專利名稱：一種可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術及醫(yī)學領域,具體涉及可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法。
背景技術：
miRNAs是一種能夠調節(jié)基因表達長度為21_25個核苷酸的非編碼RNA鏈，具有控制細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤形成和藥物敏感性等多種細胞功能。眾所周知，miRNAs經(jīng)歷過基因擴增、基因刪除和表觀遺傳沉默等基因突變,這些基因突變最終能激活或者滅活疾病基因。在人類多種疾病中，某些miRNAs始終是失調的。這些失調的miRNAs并不局限于特定的疾病類型，而且異常表的miRNAs與臨床病情,如腫瘤分期、藥物敏感性和病人生存率等相關。此外，最近有研究表明miRNAs有助于細胞轉化、腫瘤形成和〒細胞維護。最后，miRNAs功能學研究直接觀察到特異性miRNAs在體內或者體外具有強大的抗癌活性或致癌活性。由于異常表達的miRNAs在人類疾病的發(fā)展中起著關鍵作用，通過拮抗或者恢復miRNAs的功能來糾正miRNAs的失調和缺陷將會給臨床疾病治療帶來巨大的進步?；趍iRNA的治療策略已經(jīng)成為了一個極具潛力的治療方法。為了使miRNAs成為有效的治療方法，它們應該被系統(tǒng)性調控，通過特異且高效的轉移系統(tǒng)運送到特定組織,然后被靶細胞攝入胞漿。在胞漿中，它們以完整的形式被細胞使用。miRNAs在哺乳動物細胞系用于短期基因抑制是非常有效的，但是用于轉錄水平長期穩(wěn)定的敲除靶基因是有困難的。與其它核苷酸結構類似，miRNAs在臨床應用....t存在穩(wěn)定性和轉移問題。miRNAs與siRNAs —樣，細胞膜穿透能力差、體內穩(wěn)定性有限和細胞內轉移依賴于系統(tǒng)調控。為了使miRNAs從一種實驗手段轉變成可使病人受益的臨床治療方法,我們需要一種特異性強且有效的基因轉移表達系統(tǒng)。由于慢病毒，如人類免疫缺陷病毒I，能轉染分裂細胞或者非分裂細胞并將其DNA整合到宿主細胞基因組中，因 而是一種miRNAs治療的有效運載工具。慢病毒載體通常是通過幾種不同的質粒共轉染293T人胚胎腎細胞獲得的。第一個臨床慢病毒載體產(chǎn)物來自雙質粒系統(tǒng)。為了進^-步改進該系統(tǒng)的生物安全性,慢病毒基因組被分成了 4個質粒。這些質粒分別是:自我失活的轉移質粒、編碼gag-pol蛋白包裝質粒、rev質粒和一個可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白質粒。慢病毒載體是將目的基因或者基因沉默序列穩(wěn)定轉移到細胞的最為有效的運載工具?；蜣D移伴有假構型慢病毒包膜蛋白與靶細胞膜結合和融合。然后,含有miRNAs基因或者基因沉默序列的慢病毒基因組RNA被逆轉錄成DNA，并以極高的效率與細胞的基因組永久整合。最后，miRNAs基因或者基因沉默序列在細胞內表達，產(chǎn)生細胞在基因水平上永久性改變的預期效果。嚴格控制單基因如特異性miRNAs的表達系統(tǒng)將極大的有助于復雜基因環(huán)境條件下如哺乳動物細胞miRNAs功能的研究。理想情況下,這樣一個系統(tǒng)不僅可以介導miRNAs表達活性的“開關”狀態(tài)，還可以介導在設定閾值水平F允許其有限的表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明的任務是提供一種可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術方案是:本發(fā)明提供的這種可誘導慢病毒miRNA表達載體,包含慢病毒轉移結構的基因HIV-1RNA包裝信號、5’ LTR和3’ LTR以及四環(huán)素反應元件(TRE)和EF-1 a啟動子,見圖1。本發(fā)明方案提供的生產(chǎn)細胞可以是293T腎上皮細胞系、CHO中國倉鼠卵巢細胞、COS非洲猴腎細胞系、HepG2人肝癌細胞系、BHK敘利亞倉鼠腎細胞系、Sf9昆蟲卵巢細胞系、Sf21昆蟲卵巢細胞系、293人胚腎臟細胞、ffiK 293人胚腎細胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纖維細胞系、Vero非洲綠猴腎細胞或PerC6人胚腎臟細胞。本發(fā)明可誘導表達的基因是miRNA的RNAs。本發(fā)明使用的慢病毒基因表達載體是第三代慢病毒基因轉移表達載體，即將整個慢病毒基因組分成四個質粒:自我失活的轉移質粒、編碼gag-pol蛋白包裝旗粒、rev旗粒和Iv可以編碼水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包U旲糖蛋白旗粒，miRNA的表達具有穩(wěn)定和可遺傳性,誘導慢病毒tniRNA表達載體常用于構建動物模型,如轉基因鼠。