器801或生物反應(yīng)器 908)，或生物反應(yīng)器的多個(gè)部件。本說(shuō)明書(shū)并不在于限制流程圖600和流程圖700,在實(shí)施方 式中，流程圖600和流程圖700的步驟可通過(guò)或關(guān)于其他系統(tǒng)、裝置、組件或零件來(lái)執(zhí)行。
[0118] 流程圖600起始于604,并且轉(zhuǎn)到步驟608,在步驟608中含細(xì)胞的流體可穿過(guò)生物 反應(yīng)器(諸如生物反應(yīng)器300)(參見(jiàn)圖3和圖8~圖12)循環(huán)。在實(shí)施方式中，步驟608可涉及 啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)栗，以使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。例如，可啟動(dòng)1C循環(huán)栗(例如812或 911)，以使流體以第一循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300的1C側(cè)循環(huán)。在至少一個(gè)實(shí)施方式中， 攜帶細(xì)胞的流體可從1C側(cè)經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器300的中空纖維流至EC側(cè)。在其他實(shí)施方式中，可 將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300的EC側(cè)中，并且使攜帶細(xì)胞的流體從EC側(cè)流至1C側(cè)。在這些實(shí) 施方式中，可啟動(dòng)EC循環(huán)栗(例如828或974)，以使流體以第一循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300 的EC側(cè)
[0119] 在一些實(shí)施方式中，步驟608還可涉及使生物反應(yīng)器300以特定順序旋轉(zhuǎn)，輔助細(xì) 胞穿過(guò)生物反應(yīng)器300和可與生物反應(yīng)器300流體相連的CES的循環(huán)路徑進(jìn)行分布。在于 2010年12月15日遞交的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)12/968,483,名稱為"在細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物 反應(yīng)器中加載和分布細(xì)胞的方法（METHOD OF LOADING AND DISTRIBUTING CELLS IN A BIOREACTOR OF A CELL EXPANSION SYSTEM)"中描述了用于使生物反應(yīng)器300以特定順序 旋轉(zhuǎn)以在循環(huán)或加載過(guò)程中輔助細(xì)胞分布的實(shí)施方式的實(shí)例，該專利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并 入本文中，就如其全文呈現(xiàn)在本申請(qǐng)中一樣。在其他實(shí)施方式中，循環(huán)步驟608可涉及在一 些時(shí)間段中使生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)，而在其他時(shí)間段中使生物反應(yīng)器300維持靜止。
[0120] 在步驟608之后，在步驟612降低流體循環(huán)速度?？蓪⒀h(huán)速度降低至約零(0)ml/ min，或者在其他實(shí)施方式中，可將循環(huán)速度降低至高于零(0)ml/min，但仍然允許細(xì)胞沉淀 并且附著至生物反應(yīng)器300(例如生物反應(yīng)器300的中空纖維316的內(nèi)表面）的速度。在實(shí)施 方式中，步驟612可涉及停止或關(guān)閉一個(gè)或多個(gè)在步驟608中使用以使流體循環(huán)的栗。
[0121] 流程從步驟612轉(zhuǎn)到可選步驟616,可執(zhí)行可選步驟616以將生物反應(yīng)器(例如生物 反應(yīng)器300)的方向調(diào)整至初始取向。在實(shí)施方式中，可能已經(jīng)將生物反應(yīng)器調(diào)整為初始取 向，這樣使得步驟616是不必要的。當(dāng)執(zhí)行時(shí)，可通過(guò)實(shí)施方式中的一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)執(zhí)行步 驟 616。
[0122] 現(xiàn)在參考圖8~圖12,圖8中示出的生物反應(yīng)器300位于初始取向。作為可選步驟 616的一部分，可以使生物反應(yīng)器300處于起始取向的縱向軸線LA-LA來(lái)定向，所述起始取向 例如如圖8中示出的第一水平取向。
[0123] 流程從步驟616轉(zhuǎn)到步驟620,在步驟620中，將生物反應(yīng)器維持在第一取向以允許 細(xì)胞沉淀，并且在一些實(shí)施方式中，允許細(xì)胞附著至生物反應(yīng)器300的第一區(qū)。執(zhí)行步驟 620,持續(xù)第一預(yù)定時(shí)間段。
[0124] 現(xiàn)在參考圖13A~圖13C，這些附圖示出中空纖維1300的（取與中空纖維1300的中 心軸線和生物反應(yīng)器300的中心軸線垂直的）橫截面，該中空纖維1300可以是生物反應(yīng)器 300的中空纖維316中的一個(gè)。這些附圖示出在流程圖600的一些步驟期間，細(xì)胞在中空纖維 316內(nèi)的可能的位置。如圖13A所示，在實(shí)施方式中，在步驟612處降低循環(huán)速度之前，各中空 纖維1300內(nèi)的細(xì)胞可均勻分布在中空纖維1300容積的各個(gè)部分中。當(dāng)降低循環(huán)速度時(shí)，細(xì) 胞開(kāi)始受到重力1304的影響，并且開(kāi)始沉淀。
[0125] 在實(shí)施方式中，隨著生物反應(yīng)器300處于第一水平取向（圖8)，允許生物反應(yīng)器300 內(nèi)的細(xì)胞沉淀在生物反應(yīng)器的第一區(qū)上。如圖13B所示，生物反應(yīng)器300的第一區(qū)可至少包 括中空纖維1300的區(qū)1308。在實(shí)施方式中，允許細(xì)胞沉淀第一預(yù)定時(shí)間段(流程圖600的步 驟620)，可對(duì)該第一預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，使得不僅允許細(xì)胞沉淀，而且還允許細(xì)胞附著至 中空纖維1300的區(qū)1308。
[0126] 在一些實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以僅允許細(xì)胞沉淀 和附著至區(qū)1308。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可僅需要移動(dòng)中空纖維1308的內(nèi)徑的距離。例 如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內(nèi)徑的實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可 小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可 大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一時(shí) 間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0127] 在其他實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以不僅允許細(xì)胞沉 淀而且還允許細(xì)胞附著至中空纖維，該第一預(yù)定時(shí)間段可持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許附著的 細(xì)胞生長(zhǎng)。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可側(cè)向生長(zhǎng)。因?yàn)槿我粋?cè)向可提供最小的阻力。換句話 說(shuō)，因?yàn)槿绻趨^(qū)1308上的細(xì)胞在纖維壁上朝上生長(zhǎng)的話，則這些細(xì)胞要對(duì)抗重力1304進(jìn) 行生長(zhǎng)，因此相信在一些實(shí)施方式中，這些細(xì)胞至少最初是側(cè)向生長(zhǎng)的。在這些實(shí)施方式 中，當(dāng)允許細(xì)胞在附著之后進(jìn)行生長(zhǎng)時(shí)，第一預(yù)定時(shí)間段可大于約5小時(shí)、大于約10小時(shí)、大 于約15小時(shí)、大于約20小時(shí)或甚至大于約24小時(shí)。在其他實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可小 于約60小時(shí)、小于約55小時(shí)、小于約50小時(shí)或甚至小于約45小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述 預(yù)定時(shí)間段可在約1 〇小時(shí)至約48小時(shí)之間。
[0128] 重新參考圖6，在一些實(shí)施方式中，在步驟620之后，流程轉(zhuǎn)到步驟640，在步驟640 中，生物反應(yīng)器300從第一水平取向旋轉(zhuǎn)約180度至第二水平取向。如圖8~圖10所示，可通 過(guò)首先從第一水平取向（圖8)旋轉(zhuǎn)至距第一水平取向約90度的第一豎直取向，例如軸線LA-LA 處于豎直取向 （圖 9)，來(lái)旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器。然后，將生物反應(yīng)器 300 再旋轉(zhuǎn) 90度 （圖 10)， 以 完成到第二水平取向的旋轉(zhuǎn)。
[0129] 在實(shí)施方式中，在旋轉(zhuǎn)到第二水平取向之后，流程600可轉(zhuǎn)到步驟644，在步驟644 中，在生物反應(yīng)器300處于第二水平取向的同時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。圖13C示出在第二水平取向 時(shí)，附著至中空纖維1300的細(xì)胞現(xiàn)在位于中空纖維1300的內(nèi)側(cè)頂部。步驟644可涉及一些子 步驟，諸如將流體循環(huán)到生物反應(yīng)器中，以為附著在生物反應(yīng)器中的細(xì)胞供給和提供營(yíng)養(yǎng)。 可以理解的是，步驟644還可涉及為細(xì)胞提供氧氣，以便它們能夠增殖?？煽刂粕锓磻?yīng)器 中的幾種其他參數(shù)，以優(yōu)化擴(kuò)增，即細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，步驟644可包括使流體 持續(xù)循環(huán)約24小時(shí)、約36小時(shí)、約48小時(shí)、約60小時(shí)或甚至約72小時(shí)，以飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí) 施方式中，作為步驟644的一部分，細(xì)胞的飼養(yǎng)可持續(xù)小于約120小時(shí)、小于約108小時(shí)、小于 約96小時(shí)、小于約84小時(shí)或甚至小于約72小時(shí)。然后，流程600可終止于648。
[0130] 在不受到理論束縛的情況下，相信在實(shí)施方式中，如果細(xì)胞如圖13C所示在重力影 響下生長(zhǎng)，則能改善細(xì)胞擴(kuò)增。在實(shí)施方式中，細(xì)胞可在中空纖維1300中向下生長(zhǎng)，朝中空 纖維中還沒(méi)有細(xì)胞的部分生長(zhǎng)。相信細(xì)胞可朝纖維中提供最小阻力的部分（諸如在頂部 1308下面的部分，參見(jiàn)圖13C)生長(zhǎng)。在實(shí)施方式中，與傳統(tǒng)工藝相比，在重力影響下的生長(zhǎng) 改善了細(xì)胞產(chǎn)量，并且縮短了細(xì)胞倍增的時(shí)間。
