非復制型病毒衍生顆粒及其用圖
【專利說明】
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年12月21日提交的美國臨時專利申請No. 61/740, 856和于 2013年6月14日提交的美國臨時專利申請No. 61/835, 310的優(yōu)先權權益，其通過引用整體 并入文本。
技術領域
[0003] 本公開內容總體上涉及非復制型病毒衍生顆粒（non-replicating virus-derivedparticle)及其作為抗癌劑的用途。
【背景技術】
[0004] 以下背景討論并不暗示或承認下文所述的任何內容在任何國家中是現(xiàn)有技術或 本領域技術人員知識的一部分。
[0005] 已通過減毒突變或缺失改造了溶瘤病毒（oncolyticvirus，0V)，其允許病毒僅在 與免疫應答受損或代謝活動增強（腫瘤發(fā)生的兩個關鍵特征）相關的細胞中復制。目前， 先進的溶瘤治療劑的實例包括單純皰疹病毒（HerpesSimplexVirus)OncoVEXGM-CSF和痘 苗病毒（JX594)。迄今為止，OV領域的主要焦點一直是開發(fā)活病毒在局部腫瘤環(huán)境中具有 優(yōu)先復制/擴散能力的平臺。
[0006] 目前，正在研究彈狀病毒（Rhabdovirusvirus，RV)(例如水皰性口炎病毒 (vesicularstomatitisvirus，VSV)和馬拉巴（Maraba)作為抗癌治療劑。在腫瘤中，不 受限制的代謝活動和受損的抗病毒程序使得病毒能夠增殖。由于傾向于病毒介導的細胞凋 亡，腫瘤對RV治療的敏感性進一步增強。
[0007] 在彈狀病毒領域中，迄今開發(fā)的溶瘤平臺利用其中病毒在腫瘤細胞之間擴散的具 有復制能力的病毒。實際上，描述使用活的具有復制/表達能力的彈狀病毒作為癌癥直接 病毒治療的報道通常將其效力與其中未觀察到可測量的效力的非復制型/非表達型病毒 對照進行比較。在這些報道中，推斷彈狀病毒基因組的復制和/或表達是腫瘤細胞毒性和 治療效力的關鍵且必需的要素。
[0008] 這些之前的研究缺少溶瘤作用反映在用于破壞病毒基因組復制和/或表達的方 法以及所使用的病毒顆粒數(shù)目。實際上，當使用這些先前的方法破壞病毒基因組復制和/ 表達時，未觀察到病毒的生物活性。此外，在這些研究中，非復制型病毒對照以與其活病毒 對應物相同的劑量而非更高的劑量施用以確保每個細胞都遇到非復制型顆粒。
[0009] 作為替代且優(yōu)選更有效地，期望治療和治愈大多數(shù)癌癥形式的方法。例如，患有急 性成淋巴細胞白血病或急性髓細胞白血病的大多數(shù)成年患者的結果依然不佳。這部分地歸 因于這些疾病的顯著的免疫受損性質。對于少數(shù)患者而言，抗腫瘤免疫應答通過在于清髓 性預處理（myeloablativeconditioning)后進行同種異體干細胞移植而得以部分地恢復。 這種治療具有潛在的治愈性，但與頻繁的不良事件和顯著的治療相關死亡率有關。對于很 多患有慢性期慢性髓細胞白血?。╟hronicmyeloidleukemia，CML)的患者而言，革El向酪氨 酸激酶抑制劑（tyrosinekinaseinhibitor，TKI)治療提供了優(yōu)異的疾病控制。然而，當 發(fā)展到出現(xiàn)急性白血病性原始細胞危象（blastcrisis)時，由于多藥抗性的出現(xiàn)和這種形 式的頑固性白血病的快速動力學，存在非常有限的治療選擇。
