成纖維激活蛋白α為靶點(diǎn)的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及以成纖維激活蛋白α為靶點(diǎn)腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA載體CpVR?FAP、重組腺病毒Ad?FAP和重組痘病毒MVA?FAP疫苗，以及DNA疫苗和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合或聯(lián)合環(huán)磷酰胺在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
【專利說明】
成纖維激活蛋白α為卽點(diǎn)的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明設(shè)及重組DNA載 體CpVR-FAP、重組腺病毒Ad-FAP和重組痘病毒MVA-FAP疫苗，W及DNA疫苗和病毒載體疫苗 組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞激活蛋白a(FAPa)就是特異性表達(dá)于腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)表面 的一種抗原分子，屬于絲氨酸蛋白酶家族，具有膠原酶和二膚基膚酶活性，在腫瘤宿主界面 基質(zhì)的降解和重建中發(fā)揮著重要作用，參與腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移，F(xiàn)APa選擇性表達(dá)于 90% W上惡性上皮性腫瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、膜腺癌、皮膚黑色素瘤等)的基 質(zhì)，胚胎組織、愈合創(chuàng)面及生理性重建的器官中，而在正常成體組織中一般無表達(dá)。運(yùn)些特 點(diǎn)使FAPa成為腫瘤發(fā)生，發(fā)展和治療等領(lǐng)域中的一個(gè)新祀點(diǎn)。近年來，CAFs及FA陽作為一種 適用于腫瘤祀向治療的祀標(biāo)正倍受關(guān)注。目前國內(nèi)外策略有：（1)利用對(duì)人源抗FAPa抗體昔 洛珠單抗Sibrotuzumab進(jìn)行的免疫療法(2)祀向FAPa的DNA疫苗和基因治療(3)改構(gòu)的FAPa 底物藥物來抑制酶活性W及FAPa酶激活式祀向前體藥物。（4)針對(duì)FAP基因的修飾導(dǎo)致FAP 基因沉默。
[0003] 因?yàn)镕AP全長具有膚水解酶活性，該活性與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移有直接的聯(lián)系，如果 用其全長來設(shè)計(jì)疫苗可能存在安全隱患，可能會(huì)迫使腫瘤生長加速，根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)的報(bào) 道采取FAP酶活突變體作為抗原，在保證水解酶活性缺失的情況下盡量保存長度W提高免 疫原性。因此本發(fā)明采用的FAP絲氨酸蛋白激酶催化功能缺失的突變體來設(shè)計(jì)疫苗。該催化 區(qū)域的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)是由氨基酸序列第624位的絲氨酸(Ser624)，702位的天冬氨酸(Asp702)和 734位的組氨酸化is734)構(gòu)成的催化Ξ聯(lián)體，其中Ser624對(duì)FA陽活性發(fā)揮至關(guān)重要，若將其 轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，F(xiàn)APa水解活性將消失;基于運(yùn)點(diǎn)本發(fā)明采用酶活缺失的點(diǎn)突變體作為抗原 設(shè)計(jì)疫苗，可W確保疫苗的安全性和效率，避免抗原大量表達(dá)加速腫瘤生長不利于治療。
[0004] 從發(fā)現(xiàn)FAPa到現(xiàn)在已用其進(jìn)行了一些的疫苗研究工作，并有一些腫瘤免疫治療策 略(CAR-T)已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，但對(duì)于疫苗來說大多數(shù)都處于臨床前探索，并且因?yàn)橹?療的腫瘤模型都是小鼠腫瘤，所W目前抗原選擇都是鼠源FAPa,采用人源FAPa作為疫苗治 療小鼠腫瘤還沒被報(bào)道過，因?yàn)槿耸笸葱暂^高(90%)，預(yù)測(cè)CTL結(jié)合抗原膚兩個(gè)種屬之間 有十分相似，所W本發(fā)明采取人源FAPa作為疫苗設(shè)計(jì)祀點(diǎn)，運(yùn)樣更有利于向?qū)砼R床治療 提供直接的數(shù)據(jù)，如果人源FA陽引起的CTL[7]可W殺傷小鼠腫瘤CAF，那么殺傷人腫瘤CAF的 可能性就越高，治療人類腫瘤的可行性也就越高。目前腫瘤疫苗進(jìn)入臨床的基因疫苗主要 是DNA疫苗，重組腺病毒疫苗和重組痘病毒疫苗，DNA載體疫苗由于免疫原性較弱，病毒載體 系統(tǒng)是最有效的基因轉(zhuǎn)運(yùn)方法，其基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率通常在90% W上，因此目前的基因治療臨 床試驗(yàn)中77% W上都是使用病毒載體。