[0131] 在其他實(shí)施方式中，流程600可包括額外的步驟。例如，在一些實(shí)施方式中，在步驟 620之后，流程600可轉(zhuǎn)到步驟624，在步驟624中，可將生物反應(yīng)器628旋轉(zhuǎn)至豎直取向。例 如，如圖9所示，可將生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)至第一豎直取向。在步驟624之后，流程可轉(zhuǎn)到步驟 628,在步驟628中，可使生物反應(yīng)器在第一豎直取向上維持第二預(yù)定時(shí)間段。
[0132] 現(xiàn)在參考圖13D和圖13E，這些圖示出中空纖維1300的（取與中空纖維1300的中心 軸線和生物反應(yīng)器300的中心軸線平行的）橫截面，該中空纖維1300可以是生物反應(yīng)器300 的中空纖維316中的一個(gè)。圖13D和圖13E示出在步驟620之后的中空纖維1300,其中細(xì)胞已 經(jīng)沉淀且附著至纖維1300的一部分上。如圖13D所示，當(dāng)生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)至第一豎直取 向時(shí)，中空纖維1300的第一端部1312位于第二端部1316的上面。
[0133] 如上所述，在不受到理論束縛的情況下，相信附著至纖維1300的細(xì)胞將受到重力 1304的影響，開(kāi)始生長(zhǎng)，即朝端部1316縱向擴(kuò)增。因此，在實(shí)施方式中，持續(xù)第二預(yù)定時(shí)間段 執(zhí)行步驟628(維持第一豎直取向），該第二預(yù)定時(shí)間短可持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許細(xì)胞縱 向生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可大于約5小時(shí)、大于約10小時(shí)、大于約15小 時(shí)、大于約20小時(shí)或甚至大于約24小時(shí)。在其他實(shí)施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可小于約60小 時(shí)、小于約55小時(shí)、小于約50小時(shí)或甚至小于約45小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述預(yù)定時(shí)間 段可在約10小時(shí)至約48小時(shí)之間。
[0134] 在步驟628之后，流程可轉(zhuǎn)到步驟632,在步驟632中，可將生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)至第二 豎直取向。圖12中示出處于第二豎直取向的生物反應(yīng)器300的一個(gè)實(shí)例。在步驟624之后，流 程可轉(zhuǎn)到步驟636,在步驟636中，可使生物反應(yīng)器在第二豎直取向上維持第三預(yù)定時(shí)間段。
[0135] 參考圖13E，該圖示出在步驟632之后的中空纖維1300,其中細(xì)胞已經(jīng)沉淀且附著 至中空纖維1300的一部分上，并且已經(jīng)使生物反應(yīng)器300從第一豎直取向旋轉(zhuǎn)至第二豎直 取向并且維持在第二豎直取向上。如圖13E所示，當(dāng)使生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)至第二豎直取向 時(shí)，中空纖維1300的第一端部1312位于第二端部1316的下面。
[0136] 與步驟628(維持第一豎直取向）相似，執(zhí)行步驟636(維持第二豎直取向），因?yàn)橄?信在實(shí)施方式中，附著至纖維1300的細(xì)胞將受到重力1304的影響，開(kāi)始生長(zhǎng)，即朝端部1312 縱向擴(kuò)增。在實(shí)施方式中，如圖13E所示，可執(zhí)行步驟636,持續(xù)第三預(yù)定時(shí)間段，該第三預(yù)定 時(shí)間段可持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間以允許細(xì)胞朝端部1312縱向生長(zhǎng)。在一些實(shí)施方式中，第三預(yù) 定時(shí)間段可大于約5小時(shí)、大于約10小時(shí)、大于約15小時(shí)、大于約20小時(shí)或甚至大于約24小 時(shí)。在其他實(shí)施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可小于約60小時(shí)、小于約55小時(shí)、小于約50小時(shí)或 甚至小于約45小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施方式中，上述預(yù)定時(shí)間段可在約10小時(shí)至約48小時(shí)之間。
[0137] 重新參考流程圖600，在步驟636之后，流程可轉(zhuǎn)到步驟640，在步驟640中，如上所 述，可使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)到如圖11所示的第二水平位置。如上所述，流程600從步驟640轉(zhuǎn)到 644，在644中，細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即增殖。然后，流程終止于648。
[0138] 現(xiàn)在轉(zhuǎn)到圖7,流程700在704開(kāi)始，然后轉(zhuǎn)到步驟708,在步驟708中，含細(xì)胞的流體 可穿過(guò)生物反應(yīng)器(諸如生物反應(yīng)器300)進(jìn)行循環(huán)(參見(jiàn)圖3和圖8~圖12)。在實(shí)施方式中， 步驟708可包括啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)栗，以使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。例如，可啟動(dòng)1C循環(huán) 栗(例如812或911)，以使流體以第一循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300的1C側(cè)循環(huán)。在至少一個(gè) 實(shí)施方式中，攜帶細(xì)胞的流體可經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器300的中空纖維從1C側(cè)流到EC側(cè)。在其他實(shí) 施方式中，可將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300的EC側(cè)中，并且使攜帶細(xì)胞的流體從EC側(cè)流到1C 側(cè)。在這些實(shí)施方式中，可啟動(dòng)EC循環(huán)栗(例如828或974)，以使流體以第一循環(huán)流速穿過(guò)生 物反應(yīng)器300的EC側(cè)循環(huán)。
[0139] 在實(shí)施方式中，第一循環(huán)流速可以是相對(duì)較高的流速。在實(shí)施方式中，第一循環(huán)流 速可小于約500ml/min、小于約400ml/min或甚至小于約300ml/min。在其他實(shí)施方式中，第 一循環(huán)速度可大于約50ml/min、大于約100ml/min或甚至大于約150ml/min。在一個(gè)實(shí)施方 式中，第一循環(huán)流速在約l〇〇ml/min至約300ml/min之間，諸如約200ml/min。
[0140] 在一些實(shí)施方式中，步驟708可還涉及使生物反應(yīng)器300以特定順序旋轉(zhuǎn)，以促使 細(xì)胞穿過(guò)生物反應(yīng)器300和CES的循環(huán)路徑進(jìn)行分布，其中生物反應(yīng)器300可與CES的循環(huán)路 徑流體相連。在其他實(shí)施方式中，循環(huán)步驟708可涉及使生物反應(yīng)器300在一些時(shí)間段中旋 轉(zhuǎn)，但使生物反應(yīng)器300在其他時(shí)間段中保持靜止。
[0141] 在步驟708之后，在步驟712處降低流體循環(huán)速度?？蓪⒀h(huán)速度降低至約零(0) ml/min，或者在其他實(shí)施方式中，可將循環(huán)速度降低至大于零(0)ml/min但仍允許細(xì)胞沉淀 且附著至生物反應(yīng)器300,例如生物反應(yīng)器300的中空纖維316的內(nèi)表面的速度。在實(shí)施方式 中，步驟712可涉及停止或關(guān)閉在步驟708中用于使流體循環(huán)的一個(gè)或多個(gè)栗。
[0142] 流程從步驟712轉(zhuǎn)到可選步驟716,執(zhí)行可選步驟716以將生物反應(yīng)器(例如生物反 應(yīng)器300)的方向調(diào)整為初始取向。在實(shí)施方式中，生物反應(yīng)器可能已經(jīng)處于初始取向，這樣 就不需要執(zhí)行步驟716。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)執(zhí)行步驟716時(shí)，可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)執(zhí)行 步驟716。
[0143] 現(xiàn)在參考圖8~圖12,在圖8中示出的生物反應(yīng)器300位于初始取向。作為可選步驟 716的一部分，可使生物反應(yīng)器300的縱向軸線LA-LA處于起始取向，例如如圖8所示的水平 取向。
[0144] 流程從716轉(zhuǎn)到步驟720，在步驟720中，使生物反應(yīng)器維持在第一取向上以允許細(xì) 胞沉淀，并且在一些實(shí)施方式中附著至生物反應(yīng)器300的第一部分。執(zhí)行步驟820,持續(xù)第一 預(yù)定時(shí)間段。
[0145] 現(xiàn)在參考圖14A~圖14D和圖15A~圖15F，這些附圖示出中空纖維1400的（取與中 空纖維1400的中心軸線和生物反應(yīng)器300的中心軸線垂直的)橫截面，該中空纖維1400可以 是生物反應(yīng)器300的中空纖維316中的一個(gè)。這些附圖示出在流程圖700的一些步驟期間，細(xì) 胞在中空纖維316內(nèi)的可能的位置。如圖14A所示，在實(shí)施方式中，在步驟712處降低循環(huán)速 度之前，各中空纖維1400內(nèi)的細(xì)胞可均勻分布在中空纖維1400的整個(gè)體積。當(dāng)降低循環(huán)速 度時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始受到重力1404的影響，開(kāi)始沉淀。圖15A也示出對(duì)于中空纖維1500和重力 1504的類似的情況。
[0146] 在實(shí)施方式中，隨著生物反應(yīng)器300處于第一水平取向（圖8)，允許生物反應(yīng)器300 內(nèi)的細(xì)胞沉淀在生物反應(yīng)器的第一區(qū)上。如圖14B和圖15B所示，生物反應(yīng)器300的第一區(qū)可 至少包括中空纖維1400的區(qū)1408和/或中空纖維1500中的區(qū)1508。在實(shí)施方式中，允許細(xì)胞 沉淀第一預(yù)定時(shí)間段，可對(duì)該第一預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，使得不僅允許細(xì)胞沉淀，而且還允 許細(xì)胞附著至中空纖維1400的區(qū)1408 (和中空纖維1500的區(qū)1508)。