[0010] 因此，需要特別用于免疫受損患者的作為替代的抗癌劑。所述抗癌劑憑借其設計 和組分將優(yōu)選能夠解決目前尚未滿足的臨床需求和/或克服至少一些上文所討論的問題。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 以下概述旨在向讀者介紹本文中所述的一個或更多個發(fā)明，并非旨在對他們中的 任何一個進行限定。發(fā)明可存在于本文件中任何部分所述的特征的任意組合中。
[0013] 盡管一直在尋求治療多種腫瘤類型的活OV策略，但是特別地其在造血系統(tǒng)惡性 腫瘤中的應用因若干因素而變得復雜。病毒體的產生有限和在白血病細胞間的擴散降低要 求高劑量的病毒治療來克服這些低效性。然而，在正常組織中不受控制的活病毒擴散和脫 靶作用使這種方法的安全性受損，特別是在免疫抑制患者中。
[0014] 與使用活病毒相關的問題包括：1)安全性，其依賴于活彈狀病毒只在病變腫瘤組 織中擴散而不干擾健康組織的能力；2)低劑量施用，因為向患者引入活的可擴散病毒需要 施用相對低劑量的這些活病毒劑以確保安全性；3)從腫瘤向活病毒的免疫轉移，其有效地 降低抗腫瘤免疫應答的效力；和4)與野生型病毒相比，設計有針對腫瘤之傾向的經(jīng)改造活 病毒具有受損的產生能力，并因此從制備方面來看，制劑效率和生產成本是次最佳的。
[0015] 先前已表明，用被改造成缺失糖蛋白基因（阻止最后的病毒體裝配和擴散）的 VSV(VSVAG)進行瘤內注射引起抗腫瘤免疫應答。然而，用VSVAG治療不能使散布的腫 瘤體發(fā)生顯著減少，這部分地歸因于不能制備和遞送治療有效的劑量。
[0016] 作者知曉沒有報道詳述非復制和非表達型彈狀病毒衍生平臺作為抗癌治療劑的 用途。本公開內容的非復制型病毒衍生顆粒（non-replicatingvirus-derivedparticle， NVRP)，特別是非復制型彈狀病毒衍生顆粒（non-replicatingrhabdovirus-derived particle，NRRP)是被修飾以缺乏在細胞之間擴散的能力的野生型病毒顆粒。一旦被改造， 非復制型病毒衍生顆粒（NVRP)就不能維持病毒體復制。
[0017]NVRP的獨特之處在于其保留對永生化細胞的向性（tropism)，例如溶細胞向性。 這意味著NVRP將優(yōu)先在永生化細胞（例如腫瘤細胞或癌細胞以及經(jīng)轉化的永生化細胞） 中誘導細胞死亡。NVRP的特別實例對永生化細胞具有先天性和/或適應性免疫刺激特性。
[0018] 在一方面，本公開內容描述了一種非復制型彈狀病毒衍生顆粒，其缺乏在細胞之 間擴散的能力但對永生化細胞具有向性。所述向性可以是溶細胞向性。所述非復制型彈狀 病毒衍生顆粒可具有對永生化細胞的先天性或適應性免疫刺激特性。
[0019] 在另一方面，本公開內容提供了非復制型彈狀病毒衍生顆粒治療過度增殖細胞群 或癌細胞群的用途。所述過度增殖細胞群優(yōu)選具有造血性，并且優(yōu)選是白血病細胞。所述 過度增殖細胞群可以是實體瘤細胞。
[0020] 在又一方面，本公開內容描述了一種治療具有過度增殖細胞群或癌細胞群的患者 的方法。所述方法包括向所述患者施用非復制型病毒衍生顆粒。所述過度增殖細胞群可優(yōu) 選具有造血性，優(yōu)選是白血病細胞。過度增殖細胞群可以是實體瘤細胞。
[0021] 本領域的普通技術人員在閱讀下文中結合附圖對本發(fā)明一些特定實施方案的描 述后，本公開內容的其他方面和特征將變得明顯。
[0022] 附圖簡述
[0023] 現(xiàn)在，將參考附圖僅作為示例對本公開內容的一些實施方案進行描述。
[0024] 圖IA是顯示UV劑量對Vero和HDFN細胞之NRRP介導的細胞毒性的影響的圖。在 UV-誘導的NRRP產生之后沒有檢測到GFP信號。在感染后72小時，使用刃天青（resazurin) 測定對生存力進行量化。將該實驗的MOI設定為100個顆粒/細胞。誤差條表示三個平行 實驗之間的標準差。