[0005] 隨著FA陽作為一種極具潛力的抗腫瘤祀標(biāo)分子正受到關(guān)注，我們有必要在運(yùn)里總 結(jié)一下FAPa作為一種微環(huán)境抗原相對(duì)于腫瘤相關(guān)抗原的優(yōu)勢(shì)有哪些，總結(jié)起來有五點(diǎn)：（1) 90% W上的上皮性腫瘤間質(zhì)中FA陽呈陽性表達(dá)，正常組織僅限于創(chuàng)傷愈合和胚胎組織少量 表達(dá)；（2)FAPa陽性成纖維細(xì)胞是腫瘤基質(zhì)的主要構(gòu)成成分，抗原祀位十分豐富；（3)間質(zhì)成 纖維細(xì)胞是非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，與腫瘤細(xì)胞相比其基因組較穩(wěn)定，避免出現(xiàn)抗原丟失和治療耐受 的風(fēng)險(xiǎn)；（4)FA陽陽性基質(zhì)細(xì)胞主要圍繞癌巢的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞分布，運(yùn)為WFAPa為祀標(biāo) 的細(xì)胞毒性藥物選擇性富集在腫瘤血管周圍提供了有利條件；（5) W表達(dá)FA陽為標(biāo)志的CAF 和腫瘤微環(huán)境具有很強(qiáng)的免疫抑制功能，針對(duì)FAPa可W有效地減少CAF，從而破壞腫瘤微環(huán) 境，一方面減少微環(huán)境的屏障和供養(yǎng)腫瘤的功能，另一方面又可W有效地降級(jí)腫瘤微環(huán)境 起到的抑制作用，為聯(lián)合免疫治療排除了免疫抑制因素方面的威脅和障礙?？偨Y(jié)起來可W 說FAPa作為祀點(diǎn)，祀向精確，廣譜性高，過程穩(wěn)定，方便富集，針對(duì)微環(huán)境抑制和保護(hù)，可W 說一石二鳥，所W本發(fā)明選擇FAPa作為腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的祀抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明首先WFAPa為祀點(diǎn)進(jìn)行腫瘤基因疫苗的研究，分別構(gòu)建DNA載體疫苗 (CpVR-FAP)和腺病毒載體疫苗(Ad-FAP)，采用DNA初免-重組腺病毒加強(qiáng)免疫(DNA prime- rAd boost)免疫策略，通過免疫小鼠檢測(cè)FAPa基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表 明：小鼠可產(chǎn)生針對(duì)FAPa的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)(見圖9、圖10、圖11 )，該疫 苗具有一定的保護(hù)力和抗腫瘤活性，在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組比較，CpVR-FAP DNA疫苗組 腫瘤生長抑制率為22 %，CpVR-FAP/Ad-FAP疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長抑制率為23 % (見 圖12和圖13)。聯(lián)合環(huán)憐酷胺后小鼠腫瘤生長抑制率提高至87% (見圖14和圖15)。
[0007] 本發(fā)明之后又WFAPa為祀點(diǎn)構(gòu)建了痘病毒載體疫苗(MVA-FAP)，采用DNA初免-重 組痘病毒加強(qiáng)免疫(DNA prime-MVA boost)免疫策略，通過免疫小鼠檢測(cè)FAPa基因疫苗的 免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表明：小鼠同樣可產(chǎn)生針對(duì)FAPa的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)(見圖 16、圖17、圖18)，該疫苗具有一定的保護(hù)力和抗腫瘤活性，在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)中，與PBS組比較， CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長抑制率為19% (見圖19和圖20) Jrime- boostc策略聯(lián)合環(huán)憐酷胺后小鼠腫瘤生長抑制率提高至90% (見圖23和圖24)。
【附圖說明】
[000引圖1、2. DNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。圖1為CpVR載體圖譜；
[0009] 圖2為重組質(zhì)粒CpVR-FAP圖譜；
[0010] 圖3-5.重組腺病毒載體圖譜及制備流程。圖3為AdMax?腺病毒載體及重組病毒制 備流程;圖4為穿梭載體PDC316圖譜；圖5為重組穿梭載體PDC316-FAP圖譜；