[0147] 在一些實(shí)施方式中，第一預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許細(xì)胞沉淀和 附著至區(qū)1408和區(qū)1508。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可僅需要移動(dòng)中空纖維1400或中空纖維 1500的內(nèi)徑的距離。例如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內(nèi)徑的實(shí)施方式 中，第一預(yù)定時(shí)間段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實(shí)施方式 中，第一預(yù)定時(shí)間段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一 個(gè)實(shí)施方式中，第一時(shí)間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0148] 在步驟720之后，流程轉(zhuǎn)到步驟724，在步驟724中，可使生物反應(yīng)器300自第一水平 取向旋轉(zhuǎn)約180度至第二水平取向。如圖8~圖10所示，可通過(guò)首先從其第一水平取向（圖8) 旋轉(zhuǎn)至距第一水平取向約90度的第一豎直取向，例如軸線LA-LA處于豎直取向（圖9)，來(lái)旋 轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器。然后，將生物反應(yīng)器300再旋轉(zhuǎn)90度（圖10)，以完成到第二水平取向的旋轉(zhuǎn)。 在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)與生物反應(yīng)器300連接的一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)來(lái)執(zhí)行步驟724。這些 馬達(dá)可以是搖動(dòng)裝置的一部分。
[0149] 在一些實(shí)施方式中，流程700從步驟724轉(zhuǎn)到步驟736,在步驟736中，將生物反應(yīng)器 300在第二水平取向（圖10)上維持第二預(yù)定時(shí)間段，以允許細(xì)胞沉淀至生物反應(yīng)器的第二 區(qū)，諸如中空纖維1400的區(qū)1412(圖14C)或中空纖維1500的區(qū)1512(圖15C)。
[0150] 在一些實(shí)施方式中，在步驟736之前，流程700可包括可選的步驟728和步驟732。與 步驟708類似，步驟728使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。在實(shí)施方式中，步驟728可涉及啟動(dòng) 一個(gè)或多個(gè)栗，以使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。如上所述，可啟動(dòng)1C循環(huán)栗(例如812或 911)，以使流體以第二循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300的1C側(cè)循環(huán)。在至少一個(gè)實(shí)施方式中， 攜帶細(xì)胞的流體可經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器300的中空纖維從1C側(cè)流到EC側(cè)。在其他實(shí)施方式中，可 將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300的EC側(cè)中，并且使攜帶細(xì)胞的流體從EC側(cè)流到1C側(cè)。在這些實(shí) 施方式中，可啟動(dòng)EC循環(huán)栗(例如828或974)，以使流體以第二循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300 的EC側(cè)循環(huán)。
[0151] 在實(shí)施方式中，第二循環(huán)流速可小于第一循環(huán)速度。在實(shí)施方式中，第二循環(huán)流速 可小于約400ml/min、小于約300ml/min或甚至小于約200ml/min。在其他實(shí)施方式中，第二 循環(huán)速度可大于約25ml/min、大于約500ml/min或甚至大于約75ml/min。在一個(gè)實(shí)施方式 中，第二循環(huán)流速在約50ml/min至約150ml/min之間，諸如約100ml/min。
[0152] 在一些實(shí)施方式中，步驟728可還涉及以與步驟708中的循環(huán)方向不同的方向進(jìn)行 循環(huán)。換句話說(shuō)，在一些實(shí)施方式中，步驟708可涉及使流體以逆時(shí)針?lè)较蜓h(huán)(參見(jiàn)圖8和 圖9中的1C環(huán)路）。在一些實(shí)施方式中，在步驟728處的循環(huán)可以是順時(shí)針的。換句話說(shuō)，上述 循環(huán)可以與步驟708處的循環(huán)相反地流動(dòng)。在其他實(shí)施方式中，步驟708中的循環(huán)可以與步 驟708相同的方向，順時(shí)針或逆時(shí)針流動(dòng)。
[0153] 在一些實(shí)施方式中，可選步驟728還涉及使生物反應(yīng)器300以特定順序旋轉(zhuǎn)，以促 使細(xì)胞穿過(guò)生物反應(yīng)器300和CES的循環(huán)路徑進(jìn)行分布，其中生物反應(yīng)器300可與CES的循環(huán) 路徑流體相連。在其他實(shí)施方式中，循環(huán)步驟728可涉及使生物反應(yīng)器300在一些時(shí)間段中 旋轉(zhuǎn)，但使生物反應(yīng)器300在其他時(shí)間段中保持靜止。
[0154] 在可選步驟728之后，在步驟732處再一次降低流體循環(huán)速度?？蓪⒀h(huán)速度降低 至約零(〇)ml/min，或者在其他實(shí)施方式中，可將循環(huán)速度降低至大于零(0)ml/min但仍允 許細(xì)胞沉淀且附著至生物反應(yīng)器300，例如生物反應(yīng)器300的中空纖維316的內(nèi)表面的速度。 在實(shí)施方式中，步驟732可涉及停止或關(guān)閉在步驟728中用于使流體循環(huán)的一個(gè)或多個(gè)栗。
[0155] 再一次參考步驟736,使生物反應(yīng)器維持在第二水平取向允許細(xì)胞沉淀在可與區(qū) 1408相對(duì)的區(qū)1412(或圖15C的1512)上，例如可將區(qū)1408(或1508)稱為"底部"，而將區(qū)1412 (或圖15C中的1512)稱為"頂部"。圖14C和圖15C示出細(xì)胞沉淀在區(qū)1412和區(qū)1512上，或者在 一些實(shí)施方式中相反。在實(shí)施方式中，允許細(xì)胞沉淀第二預(yù)定時(shí)間段，可對(duì)第二預(yù)定時(shí)間段 進(jìn)行選擇，以不僅允許細(xì)胞沉淀，而且還允許細(xì)胞附著至中空纖維1400的區(qū)1412(或纖維 1500的1512)。
[0156] 在一些實(shí)施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許細(xì)胞沉淀且 附著至區(qū)1412(或圖15C中1512)。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可僅需要移動(dòng)中空纖維1400或中 空纖維1500的內(nèi)徑的距離。例如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內(nèi)徑的實(shí) 施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實(shí) 施方式中，第二預(yù)定時(shí)間段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分 鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，第二時(shí)間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0157] 在一些實(shí)施方式中，在步驟736之后，流程700可轉(zhuǎn)到步驟772,在步驟772中，細(xì)胞 進(jìn)行擴(kuò)增。步驟772可涉及許多子步驟，諸如使流體循環(huán)到生物反應(yīng)器中，以為附著在生物 反應(yīng)器中的細(xì)胞供給和提供營(yíng)養(yǎng)?？梢岳斫獾氖?，步驟772還可涉及為細(xì)胞提供氧氣，以便 它們能夠增殖。可控制生物反應(yīng)器中的幾種其他參數(shù)，以優(yōu)化擴(kuò)增，即細(xì)胞的生長(zhǎng)。在一些 實(shí)施方式中，步驟772可包括使流體持續(xù)循環(huán)約24小時(shí)、約36小時(shí)、約48小時(shí)、約60小時(shí)或甚 至約72小時(shí)以飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，作為步驟772的一部分，細(xì)胞的飼養(yǎng)可持續(xù)小 于約120小時(shí)、小于約108小時(shí)、小于約96小時(shí)、小于約84小時(shí)或甚至小于約72小時(shí)。然后，流 程終止于776。
[0158] 在其他實(shí)施方式中，流程700可轉(zhuǎn)到步驟740，在步驟740中，生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)回 到其初始的第一水平取向。圖11示出已經(jīng)旋轉(zhuǎn)回到其第一水平取向的生物反應(yīng)器300。可通 過(guò)與生物反應(yīng)器300連接的一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)執(zhí)行步驟740。這些馬達(dá)可以是搖動(dòng)裝置的一部 分。在實(shí)施方式中，流程可從步驟740轉(zhuǎn)到步驟772,在步驟772中，細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。然后，流程 終止于776。
[0159]在其他實(shí)施方式中，流程700從步驟740轉(zhuǎn)到步驟744,或在其他實(shí)施方式中，流程 可直接從步驟736轉(zhuǎn)到步驟744(當(dāng)不執(zhí)行額外旋轉(zhuǎn)時(shí)），其中使流體以第三循環(huán)流速再次循 環(huán)。與步驟708和步驟728類似，使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。在實(shí)施方式中，步驟744可 涉及啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)栗，以使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。如上所述，可啟動(dòng)1C循環(huán)栗(例 如812或911)，以使流體以第三循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300的1C側(cè)循環(huán)。在至少一個(gè)實(shí)施 方式中，攜帶細(xì)胞的流體可經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器300的中空纖維從1C側(cè)流到EC側(cè)。在其他實(shí)施方 式中，可將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300的EC側(cè)中，并且使攜帶細(xì)胞的流體從EC側(cè)流到1C側(cè)。 在這些實(shí)施方式中，可啟動(dòng)EC循環(huán)栗(例如828或974)，以使流體以第三循環(huán)流速穿過(guò)生物 反應(yīng)器300的EC側(cè)循環(huán)。
[0160]在實(shí)施方式中，第三循環(huán)流速可小于第二循環(huán)速度。在實(shí)施方式中，第三循環(huán)流速 可小于約200ml/min、小于約150ml/min或甚至小于約100ml/min。在其他實(shí)施方式中，第三 循環(huán)速度可大于約1〇1111/111；[11、大于約201]11/1]1；[11或甚至大于約301]11/1]1；[11。在一個(gè)實(shí)施方式中， 第三循環(huán)流速在約20ml/min至約100ml/min之間，諸如約50ml/min。
[0161] 在一些實(shí)施方式中，步驟744可還涉及以與步驟728中的循環(huán)方向不同的方向進(jìn)行 循環(huán)。換句話說(shuō)，在一些實(shí)施方式中，步驟728可涉及使流體以順時(shí)針?lè)较蜓h(huán)。在一些實(shí)施 方式中，在步驟744處的循環(huán)可以與步驟708類似，并且是逆時(shí)針?lè)较颍▍⒁?jiàn)圖8和圖9中的1C 環(huán)路）。換句話說(shuō)，步驟744處的循環(huán)可以與步驟728處的循環(huán)相反地流動(dòng)，并且與步驟708的 循環(huán)方向相同。在其他實(shí)施方式中，步驟708、步驟728、步驟744中的循環(huán)可以相同方向，順 時(shí)針或逆時(shí)針流動(dòng)。
