生物反應器及其攪拌槳和使用其培養(yǎng)cik細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養(yǎng)CIK細胞的方法。所述攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料，所述生物反應器含有其外包裹減小剪切力材料的攪拌槳，使用該生物反應器培養(yǎng)CIK細胞。本發(fā)明使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞，在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料，可以降低細胞受到的剪切力傷害，有利于細胞大量擴增。本發(fā)明培養(yǎng)過程中不停的攪拌，為動態(tài)系統(tǒng)，有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養(yǎng)環(huán)境，有利于細胞大量擴增。本發(fā)明方法不僅可以大量擴增CIK細胞，而且所得CIK細胞表面抗原表達量較高，對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【專利說明】
生物反應器及其攪拌槳和使用其培養(yǎng)Cl K細胞的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)領域，尤其涉及一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培養(yǎng) CIK細胞的方法。
【背景技術】
[0002] CIK細胞(cytokine-induced killer，細胞因子誘導的殺傷細胞)是將人外周血單 個核細胞(？811〇在體外用多種細胞因子(抗0^(^、11-2、正^丫、幾-1€ [等)共同培養(yǎng)一段 時間后獲得的一群異質細胞。CIK細胞被稱為NK樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤 活性和NK細胞的非MHC(主要組織相容性復合體）限制性殺瘤優(yōu)點，其主要效應細胞是CD3+ ⑶56+細胞。
[0003] CIK細胞能夠通過以下三種途徑殺滅腫瘤細胞和病毒感染細胞：
[0004] ① CIK細胞對腫瘤細胞和病毒感染細胞的直接殺傷:CIK細胞可以通過不同的機制 識別腫瘤細胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導致腫瘤細胞裂解。
[0005] ②CIK細胞釋放的大量炎性細胞因子具有抑瘤殺瘤活性:體外培養(yǎng)的CIK細胞可以 分泌多種細胞因子，如IFN- y、TNF_a、IL-2等，不僅對腫瘤細胞有直接抑制作用，還可通過 調節(jié)機體免疫系統(tǒng)反應性間接殺傷腫瘤細胞。
[0006] ③CIK細胞能夠誘導腫瘤細胞的凋亡:CIK細胞在培養(yǎng)過程中表達FasL( II型跨膜 糖蛋白），F(xiàn)asL通過與腫瘤細胞膜表達的Fas(I型跨膜糖蛋白）結合，誘導腫瘤細胞凋亡。
[0007] 由于CIK細胞具有可以全身性治療腫瘤，并且對人體無明顯副作用，治療無明顯疼 痛感等優(yōu)勢，CIK細胞治療被廣泛應用于臨床治療，并取得良好效果。CIK細胞治療技術是目 前最有效、最安全的輔助治療方法。如今，很多實驗室和醫(yī)院CIK細胞治療中使用的CIK細胞 大多數(shù)為小規(guī)模培養(yǎng)獲得，具體方法為:從外周血中分離得到單個核細胞，用含l〇v/V%FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基和IFN- y在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，通過添加IL-2促進CIK細胞在體外大量擴 增，再分裝到多個培養(yǎng)瓶中或者轉入培養(yǎng)袋中擴增培養(yǎng)?，F(xiàn)有CIK細胞的培養(yǎng)規(guī)模小，操作 復雜，步驟繁瑣，擴增倍數(shù)低，所擴增得到的數(shù)量不夠用于臨床治療，而且培養(yǎng)密度不能過 高，浪費培養(yǎng)基，不利于節(jié)約成本和培養(yǎng)空間。此外表面抗原表達量低，殺傷效果差。

【發(fā)明內容】

[0008] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種生物反應器及其攪拌槳和使用其培 養(yǎng)CIK細胞的方法。
[0009] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0010] -種使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，攪拌槳外包裹有減小剪切力的材料。 [0011]優(yōu)選地，所述使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，包括以下步驟：
[0012]用X-VIV0 15培養(yǎng)基將PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，添加 1% 培養(yǎng)基體積的IFN- y溶液，在37°C、5 %C02條件下培養(yǎng)，第二天各添加 1 %培養(yǎng)基體積的IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續(xù)培養(yǎng)，當培養(yǎng)體系達到一定體積后，轉入生物反應器 中繼續(xù)培養(yǎng)至兩周，每2~3天補充適量的培養(yǎng)基和IL-2;
