細胞的培養(yǎng)方法、細胞培養(yǎng)裝置及試劑盒的制作方法
【專利說明】細胞的培養(yǎng)方法、細胞培養(yǎng)裝置及試劑盒 【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011 本申請主張基于2013年7月26日中提出的日本國申請?zhí)卦?013-155550的優(yōu)先權(quán)， 其全部內(nèi)容并入本說明書中。
[0002] 本發(fā)明涉及細胞的培養(yǎng)方法、細胞培養(yǎng)裝置及試劑盒。 【【背景技術(shù)】】
[0003] 【細胞培養(yǎng)】
[0004] 細胞在活體內(nèi)一般作為三維的集團存在，但在經(jīng)典的平面培養(yǎng)中，以細胞平鋪在 容器的形狀單層狀培養(yǎng)。多有報告，由培養(yǎng)環(huán)境的差異，細胞的性質(zhì)也大不同。另外，對于在 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的懸浮培養(yǎng)，有適宜于懸浮培養(yǎng)的細胞，也有不適宜的細胞。
[0005] SCIVAX Corporation開發(fā)的NanoCulture(注冊商標)Plate(NCP)是由納米印跡技 術(shù)，在底面實施模仿細胞外基質(zhì)的圖案化(微矩形和微蜂巢)的粘接型的3維培養(yǎng)多聯(lián)盤。微 矩形是四角形狀，微蜂巢是取六角形狀的規(guī)則的的重復(fù)結(jié)構(gòu)。通過細胞將此微圖案作為支 架利用，能動地形成球形(細胞多數(shù)凝集而成三維狀態(tài)）。
[0006] 另外，報告有使用將均一的極細胞突起(納米柱)規(guī)則地多數(shù)列的細胞培養(yǎng)片（"納 米柱細胞培養(yǎng)片"），進行結(jié)構(gòu)與活體肝臟組織接近的3維之間細胞組織體(球形）的培養(yǎng)的 事例（Takahashi et al.，Tissue Engineering Part A.June 2012，Vol. 16，No.6，ρ· 1983-1995) 〇
[0007] 特開2009-213421記載使用蜂巢狀多孔質(zhì)膜(蜂巢膜)的球形的制造方法及球形制 造裝置。
[0008] 這些細胞培養(yǎng)方法在是利用有正規(guī)則的重復(fù)圖案的片(膜），細胞粘接于片的表面 狀而增殖，由細胞培養(yǎng)形成的是同樣的形狀的細胞多數(shù)凝集而成三維狀態(tài)的球形方面共 通，在其含義中限定。需求用于將細胞更簡便地、有效、并且穩(wěn)定培養(yǎng)的方法的開發(fā)。
[0009] 【聚酰亞胺多孔質(zhì)膜】
[0010] 聚酰亞胺是指重復(fù)單位中含酰亞胺鍵的高分子的總稱，通常，芳香族化合物直接 由酰亞胺鍵連接的芳香族聚酰亞胺。芳香族聚酰亞胺由于芳香族和芳香族經(jīng)酰亞胺鍵而具 有共價結(jié)構(gòu)，具有剛直且強固的分子結(jié)構(gòu)，并且，由于酰亞胺鍵具有強的分子間力，有非常 高的水平的熱、機械、化學(xué)性質(zhì)。
[0011] 聚酰亞胺多孔質(zhì)膜，自本發(fā)明前，以濾器、低介電常數(shù)膜、燃料電池用電解質(zhì)膜等， 特別是以電池關(guān)系作為中心的用途利用。國際公開W02010/038873、特開2011-219585、及特 開2011-219586記載了，特別是，氣體等的物質(zhì)透過性優(yōu)良，空孔率高，兩表面的平滑性優(yōu) 良，相對強度高，也不涉及高空孔率，有多數(shù)對向膜厚度方向的壓縮應(yīng)力的耐力優(yōu)良的大空 隙的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜。
[0012] 【現(xiàn)有技術(shù)文獻】
[0013] 【專利文獻】
[0014] 專利文獻 1:特開2009-213421
[0015] 專利文獻 2:W02010/038873
[0016] 專利文獻 3:特開2011-219585
[0017] 專利文獻 4:特開2011-219586 [0018]【非專利文獻】
[0019] 非專利文獻 1: Takahashi et al ·，Tissue Engineering Part A· June2012， Vol.16,No.6,p.1983-1995 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0020] 【發(fā)明要解決的技術(shù)課題】
[0021] 本發(fā)明涉及細胞的培養(yǎng)方法、以及用于所述培養(yǎng)方法的細胞培養(yǎng)裝置及試劑盒。 [0022]【解決課題的技術(shù)方案】
[0023]不以限定為囝的，但本發(fā)明優(yōu)選含以下的實施方式。
[0024]【實施方式1】
[0025] 細胞的培養(yǎng)方法，其包括將細胞適用于聚酰亞胺多孔質(zhì)膜，進行培養(yǎng)。
[0026] 【實施方式2】
[0027]實施方式1所述的方法，其包括將細胞接種于上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的表面的工 序。