本發(fā)明提供的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法包括以下步驟:(I)構建pCR2.1-EF- a克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體，具體步驟是:①根據(jù)載體pT·RE2hyg (BD Life Science)序列(見圖 2),設計TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3 ’，含有Agel酶切位點；下游引物5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlul 酶切位點；②Clal酶切割pTRE2hyg載體(見圖3)，用步驟I所述引物PCR擴增TRE序列；(見圖4，5)③采用克隆TA cloning試劑盒,用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的PCR2.1載體連接；(見圖6.7)④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DII51,篩選陽性克隆;⑤擴增質粒,酶切鑒定；⑥酶切鑒定正確后,送公司測序；⑦根據(jù)pEP-miR 載體(Cell Biolabs, Inc)序列(見圖.8)，設計 EF-a啟動子PCR引物，上游5，-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位點；下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有seal I酶切位點,然后用PCR擴增EF-a啟動子序列,按上述步驟3-6,獲得pCR2.1-EF-1 a載體。(見圖9_13)(2)構建 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puTo 表達載體，具體步驟是:①將雙酶切法將TRE與EF- a序列從所構建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- a載體切下來；(圖14,15)②用Agel和Mlul兩個酶切位點切切割pLK0.1-puro (見圖16)，并將TRE序列與pLK0.l puro 連接，得到 pLK0.1-TRE-puro ;(見圖 17)；③將步驟2得到的pLK0.1 -TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴增EF- a啟動子序列連接，得到 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro ;(圖.18)④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a -puro轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51,雙酶切
鑒定;
⑤擴增質粒,酶切鑒定；⑥送公司測序。(3)構建EGFP表達載體，具體步驟是:①根據(jù)pEGFP-NI 載體(BD Life Science)(見圖 19)，設計 EGFP序列引物,5，-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3，,含有Scall酶切位點；下游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點 Xho I ；②PCR擴增EGFP序列；(見圖20)③將步驟2所得到得EG FP序列(圖21),經(jīng)雙酶切后，與pLK0.1連接；(見圖.22)④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克隆;⑤擴增質粒,酶切鑒定；⑥送公司測序。以慢病毒為基礎的基因治療代表著最新一代強大的、多用途載體,可以將不同的基因轉移入幾乎所有的哺乳動物細胞，包括原代培養(yǎng)細胞、非分裂細胞、腫瘤細胞和干細胞。依據(jù)本發(fā)明，構建可誘導表達系統(tǒng)可以調節(jié)miRNAs在哺乳動物細胞里的表達。在本系統(tǒng)中,miRNAs的表達受四環(huán)素反應元件和EF-1 a啟動子的控制。上述miRNAs表達系統(tǒng)與Tet-On細胞系聯(lián)合后可以調節(jié)miRNAs在哺乳動物細胞中高水平表達。加入強力霉素后,上述表達系統(tǒng)被激活。miRNAs的表達水平受不同強力霉素濃度的嚴格調控。