[0013] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml， IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。
[0014] 優(yōu)選地，所述IFN- y溶液的濃度為300U/ml，IL-la溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶 液的濃度為200U/ml，0KT-3溶液的濃度為500U/ml。
[0015]優(yōu)選地，在生物反應器中培養(yǎng)CIK細胞的條件為：溶氧量為50%，pH7.2，攪拌速度 為45rpm〇
[0016]優(yōu)選地，當培養(yǎng)體系大于500ml時，轉入2L生物反應器中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0017] 優(yōu)選地，所述PBMC通過以下方法獲得：
[0018]外周血和生理鹽水按體積比1:1進行稀釋得到血液稀釋液，將其加至二分之一倍 體積的淋巴細胞分離液上方，升降速調為0,800g離心30min，取單個核細胞層，用RPMI1640 培養(yǎng)基清洗兩次，用X-VIV0-15培養(yǎng)基重懸細胞即得PBMC。
[0019] -種生物反應器攪拌槳，所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0020] -種生物反應器，所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。
[0021] 優(yōu)選地，所述減小剪切力的材料為醫(yī)用硅膠管或食用橡膠管。
[0022] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0023] 1、本發(fā)明使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞，在攪拌槳外包裹可以減小剪切力的材料， 可以降低細胞受到的剪切力傷害，有利于細胞大量擴增。
[0024] 2、本發(fā)明使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞，在培養(yǎng)過程中不停的攪拌，為動態(tài)系統(tǒng)， 有利于細胞進行氣體交換和為細胞提供均一的培養(yǎng)環(huán)境，有利于細胞大量擴增。
[0025] 3、本發(fā)明使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞，在保證細胞質量的前提下，能夠顯著提高 細胞培養(yǎng)密度，有利于節(jié)約培養(yǎng)基和培養(yǎng)空間。
[0026] 4、本發(fā)明使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞，更接近人體內三維生長環(huán)境，與使用培養(yǎng) 瓶、培養(yǎng)袋等細胞貼壁生長的培養(yǎng)方式相比，更利于細胞大量擴增，可以大規(guī)模培養(yǎng)CIK細 胞，而且所得CIK細胞表面抗原表達量較高，對腫瘤細胞的殺傷活性較強。
【附圖說明】
[0027] 圖1為實施例1培養(yǎng)的CIK細胞的流式檢測結果。
[0028] 圖2為對比例1培養(yǎng)的CIK細胞的流式檢測結果。
[0029] 圖3為對比例2培養(yǎng)的CIK細胞的流式檢測結果。
[0030] 圖4為CIK細胞對K562細胞的殺傷活性結果。
【具體實施方式】
[0031]為了更好的說明本發(fā)明，下面結合附圖和具體實施例做進一步說明。本發(fā)明中所 用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再贅述。 [0032] CIK細胞是PBMC在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質細 胞，其主要效應細胞是⑶3+⑶56+細胞。PBMC可以使用現(xiàn)有任何方法獲得，本發(fā)明中PBMC通過 以下方法制備：
[0033] 把60ml外周血轉移至離心管中，用生理鹽水按體積比1:1進行稀釋，得到血液稀釋 液;在一新離心管中加入淋巴細胞分離液，把血液稀釋液緩慢添加至淋巴細胞液層上方，形 成明顯的分界線，其中，淋巴細胞分離液與血液稀釋液的體積比為1:2;升降速調為0,800g 離心30min，離心結束后，用巴氏吸管小心抽取單個核細胞層至另一新離心管中，往該離心 管中添加RPMI1640培養(yǎng)基清洗細胞，300g離心5min，棄上清，再次添加RPMI1640培養(yǎng)基清洗 細胞，300g離心5min，棄上清；用X-VIVO-15培養(yǎng)基重懸細胞得到PBMC懸液。取20yl PBMC懸 液用臺盼藍染色法(臺盼藍與PBMC懸液體積比為1:1)進行計數(shù)。
[0034] 實施例1
[0035]自2L生物反應器(購自北京元唐盛興科技有限公司，美國BELLC0)中取出攪拌槳， 在攪拌槳外套上醫(yī)用硅膠管，紫外照射滅菌后，重新將攪拌槳裝回生物反應器內。使用該生 物反應器培養(yǎng)CIK的方法如下：