[0028]【實施方式3】
[0029] 實施方式1所述的方法，其包括下列工序：
[0030] 在上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的干燥的表面載乘細胞懸浮液，
[0031] 放置上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜，或者移動上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜而促進液的流出， 或者刺激表面的一部分，使細胞懸浮液被吸入上述膜，進而
[0032] 使細胞懸浮液中的細胞蓄積到上述膜內(nèi)，使水分流出。
[0033]【實施方式4】
[0034]實施方式1所述的方法，其包括下列工序：
[0035]將上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜之一面或兩面用細胞培養(yǎng)基或滅菌的液體潤濕，
[0036]向上述潤濕的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜裝填細胞懸浮液，進而
[0037]使細胞懸浮液中的細胞蓄積到上述膜內(nèi)，使水分流出。
[0038]【實施方式5】
[0039] 實施方式4所述的方法，其中活細胞停留在上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜內(nèi)，死細胞與水 分一同流出。
[0040] 【實施方式6】
[0041 ]實施方式4或5所述的方法，其中上述滅菌的液體是滅菌水或滅菌的緩沖液。
[0042]【實施方式7】
[0043]實施方式1~6之任一項所述的方法，其包括向細胞培養(yǎng)容器中放入細胞培養(yǎng)基、 細胞及1個或其以上的上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜，其中，聚酰亞胺多孔質(zhì)膜處于懸浮于細胞培 養(yǎng)基中的狀態(tài)下。
[0044]【實施方式8】
[0045]實施方式7所述的方法，其特征在于使用2個以上的上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的小 片。
[0046] 【實施方式9】
[0047] 實施方式7或8所述的方法，其中細胞自發(fā)粘接到上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜。
[0048]【實施方式10】
[0049] 實施方式1~6之任一項所述的方法，其中將上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜
[0050] (i)折疊，
[0051] (ii)卷成卷狀，
[0052] (iii)將片或小片用絲狀的結(jié)構(gòu)體連接，或者
[0053] (iv)結(jié)成繩狀
[0054]而在細胞培養(yǎng)容器中的細胞培養(yǎng)基中懸浮或固定。
[0055]【實施方式11】
[0056]實施方式10所述的方法，其中細胞自發(fā)粘接到上述聚酰亞胺多孔質(zhì)膜。
[0057]【實施方式12】
[0058]實施方式1所述的方法，其包括將2個以上的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜上下或左右積層到 細胞培養(yǎng)基中使用。
[0059]【實施方式13】
[0060]實施方式1所述的方法，其中將實施方式2-12之任一項所述的方法的2種或更多種 方法組合使用。
[0061]【實施方式14】
[0062]實施方式1~13之任一項所述的方法，其中細胞在聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的表面及內(nèi) 部生長增殖。
[0063]【實施方式I5】
[0064]實施方式1~14之任一項所述的方法，其中細胞選自動物細胞、昆蟲細胞、植物細 胞、酵母菌及細菌。
[0065]【實施方式16】
[0066] 實施方式15所述的方法，其中動物細胞是屬于脊椎動物門的動物來源的細胞。
[0067] 【實施方式17】
[0068] 實施方式15所述的方法，其中細菌選自乳酸菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及藍細 菌。
[0069]【實施方式I8】
[0070] 實施方式1~14之任一項所述的方法，其中細胞選自多能性干細胞、組織干細胞、 體細胞及生殖細胞。
[0071] 【實施方式19】
[0072] 實施方式1~13之任一項所述的方法，其中細胞選自肉瘤細胞、株化細胞及轉(zhuǎn)化細 胞。
[0073]【實施方式2〇】
[0074]實施方式1~19之任一項所述的方法，其中聚酰亞胺多孔質(zhì)膜是含自四羧酸二酐 和二胺得到的聚酰亞胺的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜。
[0075]【實施方式21】
[0076]用于在實施方式1~20之任一項所述的細胞的培養(yǎng)方法中使用的細胞培養(yǎng)裝置， 其含聚酰亞胺多孔質(zhì)膜。