[0162] 在一些實(shí)施方式中，可選步驟744還涉及使生物反應(yīng)器300以特定順序旋轉(zhuǎn)，以促 使細(xì)胞穿過(guò)生物反應(yīng)器300和CES的循環(huán)路徑進(jìn)行分布，其中生物反應(yīng)器300可與CES的循環(huán) 路徑流體相連。在其他實(shí)施方式中，循環(huán)步驟744可涉及使生物反應(yīng)器300在一些時(shí)間段中 旋轉(zhuǎn)，但使生物反應(yīng)器300在其他時(shí)間段中保持靜止。
[0163] 流程從744轉(zhuǎn)到步驟748,在步驟748中，再一次降低流體循環(huán)速度?？蓪⒀h(huán)速度 降低至約零(〇)ml/min，或者在其他實(shí)施方式中，可將循環(huán)速度降低至大于零(0)ml/min但 仍允許細(xì)胞沉淀且附著至生物反應(yīng)器300,例如生物反應(yīng)器300的中空纖維316的內(nèi)表面的 速度。在實(shí)施方式中，步驟748可涉及停止或關(guān)閉在步驟744中用于使流體循環(huán)的一個(gè)或多 個(gè)栗。
[0164] 流程從步驟748轉(zhuǎn)到步驟752,在步驟752中，使生物反應(yīng)器維持在水平取向。在包 括步驟744(旋轉(zhuǎn)到第一取向）的實(shí)施方式中，步驟752涉及維持第一水平取向。在不包括步 驟740的旋轉(zhuǎn)的實(shí)施方式中，步驟752涉及維持第二水平取向。在任何情況中，都執(zhí)行步驟 752以允許細(xì)胞再次沉淀在如區(qū)1508(參見(jiàn)圖15D和圖15E，如果執(zhí)行旋轉(zhuǎn)步驟740)上。在實(shí) 施方式中，允許細(xì)胞沉淀第三預(yù)定時(shí)間段，可對(duì)該第三預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以不僅允許細(xì) 胞沉淀，而且還允許細(xì)胞附著。
[0165] 在一些實(shí)施方式中，第三預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以僅允許細(xì)胞沉淀 和附著至區(qū)1508。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可僅需要移動(dòng)中空纖維1500的內(nèi)徑的距離。例 如，在中空纖維1500具有約150微米至約300微米之間的內(nèi)徑的實(shí)施方式中，第三預(yù)定時(shí)間 段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實(shí)施方式中，第三預(yù)定時(shí)間 段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，第 三時(shí)間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0166] 在一些實(shí)施方式中，流程700可從步驟752轉(zhuǎn)到步驟772，在步驟772中，細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò) 增。圖15F示出這些實(shí)施方式中的纖維1500。然后，流程終止于776。
[0167] 在其他實(shí)施方式中，如下所述，在移動(dòng)到擴(kuò)增細(xì)胞的步驟772之前，流程700可包括 額外的旋轉(zhuǎn)（756)、循環(huán)（760)、降低循環(huán)（764)和維持取向（768)的步驟。在這些實(shí)施方式 中，流程700可從步驟752轉(zhuǎn)到步驟756,如果在步驟740旋轉(zhuǎn)到第一水平取向的話，在步驟 756中，使生物反應(yīng)器300旋轉(zhuǎn)回到第二水平取向。圖10示出處于第二水平取向的生物反應(yīng) 器300?？赏ㄟ^(guò)與生物反應(yīng)器300連接的一個(gè)或多個(gè)馬達(dá)執(zhí)行步驟756。這些馬達(dá)可以是搖動(dòng) 裝置的一部分。在一些實(shí)施方式中，如果沒(méi)有執(zhí)行步驟740以使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)到第一水平 取向的話，則不需要執(zhí)行這一步驟。
[0168] 流程700轉(zhuǎn)到步驟760,在步驟760中，流體以第四循環(huán)流速再次進(jìn)行循環(huán)。與步驟 708、步驟728和步驟744類似，流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)。在實(shí)施方式中，步驟744可涉及 啟動(dòng)一個(gè)或多個(gè)栗以使流體穿過(guò)生物反應(yīng)器300循環(huán)，如上所述，可啟動(dòng)1C循環(huán)栗(例如812 或911)，以使流體以第四循環(huán)流速穿過(guò)生物反應(yīng)器300的1C側(cè)循環(huán)。在至少一個(gè)實(shí)施方式 中，攜帶細(xì)胞的流體可經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器300的中空纖維從1C側(cè)流到EC側(cè)。在其他實(shí)施方式 中，可將細(xì)胞加載到生物反應(yīng)器300的EC側(cè)中，并且使攜帶細(xì)胞的流體從EC側(cè)流到1C側(cè)。在 這些實(shí)施方式中，可啟動(dòng)EC循環(huán)栗(例如828或974)，以使流體以第四循環(huán)流速穿過(guò)生物反 應(yīng)器300的EC側(cè)循環(huán)。
[0169] 在實(shí)施方式中，第四循環(huán)流速可小于第三循環(huán)速度。在實(shí)施方式中，第四循環(huán)流速 可小于約1〇〇1111/111；[11、小于約751111/111；[11或甚至小于約501111/111；[11。在其他實(shí)施方式中，第四循 環(huán)速度可大于約5ml/min、大于約10ml/min或甚至大于約15ml/min。在一個(gè)實(shí)施方式中，第 四循環(huán)流速在約15ml/min至約35ml/min之間，諸如約25ml/min。
[0170] 在一些實(shí)施方式中，步驟760可還涉及以與步驟744中的循環(huán)方向不同的方向進(jìn)行 循環(huán)。換句話說(shuō)，在一些實(shí)施方式中，步驟744可涉及使流體以逆時(shí)針?lè)较蜓h(huán)。在一些實(shí)施 方式中，在步驟760處的循環(huán)可以與步驟728類似，并且是順時(shí)針?lè)较颉Q句話說(shuō)，步驟760處 的循環(huán)可以與步驟744處的循環(huán)相反地流動(dòng)，并且與步驟728的循環(huán)方向相同。在其他實(shí)施 方式中，步驟708、步驟728、步驟744和步驟760中的循環(huán)可以相同方向，順時(shí)針或逆時(shí)針流 動(dòng)。
[0171] 在一些實(shí)施方式中，步驟760還可涉及使生物反應(yīng)器300以特定順序旋轉(zhuǎn)，以促使 細(xì)胞穿過(guò)生物反應(yīng)器300和CES的循環(huán)路徑進(jìn)行分布，其中生物反應(yīng)器300可與CES的循環(huán)路 徑流體相連。在其他實(shí)施方式中，循環(huán)步驟760可涉及使生物反應(yīng)器300在一些時(shí)間段中旋 轉(zhuǎn)，但使生物反應(yīng)器300在其他時(shí)間段中保持靜止。
[0172] 流程從760轉(zhuǎn)到步驟764,在步驟764中，再一次降低流體循環(huán)速度?？蓪⒀h(huán)速度 降低至約零(〇)ml/min，或者在其他實(shí)施方式中，可將循環(huán)速度降低至大于零(0)ml/min但 仍允許細(xì)胞沉淀且附著至生物反應(yīng)器300,例如生物反應(yīng)器300的中空纖維316的內(nèi)表面的 速度。在實(shí)施方式中，步驟764可涉及停止或關(guān)閉在步驟760中用于使流體循環(huán)的一個(gè)或多 個(gè)栗。
[0173]流程從步驟764轉(zhuǎn)到步驟768,在步驟768中，使生物反應(yīng)器維持在第二水平取向 上，以允許細(xì)胞再次沉淀在例如區(qū)1512上(參見(jiàn)圖15F)。在實(shí)施方式中，允許細(xì)胞在第四預(yù) 定時(shí)間段期間進(jìn)行沉淀，可對(duì)第四預(yù)定時(shí)間段進(jìn)行選擇，以不僅允許細(xì)胞沉淀而且還允許 細(xì)胞再次附著。
[0174]在一些實(shí)施方式中，第四預(yù)定時(shí)間段可以持續(xù)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許細(xì)胞沉淀和 附著。在這些實(shí)施方式中，細(xì)胞可僅需要移動(dòng)中空纖維（例如纖維1500)的內(nèi)徑的距離。例 如，在中空纖維1500具有約150微米至約300微米之間的內(nèi)徑的實(shí)施方式中，第四預(yù)定時(shí)間 段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實(shí)施方式中，第四預(yù)定時(shí)間 段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個(gè)實(shí)施方式中，第 四時(shí)間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0175] 在步驟768之后，流程700轉(zhuǎn)到步驟772,在步驟772中，沉淀且附著至生物反應(yīng)器 300(例如生物反應(yīng)器的中空纖維）的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，即增殖。然后，流程700終止于776。 [0176]在不受到理論束縛的情況下，相信在實(shí)施方式中，如果執(zhí)行流程700的步驟，則能 改善細(xì)胞擴(kuò)增。相信這些實(shí)施方式有助于在細(xì)胞擴(kuò)增之前，在生物反應(yīng)器的更多部分，例如 生物反應(yīng)器中的中空纖維的表面接種細(xì)胞。與傳統(tǒng)工藝相比，這樣可初始接種更多的細(xì)胞， 并且最終改善細(xì)胞產(chǎn)量并且縮短細(xì)胞倍增的時(shí)間。
[0177] 盡管流程700包括提供旋轉(zhuǎn)、循環(huán)、降低循環(huán)和維持生物反應(yīng)器的取向的特定數(shù)目 的步驟，但是其他實(shí)施方式并不限于這些特定數(shù)目的步驟。在其他實(shí)施方式中，甚至在步驟 768之后，也可使生物反應(yīng)器再次旋轉(zhuǎn)，再次啟動(dòng)循環(huán)，然后進(jìn)行降低循環(huán)的另一階段，以允 許細(xì)胞沉淀，并且維持取向一段時(shí)間以允許細(xì)胞附著至生物反應(yīng)器的一部分?？蓪⑦@些步 驟執(zhí)行任意次數(shù)。在實(shí)施方式中，每次啟動(dòng)循環(huán)時(shí)，該循環(huán)的速度都小于之前的循環(huán)。在其 他實(shí)施方式中，循環(huán)速度可以在每次啟動(dòng)的循環(huán)中都是相同的。在另外一些實(shí)施方式中，可 以改變循環(huán)的方向，其中一循環(huán)為第一方向，然后終止該循環(huán)以允許細(xì)胞沉淀和附著，然后 以與第一方向相反的方向（順時(shí)針對(duì)逆時(shí)針)進(jìn)行循環(huán)并且再次終止循環(huán)以允許細(xì)胞沉淀。
[0178] 現(xiàn)在參考圖16,示出了生物反應(yīng)器(例如生物反應(yīng)器300)的橫截面1600(與中心軸 線垂直）。橫截面1600不出可在殼體1604內(nèi)的多個(gè)中空纖維1608。橫截面1600取自生物反應(yīng) 器的一個(gè)末端，除了中空纖維1608之外，橫截面1600還示出將中空纖維1608保持在一起的 基質(zhì)材料1628(如上可被稱為灌封材料）。