由于可誘導慢病毒miRNAs表達系統(tǒng)能夠有效地將miRNA表達的結構基因有選擇性地整合入細胞基因組DKA,因而該系統(tǒng)可以為建立穩(wěn)定細胞系或者轉基因動物提供方便而有效的方法。實驗主要分析細胞或者轉基因動物是否能永久地維持和繼承這種受嚴格調控的表型。本發(fā)明具體技術方案包括:1.構建可誘導慢病毒miRNAs表達載體:所有用于構建哺乳動物細胞可誘導慢病毒miRNAs表達載體的必需元件都被亞克隆入pLK0.1puro載體(Sigma-Aldrich)。供載體還包含受人hPGK啟動子調控的嘌呤霉素抗性基因。從pEP-miR載體(Cell Biolabs, Inc)上擴增人EF-1 a基因啟動子。四環(huán)素反應元件來自pTRE2hyg載體(BD Life Science)。所有的PCR擴增片段通過TA Cloning試劑盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1載體。隨后，EF-1a基因啟動子和四環(huán)素反應元件通過測序加以確認。然后,EF-1 a基因啟動子和四環(huán)素反應元件用限制性內切酶從PCR2.1載體上切割下來并連接到用相應限制性內切酶消化WpLK0.1puro載體....t。EF-1a基因啟動子、四環(huán)素反應元件和引導序列再次測序確認，最后獲得可誘導慢病毒表達系統(tǒng)(強力霉素誘導miRNA表達)。上述表達系統(tǒng)包含四環(huán)素反應元件(TRE),該元件由7個42bp的Tet.操縱序列(TetO)構成的直接重復序列組成。TRE元件位于EF-1 a基因啟動子上游。因此,在無rtTA結合到TRE上時EF_1 a基因啟動子處于沉默狀態(tài)，從而阻止了 miRNA的“泄露”表達。2.慢病毒的制備:在轉染前24h，將293T細胞置于孔板內培養(yǎng)。細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1.640培養(yǎng)。細胞在無血清培養(yǎng)基或含血清的DMEM或者RPMI培養(yǎng)基中進行轉染，感染復數(shù)為50-1000pfu/cell。在37度,無血清培養(yǎng)基中孵育4小時或在含血清的DMEM或RPMI培養(yǎng)基中孵育18小時。然后，清洗細胞并更換培養(yǎng)基。轉染后48小時，收集含病毒的細胞上清液,然后在室溫下，ISOOrmp離心IOmin0此外,用來自VSV-G的包膜糖蛋白G修飾慢病毒可以擴大慢病毒轉染哺乳動物宿主細胞的范圍。3.慢病毒滴度測定:通過p24抗原ELISA實驗測定慢病毒轉染顆粒的滴度，并通過換算因數(shù)將p24的pg/ml換算成TU/ml (transducing unit per ml)。而且,慢病毒的轉染單位(TU/m:[)是通過分析可轉染KHOS細胞的慢病毒顆粒數(shù)量來確定的。滴度計算方法參考 Follenzi 和 Naldini, 2002。U-20S Tet-On cell line:U_20S骨肉瘤細胞系是一種穩(wěn)定轉染pTet-On質粒的細胞系。pTet-On在強大的巨細胞病毒立早啟動子(Pcmv)的控制下表達Tet反應性反式轉錄激活因子(rt’TA)。tTA是由Tet抑制蛋白的第1-207個氨基酸和單純皰疹病毒VP16的C末端帶負電荷的轉錄激活結構域(130氨基酸)融合而成。pTet-On系統(tǒng)類似于pTet-Off系統(tǒng)，但由于TetR中4個氨基酸的突變而轉變成rTetR,相應的tTA轉變成了 rtTA。在一個由TRE調控的基因載體轉染pTet-On細胞系后，在強力霉素(Dox)存在的情況下rtTA就結合到TRE上,從而激活基因轉錄。當DOX從培養(yǎng)基中去除時,TRE調控的基因轉錄以高度劑量依賴性的方式被關閉。4.構建EGFP表達載體:為了使誘導慢病毒載體表達EGFP,該基因編碼序列從pEGFP-NI載體(BD Life Science)上克隆下來并插入pKL0.1載體中。在pTet-On系統(tǒng)中，EGFP的表達受rtTA調節(jié)。5.miRNA的長期表達:U_20S Tet-On細胞(5X IO3Zml)接種于96孔板，次日用含miRNA-199a-3p編碼序列的慢病毒轉染細胞,并將細胞在含強力霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6周。miRNA-199a-3p 的表達用 miRNA Real-time PCR(Applied Biosystem)每周監(jiān)測一次。作為對照組，U-20S Tet-Οη細胞用表達GFP的pKL0.1-puro-CMV-TurboGFP載體轉染，其表達的監(jiān)測方法同實驗組。 6.統(tǒng)計分析:用GraphPadPrism 4軟件進行統(tǒng)計學分析。(GraphPad SoftwareInc., San Diego, Calif.，USA)可誘導慢病毒miRNA表達系統(tǒng)的優(yōu)勢:1.極其嚴格的開關調控。該表達系統(tǒng)在無誘導劑的情況下，目的miRNA的背景或者泄露表達是極其低的。2.,一注。原核調節(jié)蛋白(rtTA)引進哺乳動物細胞后，只對其特異的靶序列產(chǎn)生作用，其原因很有可能是在真核生物基因組中不存在其調節(jié)的DNA序列。3.1 度可誘導性和快速ix應時間。在Tet系統(tǒng)下,誘導反應在30min就可以檢測到。據(jù)觀察,誘導表達水平可以高達原有水平的1000倍。