[0077]【實施方式22】
[0078]實施方式21所述的細胞培養(yǎng)裝置，其中2個以上的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜上下或左右 積層。
[0079]【實施方式23】
[0080] 用于實施方式1~20之任一項所述的細胞的培養(yǎng)方法中使用的試劑盒，其含聚酰 亞胺多孔質(zhì)膜。
[0081] 【發(fā)明效果】
[0082] 本發(fā)明基于向聚酰亞胺多孔質(zhì)膜適用細胞，則細胞生長的發(fā)現(xiàn)。細胞優(yōu)選自發(fā)粘 接到聚酰亞胺多孔質(zhì)膜，可在膜的表面及內(nèi)部增殖。由本發(fā)明的方法，將細胞簡便，有效，并 且穩(wěn)定培養(yǎng)變得可能。 【【附圖說明】】
[0083]【圖1】圖1顯示作為向聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的細胞懸浮液的接種形態(tài)的1實施方式自 然接種。
[0084]【圖2】圖2顯示向作為聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的細胞懸浮液的接種形態(tài)的1實施方式吸 入接種。
[0085]【圖3】圖3顯示人間質(zhì)系干細胞的自然接種時的各接種面經(jīng)時的變化。
[0086]【圖4】圖4顯示人皮膚成纖維細胞的自然接種的各接種面經(jīng)時的變化。
[0087]【圖5】圖5顯示人皮膚成纖維細胞B面接種時的觀測結(jié)果（24小時后）（濕膜法），顯 示熒光顯微鏡照片及實體顯微鏡照片。
[0088]【圖6】圖6顯示人間質(zhì)系干細胞的A面吸入接種時的經(jīng)時的變化(一點濕法）。
[0089]【圖7】圖7顯示人間質(zhì)系干細胞的B面吸入接種時的經(jīng)時的變化(一點濕法）。
[0090]【圖8】圖8顯示人間質(zhì)系干細胞含浸接種時的各觀測面經(jīng)時的變化。
[0091]【圖9】圖9是人間質(zhì)系干細胞含浸接種時的低倍率照片及關(guān)于實驗的概觀的照片。 [0092]【圖10】圖10顯示PC 12細胞吸入接種時的經(jīng)時的變化。
[0093]【圖11】圖11顯示將人皮膚成纖維細胞使用膜厚25μπι的聚酰亞胺多孔質(zhì)膜培養(yǎng)時 的細胞數(shù)。橫軸顯示培養(yǎng)后的天數(shù)，縱軸顯示膜每1平方厘米的細胞數(shù)。
[0094]【圖12】圖12顯示將人皮膚角化細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的本申請發(fā)明的方 法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0095]【圖13】圖13顯示將人臍帶靜脈內(nèi)皮細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜的本申請發(fā)明 的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0096]【圖14-1】圖14-1顯示將Vero細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(25μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0097]【圖14-2】圖14-2顯示將Vero細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(40μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0098]【圖14-3】圖14-3顯示將Vero細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(75μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0099] 【圖15-1】圖15-1顯示將HeLa細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(25μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0100] 【圖15-2】圖15-2顯示將HeLa細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(40μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0101]【圖15-3】圖15-3顯示將HeLa細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(75μπι片）的本申請發(fā) 明的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。
[0102] 【圖16-1】圖16-1顯示將CH0細胞由使用聚酰亞胺多孔質(zhì)膜(25μπι片）的本申請發(fā)明 的方法培養(yǎng)，用共聚焦激光顯微鏡及實體熒光顯微鏡觀察的結(jié)果。