[0179] 圖16還示出區(qū)域1612、1616、1620和1624。這些區(qū)域代表其中可能有流體以不同流 速循環(huán)穿過(guò)其中的纖維。換句話說(shuō)，在不受到理論束縛的情況下，相信處于相對(duì)較高流速的 循環(huán)可主要流經(jīng)纖維的區(qū)域1612,其中相對(duì)較高流速諸如可在循環(huán)步驟708或步驟728(圖 7)中使用的速度。在不受到理論束縛的情況下，相信較高流速不能使流體分散到足以允許 均勻流到中空纖維的外區(qū)域中。隨著流速降低(諸如在步驟744和步驟760中），相信流體可 分散到中空纖維的外區(qū)域中，諸如區(qū)域1616、區(qū)域1620和區(qū)域區(qū)域1624。
[0180] 相應(yīng)地，在不受到理論束縛的情況下，相信通過(guò)步驟708、步驟728、步驟744和步驟 752以不同流速進(jìn)行循環(huán)，允許流體比僅使用一種流速要流經(jīng)更多的中空纖維1608。在按照 流程圖700進(jìn)行的工藝的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟708(處于上述流速)時(shí)，流體可流經(jīng)中空 纖維的區(qū)域1612。在步驟728(處于上述流速)時(shí)，因?yàn)樗俣容^慢并且流體可更加分散，因此 流體可流經(jīng)中空纖維的區(qū)域1612和區(qū)域1616。在步驟744(處于上述流速)時(shí)，因?yàn)榱魉俑?并且流體甚至更加分散，因此流體可流經(jīng)中空纖維的區(qū)域1612、區(qū)域1616和區(qū)域1620。在步 驟752(處于上述流速)時(shí)，因?yàn)榱魉偕踔粮⑶伊黧w可分散至所有纖維的各個(gè)區(qū)域，因此 流體可流經(jīng)中空纖維的所有區(qū)域1612、區(qū)域1616、區(qū)域1620和區(qū)域1624。因此，相信與使用 單一高流速循環(huán)相比，使用一系列的不同流速可使含細(xì)胞的流體流入更多的中空纖維中。
[0181] 此外，還相信不同的流速還可影響細(xì)胞沿生物反應(yīng)器（即沿中空纖維）的縱向分 布。也就是說(shuō)，較高的流速可允許細(xì)胞沿中空纖維內(nèi)側(cè)流動(dòng)地更遠(yuǎn)。例如，在較高流速時(shí)，被 流體攜帶的細(xì)胞可達(dá)到中空纖維長(zhǎng)度的一半之外。在較低流速時(shí)，被流體攜帶的細(xì)胞可達(dá) 到中空纖維長(zhǎng)度的一半。在甚至更低的流速時(shí)，被流體攜帶的細(xì)胞可達(dá)到小于中空纖維長(zhǎng) 度一半。因此，在一些實(shí)施方式中，相信使用不同流速可在細(xì)胞沿生物反應(yīng)器(例如中空纖 維）的長(zhǎng)度縱向分布上得到一些改善。
[0182] 注意到，在參考流程圖500、流程圖600和流程圖700描述的實(shí)施方式可用于擴(kuò)增任 意類型的細(xì)胞，該任意類型的細(xì)胞的一些非限制性實(shí)例包括干細(xì)胞（間充質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞 等）、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、祖細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、其他完全分化的細(xì)胞，以及它們的組合。可 使用具有不同特征和特征的組合的工藝來(lái)擴(kuò)增不同細(xì)胞，其中一些可包括參考流程圖500、 流程圖600和/或流程圖700所述的步驟。
[0183] 盡管流程圖500(圖5)、流程圖600(圖6)和流程圖7(圖7)描述了以特定順序列出的 步驟，但本發(fā)明并不限于此。在其他實(shí)施方式中，例如在另一步驟之前和之后，可以不同順 序、平行或以任意不同的次數(shù)執(zhí)行各步驟。另外，如上所述，流程圖500、流程圖600和流程圖 700可包括一些可選步驟或子步驟。但是，不應(yīng)將上面不是作為可選步驟示出的那些步驟認(rèn) 為對(duì)于本發(fā)明是必需的，而是可以在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中執(zhí)行，而在其他實(shí)施方式中 不執(zhí)行。
[0184] 最后，圖17示出基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1700的示例性組件，在該基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1700上 可執(zhí)行本發(fā)明的實(shí)施方式。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1700可執(zhí)行用于加載和分布細(xì)胞的方法中的一些步 驟。系統(tǒng)1700可以是用于控制特征的控制器，所述特征例如為上述在其中加載且分布了細(xì) 胞以進(jìn)行擴(kuò)增的CES系統(tǒng)10、430、800和900的流動(dòng)控制裝置、栗、閥、生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)、馬 達(dá)等。
[0185] 計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1700包括輸出裝置1704和/或輸入裝置1708。輸出裝置1704可包括一 個(gè)或多個(gè)顯示器，包括CRT、IXD和/或等離子體顯示器。輸出裝置1704還可包括打印機(jī)、揚(yáng)聲 器等。輸入裝置1708可包括鍵盤、觸摸輸入裝置、鼠標(biāo)、語(yǔ)音輸入裝置等。
[0186] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，基礎(chǔ)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1700還可包括處理元件1712和/或存儲(chǔ) 器(mem〇ry)1716。處理元件1712可為通用處理器，可操作地用于執(zhí)行存儲(chǔ)器1716中存儲(chǔ)的 指令。根據(jù)實(shí)施方式，處理元件1712可包括一個(gè)處理器或多個(gè)處理器。進(jìn)一步地，在實(shí)施方 式中，每個(gè)處理器都可為具有一個(gè)或多個(gè)核的多核處理器，以讀取和執(zhí)行獨(dú)立的指令。上述 處理器可包括通用處理器、專用集成電路(ASIC)、現(xiàn)場(chǎng)可編程門陣列（FPGA)，其它集成電 路。
[0187] 根據(jù)實(shí)施方式，存儲(chǔ)器1716可包括用于短期存儲(chǔ)或長(zhǎng)期存儲(chǔ)數(shù)據(jù)和/或處理器可 執(zhí)行指令的任意有形介質(zhì)。存儲(chǔ)器1716可包括例如隨機(jī)存取存儲(chǔ)卡（RAM)、只讀存儲(chǔ)卡 (ROM)或電可擦除可編程只讀存儲(chǔ)卡(EEPR0M)。其它存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括例如⑶-R0M、磁帶、 數(shù)字多功能盤(DVD)或其它光學(xué)存儲(chǔ)器，磁帶、磁盤存儲(chǔ)器、磁帶、其它磁存儲(chǔ)裝置等等。在 實(shí)施方式中，系統(tǒng)1700可用于控制生物反應(yīng)器300的旋轉(zhuǎn)和/或CES系統(tǒng)的各流動(dòng)控制裝置、 栗、閥等。存儲(chǔ)器1716可存儲(chǔ)方案1720和程序1724,諸如將細(xì)胞加載和分布在生物反應(yīng)器中 的方案和程序，能夠控制循環(huán)栗、閥、生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)等的運(yùn)行。
[0188] 貯存器(st〇rage)1728可以上任意的長(zhǎng)期數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置或組件。根據(jù)實(shí)施方式，貯 存器1220可包括連同存儲(chǔ)器1716-起描述的一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)。存器1728可為永久的或可 擦除的。在實(shí)施方式中，系統(tǒng)1700為CES的一部分，并且貯存器1728可存儲(chǔ)利用CES系統(tǒng)加 載、分布、附著、擴(kuò)增和收獲各種類型的細(xì)胞的各種方案。
[0189] 實(shí)施例
[0190] 下面，描述本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的一些實(shí)例。但是，應(yīng)注意盡管下面根據(jù)一些實(shí) 施方式，描述了例如用于為CES(即QUANTUM?細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng))提供程序的具體參數(shù)、特征 和/或數(shù)值，但是提供這些具體參數(shù)、特征和/或數(shù)值僅為了示例目的，本發(fā)明并不限于下面 提供的具體細(xì)節(jié)。
[0191] 實(shí)施例1
[0192] 本研究的目的是描繪使用兩種獨(dú)特的細(xì)胞接種方法，使來(lái)源于人類骨髓的間充質(zhì) 干細(xì)胞(hMSC)在QUANTUM?細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。
[0193] 目前，用于預(yù)先選定的hMSC的QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)上使用的細(xì)胞加載程序經(jīng)由 均勻的細(xì)胞懸浮液將細(xì)胞分布在生物反應(yīng)器中。將細(xì)胞加載到QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的1C 循環(huán)環(huán)路中，然后以相對(duì)較高的流速(200mL/min)循環(huán)2分鐘。該循環(huán)方法，同時(shí)伴隨有目的 的生物反應(yīng)器運(yùn)動(dòng)，得到細(xì)胞的均勻懸浮液。一旦使細(xì)胞均勻懸浮，則循環(huán)和生物反應(yīng)器的 運(yùn)動(dòng)停止，從而使細(xì)胞沉淀在生物反應(yīng)器的表面上。
[0194] 該細(xì)胞加載程序的一個(gè)限制是，僅將細(xì)胞接種至生物反應(yīng)器纖維的凹槽中。hMSC 常常以特定細(xì)胞密度(例如500個(gè)細(xì)胞/cm2)進(jìn)行接種。當(dāng)確定要加載的細(xì)胞的適當(dāng)數(shù)目時(shí)， 為了實(shí)現(xiàn)特定的接種密度，只能考慮生物反應(yīng)器表面積的約50%。在500個(gè)細(xì)胞/cm 2時(shí)， QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)生物反應(yīng)器可接種10.5E+06個(gè)細(xì)胞(500個(gè)細(xì)胞/cm2x 21000cm2)。但 是，由于現(xiàn)有細(xì)胞加載方案的上述機(jī)械性，僅可認(rèn)為生物反應(yīng)器表面積的50 %是"能接種 的"。此外，為了利用生物反應(yīng)器的"不能接種的"表面，嘗試迀移至該表面的擴(kuò)增細(xì)胞必須 要克服重力。本文建立的理論是，與在培養(yǎng)瓶對(duì)應(yīng)部分中擴(kuò)增的那些細(xì)胞群相比，迀移細(xì)胞 可能采取阻力最小的路徑，從而得到細(xì)胞群內(nèi)的快速匯合。
[0195] 總共七個(gè)無(wú)菌的具有生物反應(yīng)器的Quantum CES-次性套件可經(jīng)纖連蛋白包被 (5mg)過(guò)夜。所有的Quantum系統(tǒng)都可接種預(yù)培養(yǎng)的hMSC。一個(gè)Quantum細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可使用 現(xiàn)有的循環(huán)作業(yè)加載(Load with Circulation Task)，并且用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。三個(gè)Quantum細(xì) 胞擴(kuò)增系統(tǒng)可使用"循環(huán)作業(yè)加載:改型Γ (改型1 )，而且三個(gè)Quantum細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)可使用 循環(huán)作業(yè)加載:改型2"（改型2)。