[0036] 取2 X 107個PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養(yǎng)基接種于T75培養(yǎng) 瓶中，并添加1 %培養(yǎng)基體積的IFN- y溶液，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續(xù)培養(yǎng)，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養(yǎng)基體積的1%。根據(jù)細胞的擴增情況，進行分瓶培養(yǎng)，當培養(yǎng)體系總量大于500ml時，將 其轉入2L生物反應器中，按照溫度37 °C，C02通氣量為5 %，溶氧量為50 %，pH為7.2，攪拌速 度為45rpm的條件繼續(xù)培養(yǎng)至兩周，培養(yǎng)基為含1~10U/ml IL-2的X-VIV0 15培養(yǎng)基。
[0037] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml， IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml，IL-la溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為200U/ml，0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0038] 整個培養(yǎng)過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數(shù)并補充適量的 培養(yǎng)基和IL-2,培養(yǎng)體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0039] 對比例1
[0040] 取2 X 107個PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養(yǎng)基接種于T75培養(yǎng) 瓶中，并添加1 %培養(yǎng)基體積的IFN- y溶液，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續(xù)培養(yǎng)，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養(yǎng)基體積的1%。根據(jù)細胞的擴增情況，進行分瓶培養(yǎng)，當培養(yǎng)體系總量大于500ml時，將 其轉入2L培養(yǎng)袋中繼續(xù)培養(yǎng)至兩周，培養(yǎng)條件與實施例1相同。
[0041] 所述IFN-y溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml， IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml，IL-la溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為200U/ml，0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0042] 整個培養(yǎng)過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數(shù)并補充適量的 培養(yǎng)基和IL-2,使細胞密度為1 X 106cells/ml，培養(yǎng)體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0043] 對比例2
[0044] 取2 X 107個PBMC，按照1 X 106cells/ml的密度用X-VIV0 15培養(yǎng)基接種于T75培養(yǎng) 瓶中，并添加1 %培養(yǎng)基體積的IFN- y溶液，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，第二天添加IL-la 溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續(xù)培養(yǎng)，IL-la溶液、IL-2溶液以及0KT-3溶液的添加量為 培養(yǎng)基體積的1%。根據(jù)細胞的擴增情況，進行分瓶培養(yǎng)，當培養(yǎng)體系總量大于200ml時，則 進行分瓶培養(yǎng)，每瓶培養(yǎng)體積不超過200ml，培養(yǎng)至兩周。
[0045] 所述IFN- y溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml， IL-2溶液的濃度為100~1000U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。本實施例中IFN-y 溶液的濃度為300U/ml，IL-la溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為200U/ml，0KT-3溶 液的濃度為500U/ml。
[0046] 整個培養(yǎng)過程中觀察并記錄細胞生長情況，每2~3天進行細胞計數(shù)并補充適量的 培養(yǎng)基和IL-2,使細胞密度為1 X 106cells/ml，培養(yǎng)體系中IL-2的濃度為1~10U/ml。
[0047]效果實施例1
[0048]在各實施例、對比例培養(yǎng)結束后收集CIK細胞，采用臺盼藍染色法進行細胞計數(shù)， 計算細胞的擴增倍數(shù)，結果如表1所示。
[0049]表1、CIK細胞擴增倍數(shù)、活力、培養(yǎng)體積以及細胞密度表