4.特性明確的誘導劑。強力霉素價格低廉、性質明確,可以產(chǎn)生高度可重復性的實驗結果。
5.EF-1a啟動子伴有限制性酶切位點,便于寡核苷酸的插入。6.該表達系統(tǒng)易于有效轉染分裂和靜止期的哺乳動物細胞，包括一些難以轉染的細胞,如原代細胞、干細胞、神經(jīng)細胞和內皮細胞。此外,可誘導慢病毒miRNA表達載體可以用構建miRNA過表達的動物模型,如轉基因鼠。本發(fā)明的有效效果及特點:1.表達包含原始所有序列的miRNA前體轉錄本，并在嚴格的調控機制的控制下確保該前體轉錄本通過內源性機制加工處理后得到真正成熟的miRNAs。2.基于可誘導慢病毒的表達系統(tǒng)確保了 miRNA在廣泛的細胞系包括非分裂細胞和難轉染細胞中的表達。3.以復制缺陷型HIV和FIV為基礎的慢病毒表達系統(tǒng)的生物安全性較高。4.通過共表達EFGP熒光標記蛋白可以監(jiān)測轉染細胞。通過嘌呤霉素篩選標記可以篩選穩(wěn)定表達miRNA的陽性細胞。
本發(fā)明潛在應用方向包括:1.通過miRNA在細胞中的高表達來研究miRNA的功能。2.采用慢病毒表達系統(tǒng)，在原代細胞、腫瘤細胞、干 細胞和非分裂細胞中表達miRNA。
3.制備穩(wěn)定表達miRNA的細胞系來研究細胞傳道通路和尋找miRNA調節(jié)的靶基因。4.miRNA革巴向基因治療的臨床試驗


圖1.pKL0.1-TRE-EF-1 a載體示意圖；圖2.pPTREhyg載體結構示意圖；圖3.ClaI內切酶線性化pPTREhyg載體；圖4.酶切后線性化的pPTREhyg載體；圖5.PCR引物擴增TRE序列；圖6.PCR克隆得到的TRE序列；圖7.TRE序列插入pCR2.1載體；圖8.pEP-miR結構示意圖；圖9.BamHI酶切pEP-miR ；圖10.BamHI線性化后的pEP-miR載體;圖11.PCR引物擴曾EF-a序列；圖12.PCR擴增得到的EF-a序列；圖13.EF-a序列插入pCR2.1載體；圖14.Agel和MluI雙酶切切下TRE序列；圖15.MluI和Sal雙酶切下EF- a序列；圖
16.PLK0.1載體示意圖；圖17.TRE序列和EF- a序列插入pKL0.1載體;圖18為圖17連續(xù)圖；圖19.pEGFP-Nl載體結構示意圖；圖20.PCR擴增EGFP基因；圖21.EPGF擴增序列；圖22.EGFP載體構建流程圖；圖23.pKL0.1-TRE-EF-1 a niRNA-PuTo構建流程圖;圖24.病毒包裝過程流程圖；圖25.miRNA-199a-3p的表達量。
具體實施例方式實施例1:構建可誘導慢病毒miRNA表達載體—、實驗材料:pTRE2hyg(BD Life Science), TA cloning 試劑盒(Invitrogen),pEP-miR載體(Cell Biolabs 公司)pLK0.1 載體(Sigma-Aldrich 公司),pEGFP-Nl 載體(BDLife Science公司),瓊脂糖(生命公司)，內切酶(NEB公司)。二、構建 可誘導慢病毒miRNA表達載體:(一 )構建pCR2.1-EF- a克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體①根據(jù)載體pTRE2hyg(BD Life Science)序列，見圖2,設計TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位點；下游引物5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlul 酶切位點。②Clal酶切割pTRE2hyg載體，見圖3,用步驟I所述引物PCR擴增TRE序列，見圖4和5。③采用克隆TA cloning試劑盒,用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的PCR2.1載體連接，見圖6和7。④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌M51,篩選陽性克隆。⑤擴增質粒，酶切鑒定。⑥酶切鑒定正確后，送公司測序。⑦根據(jù)pEP-miR載體(Cell Biolabs, Inc)序列，見圖8,設計EF-a啟動子PCR引物,上游5’ -ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位點;下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3 ’,含有 seal I 酶切位點。然后用 PCR 擴增 EF- a 啟動子序列，按上述步驟3-6，獲得pCR2.1-EF-1 a載體，見圖9-13。