[0196] 一次性套件：所有生物反應(yīng)器都整合在QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)（CES)-次性套件 中，并且經(jīng)環(huán)氧乙烷進(jìn)行消毒。
[0197] 細(xì)胞來(lái)源和密度:可使用的生物反應(yīng)器可具有2.1m2的內(nèi)（1C)表面積。可能需要基 于1C環(huán)路的生物反應(yīng)器的體積分?jǐn)?shù)，對(duì)對(duì)照培養(yǎng)瓶的接種密度進(jìn)行調(diào)整。所有生物反應(yīng)器 可均勻接種來(lái)自直接重加載的相同細(xì)胞來(lái)源的最高20E+06預(yù)先選定的MSC(存在1~3次傳 代）。優(yōu)選來(lái)自一個(gè)供體的細(xì)胞。作為用于對(duì)比目的的生物反應(yīng)器，以每cm 2相同密度的hMSC 接種三(3)個(gè)T25對(duì)照培養(yǎng)瓶。
[0198] CES介質(zhì)1C進(jìn)入Q管理&收獲：當(dāng)葡萄糖水平低于70mg/dL時(shí)，介質(zhì)供給速度（1C進(jìn)入 Q)可加倍;如果葡萄糖值繼續(xù)低于70mg/dL，則1C進(jìn)入Q可在一天期間再次加倍。可同時(shí)并且 不晚于第8天，收獲所有的一次性條件，以限制潛在的聚集?？筛鶕?jù)細(xì)胞培養(yǎng)物顯示的代謝 特征，來(lái)決定細(xì)胞收獲時(shí)間。目標(biāo)收獲時(shí)間可以是細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。
[0199] 收獲后的評(píng)估:可對(duì)每一收獲產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)估。這些評(píng)估可包括細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活力。 [0200] Quantum CES細(xì)胞加載改型1
[0201]可使用下面以粗體示出的改型，執(zhí)行目前的細(xì)胞加載程序。在允許細(xì)胞附著5分鐘 之后，可使所有生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度以允許細(xì)胞沉淀在中空纖維膜的頂部，持續(xù)額外的5 分鐘。然后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)回到初始的水平位置，并且進(jìn)行擴(kuò)增方案。該改型的基本原 理是使細(xì)胞在生物反應(yīng)器中空纖維的整個(gè)表面積上進(jìn)行分布。
[0202] 天:0使用一次(1)旋轉(zhuǎn)使細(xì)胞附著
[0203] 目的：使貼壁細(xì)胞能附著至生物反應(yīng)器的膜上，同時(shí)允許在EC循環(huán)環(huán)路中進(jìn)行流 動(dòng)。可將至1C環(huán)路的栗流速設(shè)置為零。
[0204] 表1描述了當(dāng)使細(xì)胞附著時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對(duì)應(yīng)的體積 可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0205]表1:使細(xì)胞附著的改型1的溶液 [0206]表1:用于使細(xì)胞附著的溶液
[0207]
[0208] 細(xì)胞路徑:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著
[0209] 輸入在方案表2a~2c中示出使細(xì)胞附著的每一設(shè)置的數(shù)值。
[021 0]表2a:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著，步驟1改型1
[0211]
[0212] 表2b:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著，步驟2改型1
[0213]
[0214] 表2c:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著，步驟3改型1
[0215]
[0216] Quantum CES細(xì)胞加載改型2
[0217] 可使用下面以粗體示出的改型，執(zhí)行目前的細(xì)胞加載程序、預(yù)先選定的MSC擴(kuò)增方 案。在細(xì)胞附著期間（18~24小時(shí)），通過(guò)使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)至180度位置，可使細(xì)胞附著至 中空纖維的頂部。然后，使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)回到初始位置，并且進(jìn)行擴(kuò)增方案。該改型的基 本原理是在細(xì)胞擴(kuò)增期間，使重力影響細(xì)胞朝空的生長(zhǎng)表面迀移的方向。
[0218]重力可用于"影響"擴(kuò)增期間的細(xì)胞迀移。這可通過(guò)如在目前細(xì)胞加載程序中所述 的接種細(xì)胞，然后在擴(kuò)增期間可使生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180°來(lái)完成。在這種配置中，生物反應(yīng)器 的未被占據(jù)的生長(zhǎng)表面在接種的細(xì)胞的下方。然后，細(xì)胞朝最小阻力方向（例如在重力的幫 助下朝下)進(jìn)行擴(kuò)增。
[0219]天:0使用一次⑴旋轉(zhuǎn)使細(xì)胞附著
[0220]目的：使貼壁細(xì)胞能附著至生物反應(yīng)器的膜上，同時(shí)允許在EC循環(huán)環(huán)路中進(jìn)行流 動(dòng)?？蓪⒅?C環(huán)路的栗流速設(shè)置為零。
[0221 ]表5描述了當(dāng)使細(xì)胞附著時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對(duì)應(yīng)的體積 可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0222]表5:使細(xì)胞附著的改型2的溶液
[0223]
[0224] 細(xì)胞路徑:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著
[0225] 表6:任務(wù)〉加載和附著〉使細(xì)胞附著的改型2
[0226]
[0227] 結(jié)果可如下：
[0228] 表 7
[0234] 實(shí)施例2
[0235] 牛眼樣細(xì)胞(Bull's Eye cell)加載程序是一系列步驟，這些步驟被設(shè)計(jì)為通過(guò) 允許細(xì)胞在QUANTUM?細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行更均勻的分布，并且通過(guò)減少 在接種過(guò)程中細(xì)胞丟失的數(shù)目，來(lái)增加細(xì)胞產(chǎn)量。
[0236] QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的牛眼樣細(xì)胞加載技術(shù)提供了一系列步驟，包括并且加入 通常用于加載生物反應(yīng)器的"使用均勻懸浮液加載細(xì)胞（Load Cells with Uniform Suspension)"的方案(軟件版本2.0的Quantum細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)操作者手冊(cè)）。在使用均勻懸浮 液加載細(xì)胞(LCWUS)中，在細(xì)胞懸浮液以200mL/min穿過(guò)1C環(huán)路循環(huán)之后，懸浮的細(xì)胞有一 個(gè)時(shí)機(jī)進(jìn)入并且附著至生物反應(yīng)器的一個(gè)纖維的內(nèi)表面。牛眼樣細(xì)胞可允許在初始懸浮之 后不附著的細(xì)胞和那些不是在生物反應(yīng)器中而是留在1C環(huán)路中的細(xì)胞被重新懸浮，并且轉(zhuǎn) 運(yùn)到生物反應(yīng)器內(nèi)的不同纖維中用于隨后的附著。
[0237] 可基于以下原理進(jìn)行牛眼樣細(xì)胞的加載:依賴于1C環(huán)路中的細(xì)胞懸浮液的循環(huán)速 度，經(jīng)由1C環(huán)路的循環(huán)引入到生物反應(yīng)器中的細(xì)胞懸浮液可經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)器纖維的不同 組。
[0238] 在使用均勻懸浮液(LCWUS)加載細(xì)胞的初始200mL/min懸浮循環(huán)之后，1C環(huán)路中的 細(xì)胞懸浮液可選地以順序較低的循環(huán)速度-100mL/min、50mL/min、-25mL/min，以正向和反 向進(jìn)行循環(huán)。1C環(huán)路的每一逐漸較慢的循環(huán)可允許，那些仍留在懸浮液中的細(xì)胞有額外的 機(jī)會(huì)進(jìn)入并且附著至生物反應(yīng)器纖維的內(nèi)表面上。
[0239] 流體在1C環(huán)路中的每一次循環(huán)都可跟著7分鐘的細(xì)胞附著時(shí)間，在這一時(shí)間段中， 1C循環(huán)速度可以是零。已表明MSC細(xì)胞在5分鐘內(nèi)附著至在QUANTUM細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中使用的 生物反應(yīng)器中的纖維的內(nèi)表面上。這樣，7分鐘的附著可允許5分鐘用于細(xì)胞附著，額外的2 分鐘允許較慢的細(xì)胞附著。1C環(huán)路中的細(xì)胞懸浮液和細(xì)胞附著的總四次循環(huán)可跟著24小時(shí) 附著期間，在該24小時(shí)附著時(shí)間之后，可根據(jù)需要輸入適當(dāng)?shù)募?xì)胞飼養(yǎng)計(jì)劃。
[0240]天：_1包被生物反應(yīng)器
[0241 ]目的:使用試劑包被生物反應(yīng)器的膜。
[0242] 步驟1:在1C環(huán)路中加載試劑，直至袋子清空。
[0243] 步驟2:將上述試劑從ARC趕至1C環(huán)路中。
[0244] 步驟3:使上述試劑在1C環(huán)路中進(jìn)行循環(huán)。
[0245] 在啟動(dòng)這一任務(wù)之前，可滿足下面的前提：
[0246] 在細(xì)胞輸入袋中包括至少40mL空氣。
[0247] 表10描述了在執(zhí)行包被生物反應(yīng)器時(shí)，可用于與每一管線附接的溶液袋。這些溶 液和對(duì)應(yīng)的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0248]
[0249] 包被生物反應(yīng)器的路徑:任務(wù)〉系統(tǒng)管理〉包被生物反應(yīng)器
[0250] 輸入在表11中示出的步驟1的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0251]
[0252] 輸入在表12中示出的步驟2的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0254] 輸入在表13中示出的步驟3的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0255]
[0256] 天：0 IC EC沖洗
[0257] 目的：用于替換1C循環(huán)環(huán)路和EC循環(huán)環(huán)路中的流體。通過(guò)交換的1C體積和EC體積 的數(shù)量來(lái)限定替換的體積。表14描述了當(dāng)進(jìn)行IC EC沖洗時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。 這些溶液和對(duì)應(yīng)的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0258]