[0025] 圖IB是顯示MOI對Vero和HDFN細胞中NRRP誘導的細胞毒性的影響的圖，如作 為函數(shù)MOI的生存力所示。在感染后72小時，使用刃天青測定對生存力進行量化。誤差條 表示三個平行實驗之間的標準差。
[0026] 圖2A是通過于感染后或處理后24小時和72小時對經(jīng)PBS、活VSV-GFP或NRRP處 理的Vero細胞拍攝的熒光和亮視野顯微圖像顯示Vero永生化細胞中的NRRP細胞毒性的 圖像組。將這些試驗中所使用的感染復數(shù)（multiplicityofinfection，M0I)設定為100 個顆粒/細胞。
[0027] 圖2B是顯示通過在處理后72小時對細胞生存力進行刃天青量化的NRRP細胞毒 性的圖。誤差條表示三個平行實驗之間的標準差。
[0028] 圖2C是顯示所產生的病毒滴度的圖。NAN指"非數(shù)"，此時未檢測到病毒體。
[0029] 圖3A是經(jīng)PBS、活馬拉巴病毒和馬拉巴病毒衍生NRRP處理的白血病細胞（L1210) 和Vero細胞的熒光顯微圖像組（4X)。圖像拍攝于處理后24小時。
[0030] 圖3B是顯示從腫瘤細胞獲得的病毒滴度的圖。
[0031] 圖3C是顯示于感染后72小時對L1210白血病細胞和HDF正常細胞之細胞生存力 進行刃天青量化的圖。
[0032] 圖4A是顯示經(jīng)PBS、活VSV-GFP或NRRP處理的L1210細胞和Vero細胞的熒光圖 像的圖像組。
[0033] 圖4B是顯示由L1210急性白血病細胞和Vero永生化細胞產生的病毒滴度的圖。
[0034] 圖5是與暴露于20, 000mJ/cm2UV劑量之病毒的基因組表達相比，NRRP基因組表達 的Western印跡圖像，其中觀察到細胞毒性喪失，并且或活病毒作為對照。提及的Ix或2x 指上樣到凝膠上的蛋白質的量。蛋白質提取于感染后15小時。
[0035] 圖6A是經(jīng)化學產生的NRRP和白消安產生的NRRP處理之Vero細胞的熒光和亮視 野圖像組。
[0036] 圖6B是經(jīng)單獨白消安以與圖6A中產生NRRP所使用的相同劑量處理15小時的 Vero細胞的亮視野顯微圖像。
[0037] 圖6C是經(jīng)活VSV-GFP處理的Vero細胞的熒光和亮視野圖像組。
[0038] 圖7A是經(jīng)NRRP處理的Vero細胞的亮視野和熒光圖像組，所述NRRP通過獲取IElO 的冷凍野生型VSV并將該制備物用15 kGy鈷-60輻照產生。
[0039] 圖7B是經(jīng)活野生型VSV-GFP處理的Vero細胞的亮視野和熒光圖像組。
[0040] 圖7C是PBS中的Vero細胞的亮視野和熒光圖像組。
[0041] 圖8A是經(jīng)PBS或NRRP以100的MOI處理的L1210細胞和HDF細胞的亮視野圖像 組。
[0042] 圖8B是顯示對白血病細胞系和正常細胞系的生存力的刃天青量化的圖。鼠細胞 系用*表不。
[0043] 圖8C是對鼠的人JurkatT細胞急性白血病、鼠A20B細胞成淋巴細胞白血病、 A301T細胞成淋巴細胞白血病和HL60急性早幼粒細胞性白血病以及GM38和HDF正常細胞 系的PBS、活VSV-GFP或NRRP處理的熒光顯微圖像組。
[0044] 圖9是顯示對經(jīng)PBS或NRRP處理之L1210細胞的AnnexinV-APC和7-AAD染色的 流式細胞術分析的圖組。
[0045] 圖10是說明對在用UV產生之NRRP和UV產生之NRRP與苯達莫司?。?00yM)的 組合作用處理72小時后取得的L1210急性白血病細胞系進行刃天青量化測定后的細胞生 存力的圖。