(二)構建 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro 表達載體①將雙酶切法將TRE與EF- α序列從所構建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- α載體切下來，圖14,15。②用Agel和Mlul兩個酶切位點切切割pLK0.1-puro,見圖16,并將TRE序列與pLK0.1-puro 連接，得到 pLK0.1-TRE-puro。見圖 17。③將步驟2得到的pLK0.Ι-TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴增EF- α啟動子序列連接，得到pLK0.1-TRE-EF-α -MCS-puro，見圖18。④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a ^puro轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51,雙酶切
鑒定⑤擴增質粒，酶切鑒定。⑥測序。(三)構建EGFP表達載體①根據(jù)pEGFP-Nl 載體(BD Life Science),見圖.19,設計 EGFP 序列引物,5’ -GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有 Scall 酶切位點；下游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點 Xhol。②PCR擴增EGFP序列，見圖20。③將步驟2所得到得EGFP序列，見圖21,經(jīng)雙酶切后,與pLK0.1連接,見圖22。④將步驟3所得到 產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克隆。⑤擴增質粒,酶切鑒定.
⑥送公司測序。(四)構建 pLK0.1-TRE-EF- a -mi RNA199a_3p-puro 表達載體(見圖 23)①.通過查閱文獻獲得miRNA-199a-3p莖環(huán)結構， 5，-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAtiUCUGCACAUUGGUUAGGC-3’并送公司合成。②退火使得包含目的miRNA表達序列寡核苷酸的前向和反向鏈分開。③用BamHl和Clal兩個酶切位點相對應的內切酶線性化慢病毒miRNA表達載體。④將退火的寡核苷酸片段連接到慢病毒載體上⑤將載體轉入細囷后師選陽性克隆。⑥測序確認,載體構建成功實施例2:實施例1構建的可誘導慢病毒miRNA表達載體在細胞內表達實驗實驗材料:raiRNA-l"a-3P(invitrogen 公司),Lent1-X HT Packaging Mix 試劑盒(clontech 公司),QuickTiterTM HIV Lentivirus Quantitationi；式齊U盒(Cell Biolabs公司),U-20S Tet-On cell line細胞,PCR引物(invitrogen公司)瓊脂糖(生命公司),內切酶(NEB公司)。慢病毒包裝:1.慢病毒載體質粒 pLK0.1-TRE-EF- α -miRNA_199a_3p_puro 和 Lent1-X HTPackaging Mix按一定比例轉染293T細胞系(實驗步驟參照Lent1-X HT Packaging Mix試劑盒說明書(見圖24)。
2.收集慢病毒，用 QuickTiter HIV Lentivirus Quantitation 試劑盒(CellBiolabs 公司)。p24ELISA并確定其效價和TU/ml。病毒滴度可獲得高達5 X 108TU/ml。U-20S Tet^On cel! line 轉染:1.將構建的重組慢病毒轉入U-20S Tet-On cell line細胞系，實驗設置3組,空白對照組，不做任何處理；陰性對照組，給予空載體；陽性對照組，給予pLK0.1-TRE-EF- a -mi RNA -199a-’3p - puro 02.用四環(huán)素處理細胞,誘導miRNA的表達。