[0259] IC EC沖洗路徑:任務(wù)〉沖洗>IC EC沖洗
[0260]確認(rèn)表15中示出的用于IC EC沖洗的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0261]
[0262] 天:0條件培養(yǎng)基(介質(zhì)）
[0263] 按照該任務(wù)的指令，在加載細(xì)胞之前，允許介質(zhì)達(dá)到與提供的氣體供應(yīng)的平衡。該 任務(wù)可包括兩個(gè)獨(dú)立步驟：
[0264] 步驟1:通過(guò)使用高EC循環(huán)速度，提供介質(zhì)和氣體供應(yīng)之間的快速接觸。
[0265] 步驟2:將系統(tǒng)維持在適當(dāng)狀態(tài)，直至操作者準(zhǔn)備要加載細(xì)胞。
[0266] 表16描述了當(dāng)執(zhí)行條件培養(yǎng)基時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對(duì)應(yīng) 的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0267]
[0268] 條件介質(zhì)路徑:任務(wù)〉系統(tǒng)管理〉條件介質(zhì)
[0269] 輸入在表17中示出對(duì)步驟1的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0271 ]輸入在表18中示出對(duì)步驟2的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0272]
[0273]天:0使用均勻懸浮液加載細(xì)胞
[0274] 目的:將細(xì)胞從細(xì)胞輸入袋加載到生物反應(yīng)器中，直至袋子清空。該任務(wù)僅使用1C 循環(huán)來(lái)分布細(xì)胞，并且不嘗試將細(xì)胞從管線趕至生物反應(yīng)器中。該任務(wù)可包括三個(gè)獨(dú)立步 驟。
[0275] 步驟1:將細(xì)胞從細(xì)胞輸入袋加載到生物反應(yīng)器中。
[0276] 步驟2:將細(xì)胞從ARC趕至生物反應(yīng)器中。更大驅(qū)趕體積（chase volume)擴(kuò)散細(xì)胞 并且使細(xì)胞朝1C出口移動(dòng)。
[0277] 步驟3:促使細(xì)胞經(jīng)由1C循環(huán)跨越膜進(jìn)行分布而不經(jīng)由1C入口，因此沒(méi)有超過(guò)濾。
[0278] 在啟動(dòng)該任務(wù)之前，可滿足下面的前提：
[0279] 在細(xì)胞輸入袋中包括至少40 mL的空氣。
[0280] 表19描述了在執(zhí)行使用均勻懸浮液加載細(xì)胞時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這 些溶液和對(duì)應(yīng)的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0281]
[0282] 使用均勻懸浮液加載細(xì)胞的路徑:任務(wù)〉加載和附著〉使用均勻懸浮液加載細(xì)胞
[0283] 確認(rèn)表20中示出的用于步驟1的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0284]
[0285] 確認(rèn)表21中示出的用于步驟2的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0286]
[0287]確認(rèn)表22中示出的用于步驟3的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0288]
[0289] 天:0牛眼樣細(xì)胞的附著
[0290] 目的:在允許在EC循環(huán)環(huán)路中進(jìn)行流動(dòng)時(shí)，允許貼壁細(xì)胞附著至生物反應(yīng)器膜上。 可將至1C環(huán)路的栗流速設(shè)置為零。
[0291 ]步驟1:允許細(xì)胞7分鐘附著至處于180°的生物反應(yīng)器的內(nèi)表面。
[0292] 步驟2:使1C流體和剩余的懸浮細(xì)胞以高速，與初始加載相反的方向循環(huán)。
[0293] 步驟3:該步驟是第二個(gè)7.0分鐘，允許進(jìn)一步的細(xì)胞附著。使從1C環(huán)路或從生物反 應(yīng)器的不同區(qū)域重新定位的那些細(xì)胞有機(jī)會(huì)沉淀且貼壁到生物反應(yīng)器上。
[0294] 步驟4:再次使留在1C環(huán)路中的那些細(xì)胞和還沒(méi)有附著至表面上的那些細(xì)胞重新 循環(huán)。循環(huán)可以為正向，并且這一次的循環(huán)速度可較低，以避免移除已經(jīng)附著的那些細(xì)胞， 并且優(yōu)選接種到生物反應(yīng)器中在之前的步驟中還沒(méi)有接種的區(qū)域上。
[0295] 步驟5:該步驟是第三個(gè)7.0分鐘，允許進(jìn)一步的細(xì)胞附著。使從1C環(huán)路或從生物反 應(yīng)器的不同區(qū)域重新定位的那些細(xì)胞有機(jī)會(huì)沉淀且貼壁到生物反應(yīng)器上。
[0296] 步驟6:使留在1C環(huán)路中的那些細(xì)胞和還沒(méi)有附著至表面的那些細(xì)胞重新循環(huán)。循 環(huán)可以為反向，并且這一次的循環(huán)速度可較低，以避免移除已經(jīng)附著的那些細(xì)胞。
[0297] 步驟7:24小時(shí)附著細(xì)胞階段。細(xì)胞可有24小時(shí)，以在飼養(yǎng)開(kāi)始之前，牢固地錨固至 生物反應(yīng)器上
[0298] 表23描述了在執(zhí)行牛眼樣細(xì)胞的附著時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液 和對(duì)應(yīng)的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0299]
[0300] 牛眼樣細(xì)胞附著路徑:任務(wù)〉自定義〉自定義
[0301] 輸入表24中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0302]
[0303]輸入表25中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0304]
[0305]輸入表26中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0306]
[0307] 輸入表27中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0308]
[0309]輸入表28中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。 「03101
[0311]輸入表29中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0313] 輸入表30中示出的每一設(shè)置的數(shù)值。[0314]
[0315] 天：1飼養(yǎng)細(xì)胞
[0316] 目的：持續(xù)低流速向1C循環(huán)環(huán)路和/或EC循環(huán)環(huán)路進(jìn)行添加。在該任務(wù)過(guò)程中，存 在幾種排出設(shè)置，可用于移除向系統(tǒng)添加的流體。
[0317] 表31描述了在執(zhí)行飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對(duì)應(yīng)的 體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0318]
[0319] 飼養(yǎng)細(xì)胞的路徑:任務(wù)〉飼養(yǎng)和添加〉飼養(yǎng)細(xì)胞
[0320] 確認(rèn)表32中示出的步驟1的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0321]
[0322]根據(jù)需要，增加 1C進(jìn)入速度。
[0323]釋放貼壁細(xì)胞和收獲
[0324]目的：從膜上釋放細(xì)胞，是細(xì)胞離開(kāi)1C環(huán)路并且將來(lái)自1C循環(huán)環(huán)路的細(xì)胞(包括在 生物反應(yīng)器中的細(xì)胞)以懸浮液的形式轉(zhuǎn)移到收獲袋中。
[0325] 步驟1:在準(zhǔn)備中，執(zhí)行IC EC沖洗任務(wù)，以添加試劑。例如，在準(zhǔn)備中，該系統(tǒng)將roS 替換成IC EC介質(zhì)以去除蛋白、Ca++和Mg++，以添加胰蛋白酶。
[0326] 步驟2:將試劑加載到系統(tǒng)中，直至袋子清空。
[0327] 步驟3:將試劑趕至1C環(huán)路中。
[0328] 步驟4:混合1C環(huán)路內(nèi)的試劑。
[0329] 步驟5:將來(lái)自1C循環(huán)環(huán)路的細(xì)胞(包括生物反應(yīng)器中的細(xì)胞）以懸浮液的形式轉(zhuǎn) 移至收獲袋中。
[0330] 在啟動(dòng)該任務(wù)之前，可滿足下面的前提：
[0331] 在細(xì)胞輸入袋上包括至少40mL的空氣。
[0332]表33描述了在執(zhí)行釋放貼壁細(xì)胞和收獲時(shí)，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶 液和對(duì)應(yīng)的體積可基于該任務(wù)的默認(rèn)設(shè)置。
[0333]
[0334] 釋放貼壁細(xì)胞的路徑:任務(wù)〉釋放和收獲〉釋放貼壁細(xì)胞和收獲
[0335] 確認(rèn)表34中示出的步驟1的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0338] 確認(rèn)表35中示出的步驟2的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0339]
[0340]確認(rèn)表36中示出的步驟3的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0341]
[0342] 確認(rèn)表37中示出的步驟4的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0343]
[0344] 確認(rèn)表38中示出的步驟5的每一設(shè)置的數(shù)值。
[0345]
[0346] 本研究的結(jié)果如下：
[0347] 表39
[0348]
[0349] 可使用來(lái)自四個(gè)不同供體的MSC，來(lái)評(píng)估牛眼樣細(xì)胞的加載。加載的牛眼樣細(xì)胞的 收獲產(chǎn)量可相應(yīng)高于使用LCWUS加載且在相同條件下培養(yǎng)的產(chǎn)量。使用牛眼樣細(xì)胞(n = 6) vs.LCWUS(n = 4)得到的細(xì)胞平均產(chǎn)量增加可為25%。
[0350]在進(jìn)行牛眼樣細(xì)胞加載之后立即從1C環(huán)路中采集的MSC樣品的存活力為100%。對(duì) 于所有樣品，來(lái)自牛眼樣細(xì)胞收獲物的MSC的存活力高于98%。來(lái)自牛眼樣細(xì)胞收獲物的 MSC顯示出培養(yǎng)物中的典型形態(tài)，并且通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量的所有MSC生物標(biāo)記物都符合 ISCT標(biāo)準(zhǔn)。
[0351] 實(shí)施例3
[0352] 可使用與上述實(shí)施例2相同的方案，來(lái)研究對(duì)牛眼樣細(xì)胞附著方案的改型。對(duì)牛眼 樣細(xì)胞附著的改型（牛眼樣細(xì)胞II)和對(duì)上述方案的改型包括去除在循環(huán)速度l〇〇ml/min、-50ml/min和25ml/min之后的附著階段。也就是說(shuō)，取代如上所述的7分鐘停止條件，沒(méi)有停 止條件，以便下一個(gè)循環(huán)速度接著前一個(gè)循環(huán)速度。對(duì)照以及原牛眼樣細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)（牛眼樣細(xì) 胞I)也實(shí)施作為對(duì)比。