[00511由表1可知，使用實施例1方法培養(yǎng)CIK細胞，擴增倍數(shù)高達503倍，是對比例1擴增 倍數(shù)的近2倍，是對比例2擴增倍數(shù)的近5倍。所以，使用本發(fā)明方法培養(yǎng)CIK細胞可以大大提 高CIK細胞的擴增倍數(shù)，細胞密度大，而且保持較高的細胞活力。
[0052]效果實施例2
[0053] 在各實施例、對比例培養(yǎng)結束后收集CIK細胞，采用常規(guī)方法進行流式檢測，考察 CIK細胞的表面抗原⑶3、⑶56的表達情況，結果如表2和圖1-3所示。
[0054] 表2、⑶3+⑶56+表達量表
[0056]由表2和圖1-3可知，使用實施例1方法培養(yǎng)得到的CIK細胞，其⑶3+⑶56+表達量為 27.2%，而使用對比例1方法培養(yǎng)得到的CIK細胞的⑶3+⑶56+表達量為24.8%，用對比例2方 法培養(yǎng)得到的CIK細胞的CD3+CD56+表達量為11.5% .所以，本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的CIK細胞 的表面抗原表達量較高。
[0057]效果實施例3
[0058]在各實施例、對比例培養(yǎng)結束后收集CIK細胞，采用乳酸脫氫酶釋放法進行其對 K562細胞的殺傷活性檢測，結果如表3和圖4所示。
[0059] 表3、CIK細胞殺傷活性表
[0061 ]由表3和圖4可知，效靶比為40 :1時，實施例1中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性為 58%，對比例1和對比例2中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性分別為46%、39%;效靶比為20: 1時，實施例1中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性為42%，對比例1和對比例2中CIK細胞對 K562細胞的殺傷活性分別為31 %、22% ;效靶比為10:1時，實施例1中CIK細胞對K562細胞的 殺傷活性為17%，對比例1和對比例2中CIK細胞對K562細胞的殺傷活性分別為12%、10%。 因此，本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的CIK細胞對K562細胞的殺傷活性較高。
[0062]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1. 一種使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，攪拌槳外包裹有減小剪切力 的材料。2. 根據(jù)權利要求1所述的使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 用X-VIVO 15培養(yǎng)基將PBMC按照1 X 106cells/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，添加1%培養(yǎng) 基體積的IFN- γ溶液，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)，第二天各添加1 %培養(yǎng)基體積的IL-la溶 液、IL-2溶液以及0KT-3溶液繼續(xù)培養(yǎng)，當培養(yǎng)體系達到一定體積后，轉入生物反應器中繼 續(xù)培養(yǎng)至兩周，每2~3天補充適量的培養(yǎng)基和IL-2; 所述IFN- γ溶液的濃度為100~1000U/ml，IL-la溶液的濃度為500~2000U/ml，IL-2溶 液的濃度為100~l〇〇〇U/ml，0KT-3溶液的濃度為500~2000U/ml。3. 根據(jù)權利要求1所述的使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，所述減小 剪切力的材料為醫(yī)用硅膠管或食用橡膠管。4. 根據(jù)權利要求2所述的使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，所述IFN-γ溶液的濃度為300U/ml，IL-la溶液的濃度為500U/ml，IL-2溶液的濃度為200U/ml，0KT-3 溶液的濃度為500U/ml。5. 根據(jù)權利要求2所述的使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，當培養(yǎng)體 系大于500ml時，轉入2L生物反應器中繼續(xù)培養(yǎng)。6. 根據(jù)權利要求2所述的使用生物反應器培養(yǎng)CIK細胞的方法，其特征在于，在生物反 應器中培養(yǎng)CIK細胞的條件為:溶氧量為50%，pH7.2，攪拌速度為45rpm。7. -種生物反應器攪拌槳，其特征在于，所述攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。8. 根據(jù)權利要求7所述的生物反應器攪拌槳，其特征在于，所述減小剪切力的材料為醫(yī) 用硅膠管或食用橡膠管。9. 一種生物反應器，其特征在于，所述生物反應器的攪拌槳外包裹減小剪切力的材料。10. 根據(jù)權利要求9所述的使用生物反應器，其特征在于，所述減小剪切力的材料為醫(yī) 用硅膠管或食用橡膠管。
【文檔編號】C12N5/0783GK105821000SQ201610141283
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月11日
【發(fā)明人】王飛, 王一飛, 陳海佳, 葛嘯虎, 曾維杰
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司