用Real-time PCR 確定 miRNA 的表達:miRNA-199a-3p反轉錄引物和定量PCR由introvigen公司合成,提取細胞內RNA后先合成cDNA第一鏈，在以該鏈和PCR引物，進行PCR反應,反應條件為:95°C Imin變性，9515s, 6020s, 701.5s, 42次循環(huán)。最后’以U6為內參，進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)分析陽性對照組的miRNA表顯著高于陰性對照組和空白組，因此該載體pLK0.1-TRE-EF- a -miRNA-puro 構建有效。(見圖 25)以下為本專利申請的序列表,序列表中各序列依次為:序列1:TRE序列的PCR上游引物；序列2:TRE序列的PCR下游引物；序列3:EF- a啟動子PCR上游引物；序列4:EF- a啟動子PCR下游引物;序列5 =EGFP序列PCR上游引物；序列6 =EGFP序列PCR下游引物’；序列7:miRNA-199a-3p. 環(huán)結構；序列8:TRE序列:序歹丨J 9:EF-1 a序列；序列10:PCR克隆得到的TRE序列；序列11 =PCR擴增得到的EF-a序列；序列12 =EPGF擴增序列。序列表<110>華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院〈120〉一種可誘導慢病毒miRNA表達載體及其構建方法〈160〉12<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Iaccggtagac gctgtcgaa 19<210>2<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>2acgcgtagca accaggtgt 19<210>3 <211>18
<212>DNA〈213〉人工序列<400>3acgcgtgatg cctccccg 18<210>4<211>19<212>DNA〈213〉人工序列<400>4gtcgacaccc gttgcgaaa 19<210>5<211 >22<212>DNA〈213〉人工序列<400>5gtcgacgcag ggcaataatg at 22<210>6<211>22<212>DNA〈21.3〉人工序列<400>6ctcgagcggc gggtcttgta gt 22<210>7〈211)71<212>RNA〈213〉人工序列<400>7gccaacccag uguucagacu accuguucag gaggcucuca auguguacag uagucugcac 60auugguuagg c71<210>8〈211 >31’3<212>DNA〈213〉人工序列<400>8tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag 60tgatagagaa aagtgaaagt cgagtttacc actccctatc agt.gat.agag aaaagtgaaa 120gtcgagttta ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc 180tatcagtgat ag agaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa 240gtgaaagtcg agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagctcggt 300
權利要求
1.一種可誘導慢病毒miRMA表達載體,其特征在于:該載體包含慢病毒轉移結構的基因HIV-1RNA包裝信號、5’ LTR和3’ LTR以及四環(huán)素反應元件(TRE)和EF-1 α啟動子。
2.根據(jù)權利要求1所述的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法,其特征在于:生產(chǎn)細胞是293T腎上皮細胞系、CIIO中國倉鼠卵巢細胞、COS非洲猴腎細胞系、HepG2人肝癌細胞系、BHK敘利亞倉鼠腎細胞系、Sf9昆蟲卵巢細胞系、Sf21昆蟲卵巢細胞系、293人胚腎臟細胞、HEK 293人胚腎細胞系、SODkO、NIH-3T3鼠成纖維細胞系、Vero非洲綠猴腎細胞或PerC6人胚腎臟細胞。
3.根據(jù)權利要求1所述的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法,其特征在于:可誘導表達的基因是miRNA的RNAs。
4.根據(jù)權利要求1所述的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法,其特征在于:慢病毒基因表達載體是第三代慢病毒基因轉移表達載體即將整個慢病毒基因組分成四個質粒:自我失活的轉移質粒、 編碼gag-pol蛋白包裝質粒、rev質粒和一個可以編碼水泡型口炎病毒G蛋曰(VSV-G)的包 膜糖蛋曰)貞粒。