[0353] 本研究的結(jié)果如下：
[0354] 表40
[0355]
[0356] 各組件在本文中被稱為"可操作地相聯(lián)/相連"。如本文所使用的，"可操作地相聯(lián)/ 相連"是指組件以可操作的方式連接在一起，并且涵蓋組件直接連接的實(shí)施方式以及在兩 個(gè)連接的組件之間放置有額外的組件的實(shí)施方式。
[0357] 前面對(duì)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的討論是用于解釋和說(shuō)明的目的并不要進(jìn) 行限制。例如在上文的【具體實(shí)施方式】中，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的各特征可組合在一起，以簡(jiǎn) 化本公開(kāi)。不能將本公開(kāi)的方法理解為反映實(shí)施方式需要比在權(quán)利要求明確記載的更多的 特征的發(fā)明。此外，如下文權(quán)利要求所反映的，創(chuàng)造性方面較小地依賴于在前述一個(gè)實(shí)施方 式的所有特征。因此，將后附權(quán)利要求并入到該【具體實(shí)施方式】中，其中每個(gè)權(quán)利要求自身代 表本發(fā)明的一個(gè)獨(dú)立實(shí)施方式。
[0358] 此外，盡管說(shuō)明書(shū)包括對(duì)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的描述以及某些變型和改型，但其 它變型和改型也在本發(fā)明的范圍內(nèi)（例如，在理解本公開(kāi)之后，可在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能 和知識(shí)的范圍內(nèi)）。在不用于向公眾貢獻(xiàn)任何可專利性的主題的情況下，本發(fā)明要獲得在可 允許范圍內(nèi)的替代實(shí)施方式的權(quán)利，包括要求權(quán)利的可替代地、可互換的和/或等價(jià)的結(jié) 構(gòu)、功能、范圍或步驟，而不管這些可替代的、可互換的和/或等價(jià)的結(jié)構(gòu)、功能、范圍或步驟 是否被本文所公開(kāi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種將細(xì)胞加載到細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)中的方法，所述方法包括： 使流體以第一流速穿過(guò)細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述流體包括多個(gè)細(xì) 胞； 使流體的循環(huán)自所述第一流速降低； 使所述生物反應(yīng)器在第一取向上維持第一預(yù)定時(shí)間段，以允許至少所述多個(gè)細(xì)胞的一 部分沉淀； 在所述第一預(yù)定時(shí)間段之后，使所述生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)至距所述第一取向約180度的第 二取向； 在旋轉(zhuǎn)之后，使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第二預(yù)定時(shí)間段，以允許至少 所述多個(gè)細(xì)胞的第二部分沉淀；以及 在所述生物反應(yīng)器中，使至少所述細(xì)胞的第一部分和第二部分?jǐn)U增。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括： 在所述第一預(yù)定時(shí)間段之后，并且在使所述生物反應(yīng)器維持在所述第二取向上之前： 使流體以第二流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第二流速比所述第一流速慢； 以及 使所述循環(huán)自所述第二流速降低；以及 使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第二時(shí)間段。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括： 在所述第二預(yù)定時(shí)間段之后： 使流體以第三流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第三流速比所述第二流速慢； 使流體的循環(huán)速度自所述第三流速降低；以及 使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第三預(yù)定時(shí)間段，以允許至少所述多個(gè)細(xì)胞 的第三部分沉淀。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括： 在所述第三預(yù)定時(shí)間段之后： 使流體以第四流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第四流速比所述第三流速慢； 以及 使流體的循環(huán)自所述第四流速降低；以及 使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第四預(yù)定時(shí)間段，以允許至少所述多個(gè)細(xì)胞 的第四部分沉淀。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述第一時(shí)間段、所述第二時(shí)間段、所述第三時(shí)間 段和所述第四時(shí)間段是相同的。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一時(shí)間段和所述第二時(shí)間段的持續(xù)時(shí)間相 等。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述第一時(shí)間段小于約10分鐘。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述第一時(shí)間段小于約8分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述生物反應(yīng)器包括中空纖維膜。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括： 在所述第二預(yù)定時(shí)間段之后并且在擴(kuò)增之前，將所述生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)180度至所述第 一取向。11. 一種用于擴(kuò)增細(xì)胞的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括： 生物反應(yīng)器； 被配置為與所述生物反應(yīng)器連接并且使所述生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)的至少一個(gè)馬達(dá)； 與所述生物反應(yīng)器流體相連的至少一個(gè)流體循環(huán)路徑； 用于使流體穿過(guò)所述至少一個(gè)流體循環(huán)路徑和所述生物反應(yīng)器循環(huán)的至少一個(gè)栗； 被配置為執(zhí)行處理器可執(zhí)行指令的處理器；以及 儲(chǔ)存處理器可執(zhí)行指令的存儲(chǔ)器，其中當(dāng)所述指令由所述處理器執(zhí)行時(shí)，執(zhí)行包括以 下步驟的方法： 啟動(dòng)所述至少一個(gè)栗，以使流體以第一流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述流體 包括多個(gè)細(xì)胞； 停止所述至少一個(gè)栗； 使所述生物反應(yīng)器在第一取向上維持第一預(yù)定時(shí)間段，以允許至少所述多個(gè)細(xì)胞的一 部分沉淀； 在所述第一預(yù)定時(shí)間段之后，啟動(dòng)所述至少一個(gè)馬達(dá)，以使所述生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)至距 所述第一取向約180度的第二取向； 在旋轉(zhuǎn)之后，使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第二預(yù)定時(shí)間段，以允許所至 少述多個(gè)細(xì)胞的第二部分沉淀；以及 啟動(dòng)所述至少一個(gè)栗，以使流體穿過(guò)流體輸送系統(tǒng)循環(huán)并且使細(xì)胞在所述生物反應(yīng)器 中擴(kuò)增。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中，所述處理器可執(zhí)行指令進(jìn)一步包括用于以下各 項(xiàng)的指令： 在所述第一預(yù)定時(shí)間段之后，并且在使所述生物反應(yīng)器維持在所述第二取向上之前： 啟動(dòng)所述至少一個(gè)栗，以使流體以第二流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第二 流速比所述第一流速慢；以及 停止所述至少一個(gè)栗。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的系統(tǒng)，其中，所述處理器可執(zhí)行指令進(jìn)一步包括用于以下各 項(xiàng)的指令： 在所述第二預(yù)定時(shí)間段之后： 啟動(dòng)所述至少一個(gè)栗，以使流體以第三流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第三 流速比所述第二流速慢； 停止所述至少一個(gè)栗；以及 使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第三預(yù)定時(shí)間段，以允許所述多個(gè)細(xì)胞的至 少第三部分沉淀。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的系統(tǒng)，其中，所述處理器可執(zhí)行指令進(jìn)一步包括用于以下各 項(xiàng)的指令： 在所述第三預(yù)定時(shí)間段之后： 啟動(dòng)所述至少一個(gè)栗，以使流體以第四流速穿過(guò)所述生物反應(yīng)器循環(huán)，其中所述第四 流速比所述第三流速慢；以及 停止所述至少一個(gè)栗；以及 使所述生物反應(yīng)器在所述第二取向上維持第四預(yù)定時(shí)間段，以允許至少所述多個(gè)細(xì)胞 的第四部分沉淀。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中，所述第一流速在約150ml/min至約250ml/min之 間。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的系統(tǒng)，其中，所述第二流速在約50ml/min至約150ml/min之 間。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的系統(tǒng)，其中，所述第三流速在約25ml/min至約100ml/min之 間。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的系統(tǒng)，其中，所述第四流速小于約50ml/min。19. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其中，所述生物反應(yīng)器包括中空纖維膜。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的系統(tǒng)，其中，所述中空纖維膜包括多個(gè)中空纖維。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK105992816SQ201480065648
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2014年11月14日
【發(fā)明人】馬克·E·瓊斯, 內(nèi)森·D·弗蘭克
【申請(qǐng)人】泰爾茂比司特公司