[0046] 圖11是說明對在用UV產生之NRRP和UV產生之NRRP與地塞米松（45yM)的組 合作用處理72小時后取得的L1210急性白血病細胞系進行刃天青量化測定后的細胞生存 力的圖。
[0047] 圖12是說明對在用UV產生之NRRP和UV產生之NRRP與多柔比星（0. 025yM)的 組合作用處理72小時后取得的L1210急性白血病細胞系進行刃天青量化測定后的細胞存 活力的圖。
[0048] 圖13是說明對在用UV產生之NRRP和UV產生之NRRP與長春新堿（0. 0125yM) 的組合作用處理72小時后取得的L1210急性白血病細胞系進行刃天青量化測定后的細胞 生存力的圖。
[0049] 圖14是說明對在用UV產生之NRRP和UV產生之NRRP與伊達比星（0. 05yM)的 組合作用處理15小時后取得的K562Ph-陽性髓細胞白血病細胞系進行刃天青量化測定后 的細胞生存力的圖。
[0050] 圖15A是由LeBoeuf等開發(fā)之模擬正常細胞和抗病毒信號傳導途徑具有缺陷的 腫瘤中刺激NRRP細胞毒性的現(xiàn)象學模型。為了說明NRRP動力學，將原始模型通過去除病 毒復制（X)進行改造。點劃線說明與腫瘤細胞相關的IFN缺陷。
[0051] 圖15B是顯示抗病毒信號傳導途徑中的缺陷與NRRP處理72小時后的生存力之間 的模擬關系的圖。
[0052] 圖15C是顯示在存在或不存在IFN的情況下MOI與正常HDF細胞中在NRRP感染 后72小時的生存力之間的體外關系的圖。
[0053] 圖15D是顯示在存在或不存在IFN的情況下MOI與白血病L1210細胞中在NRRP 處理后72小時的生存力之間的體外關系的圖。
[0054] 圖16A是經(jīng)PBS或NRRP處理的兩個慢性髓細胞白血病-原始細胞危象患者的亮 視野顯微圖像組。
[0055] 圖16B是來自人患者外周血樣品的急性白血?。–ML原始細胞危象）的熒光顯微 圖像組（4X)。從經(jīng)PBS、活VSV-GFP或編碼GFP的NRRP處理的外周血收集的白血病富集樣 品。圖像為以MOI= 100感染后24小時。
[0056] 圖16C是在處理后48小時對兩個經(jīng)PBS或NRRP(M0I= 100)處理之CML原始細 胞危象患者樣品的Annexin-V和CD33染色的流式細胞術圖表，其補充圖16A和16C中所示 的數(shù)據(jù)。CD33+原始細胞群通過長期培養(yǎng)該細胞富集。
[0057] 圖16D是顯示對兩個經(jīng)PBS或NRRP處理之CML原始細胞危象患者樣品的⑶33染 色的流式細胞術分析的圖。
[0058] 圖17A是經(jīng)PBS或NRRP處理18小時的健康骨髓樣品的亮視野顯微圖像組。
[0059] 圖17B是顯示對經(jīng)PBS或NRRP處理65小時之健康骨髓樣品的Annexin-V染色的 量化的圖。
[0060] 圖18A是顯示鼠原始細胞危象處理模型中存活曲線的圖。在小鼠于第一天遭受 L1210攻擊后，使小鼠接受三個日劑量的NRRP或PBS。
[0061] 圖18B是顯示對在急性原始細胞危象期間攜帶L1210的小鼠中NRRP誘導的細胞 因子之基于Luminex的量化的圖組。經(jīng)NRRP處理小鼠之所有鑒定的細胞因子都被誘導超 過2倍，并且是統(tǒng)計學上顯著的（非配對t-檢驗pV< 0. 05)。pV已經(jīng)過校正以解釋多重 假設檢驗（Beniamini和Hochberg方法）。
[0062] 圖19是顯示免疫原性凋亡的鼠免疫活性模型中存活曲線的圖。在第一天的L1210 攻擊之前，使小鼠接受3個每周劑量的用或未用NRRP孵育的y-輻照的L1210細胞。
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