5.根據(jù)權利要求1所述的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法,其特征在于:miRNA的表達具有穩(wěn)定和可遺傳性，誘導慢病毒miRNA表達載體常用于構建動物模型，如轉基因鼠。
6.根據(jù)權利要求1所述的可誘導慢病毒miRNA表達載體構建方法如下: (1)構建PCR2.1-EF- α克隆載體和pCR2.1-TRE克隆載體,具體步包括: ①根據(jù)載體pTRE2hyg(BDLife Science)序列，設計TRE序列的PCR引物，上游引物為5’ -ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位點；下游引物·5’ -ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有 Mlu:丨.酶切位點； ②Clal酶切割pTRE2hyg載體,用步驟I所述引物PCR擴增TRE序列； ③采用克隆TAcloning試劑盒，用T4連接酶將PCR產(chǎn)物TRE序列與線性化的pCR2.1載體連接； ④將步驟3所得到產(chǎn)物PCR2.1 -TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51，篩選陽性克隆； ⑤擴增質粒，酶切鑒定； ⑥酶切鑒定正確后，送公司測序； ⑦根據(jù)pEP-miR載體(CellBiolabs, Inc)序列，設計EF-α啟動子PCR引物，上游·5 ’ -ACGCGTGATGCCTCCCCG-3 ’,含有 Mlu:[酶切位點；下游 5 ’ -GTCGACACCCGTTGCGAAA-3 ’,含有scall酶切位點,然后用PCR擴增EF- α啟動子序列,按上述步驟3_6，獲得pCR2.1_EF_1 α載體； (2)構建pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro表達載體,具體步包括: ①將雙酶切法將TRE與EF-α序列從所構建的pCR2.1-TRE載體和pCR2.1-EF- α載體切下來； ②用Agel和Mlul兩個酶切位點切切割pLK0.1-pur ο,并將TRE序列與pLK0.1-pur ο連接，得到 pLK0.1-TRE-puro ； ③將步驟2得到的pLK0.1-TRE-MCS-puro,經(jīng)Mlul和Sal酶切，并與擴增EF- α啟動子序列連接,得到 pLK0.1-TRE-EF- a -MCS-puro ； ④將步驟3所得產(chǎn)物pLK0.1-TRE-EF- a -puro轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51，雙酶切鑒定; ⑤擴增質粒，酶切鑒定； ⑥測序。
(3)構建EGFP表達載體,具體步包括: ①根據(jù)pEGFP-Nl載體(BDLife Science), 設計EGFP序列引物，5’ -GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有 Scall 酶切位點；F 游5’ CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位點 Xhol ； ②PCR擴增EGFP序列； ③將步驟2所得到得EGFP序列,經(jīng)雙酶切后,與pLK0.1連接； ④將步驟3所得到產(chǎn)物pCR2.1-TRE載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH51,篩選陽性克??； ⑤擴增質粒,酶切鑒定； ⑥測序。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可誘導慢病毒miRNA表達載體，包含慢病毒轉移結構的基因HIV-1RNA包裝信號、5’LTR和3’LTR以及四環(huán)素反應元件(TRE)和EF-1α啟動子。該系統(tǒng)提供了一個能夠指導在哺乳動物細胞內合成miRNA的表達載體。載體使用的四環(huán)素反應元件(TRE)和EF-1α基因啟動子確保該載體在哺乳動物細胞中的高水平表達。載體在無強力霉素(DOX)存在條件下，目的miRNA的表達受抑制，而有Dox存在時，則其被誘導表達。
文檔編號C12N15/867GK103074375SQ20111032975
公開日2013年5月1日 申請日期2011年10月26日 優(yōu)先權日2011年10月26日
發(fā)明者楊操, 楊述華, 劉映樂, 葛挺, 劉先哲, 李帥, 趙伯明 申請人:華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院