[0011] 圖6-8.MVA重組原理及相關(guān)載體圖譜。圖6為MVA重組示意圖；圖7為穿梭載體 pSCll圖譜；圖8為重組穿梭載體pSCll-FAP圖譜，F(xiàn)AP結(jié)構(gòu)基因表達(dá)框架重組到MVA的TK基因 中，基因表達(dá)的啟動(dòng)子采用P7.5。
[0012] 圖9-11. W不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋己細(xì)胞的特異性CTL 殺傷活性檢測(cè)和IFN-丫分泌性T細(xì)胞檢測(cè)。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋己細(xì)胞為效應(yīng) 細(xì)胞，并用特異性抗原膚化-2d限制性)標(biāo)記的小鼠癌細(xì)胞株P(guān)815作為祀細(xì)胞，采用CFSE巧 光標(biāo)記法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答（圖9)。同時(shí)用化ISPOT法檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN- 丫的能力（圖 10)，陰性刺激物為培養(yǎng)基(R10)，陽性刺激物為FAP混合小膚。小鼠免疫前和每一針免疫后 一周進(jìn)行采血，獲得血清用FA的的蛋白包被，通過化ISA的方法檢測(cè)免疫后小鼠產(chǎn)生的特異 性抗體(圖11)。
[OOK]圖12、13.不同形式FAP基因疫苗對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫預(yù)防作用。Ba化/C 小鼠經(jīng)PBS對(duì)照組、Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP在間隔2周免疫Ξ次后一周，接種 4T1腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大小（圖12)至24天，處死統(tǒng)計(jì)瘤重情況(圖13)。
[0014] 圖14、15.不同形式FAP基因疫苗疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)比較。用 特異性抗原膚化-2d限制性)標(biāo)記的小鼠癌細(xì)胞株P(guān)815作為祀細(xì)胞，采用CFSE巧光標(biāo)記法檢 測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答（圖14)。同時(shí)用化ISP0T法檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN- 丫的能力（圖15)，陰性刺 激物為培養(yǎng)基(R10)，陽性刺激物為FAP混合小膚。
[0015] 圖16、17.不同形式FAP基因疫苗聯(lián)合環(huán)憐酷胺對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的預(yù)防作 用。在給Ba化/C小鼠皮下接種4T1腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、環(huán)憐酷胺（〔￥)^9￥尺- FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP、CpVR-FAP/CY、CpVR-FAP/Ad-FAP/CY 疫苗，測(cè)量腫瘤大?。▓D 16)至22 天，測(cè)量瘤重情況(圖17)。
[0016] 圖18-20. W不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋己細(xì)胞的特異性 CTL殺傷活性檢測(cè)和IFN-丫分泌性T細(xì)胞檢巧U。小膚混合物與P815祀細(xì)胞混合后與不同比例 皮細(xì)胞混合，采用CFSE巧光標(biāo)記法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng)答（圖18)。同時(shí)用化ISPOT法檢測(cè)T細(xì) 胞釋放IFN-丫的能力（圖19)，陰性刺激物為培養(yǎng)基(R10)，陽性刺激物為FAP混合小膚。小鼠 免疫前和每一針免疫后一周進(jìn)行采血，獲得血清用FA陽的蛋白包被，通過化ISA的方法檢測(cè) 免疫后小鼠產(chǎn)生的特異性抗體(圖20)。
[0017]圖21、22.不同形式FAP基因疫苗對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫預(yù)防作用。Balb/C 小鼠經(jīng)PBS對(duì)照組、MVA-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP在間隔2周免疫Ξ次后一周，接種 4T1腫瘤細(xì)胞，測(cè)量腫瘤大?。▓D21)至24天，處死統(tǒng)計(jì)瘤重情況(圖22)。
[001引圖23、24.不同形式FAP基因疫苗疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)比較。小 鼠脾淋己細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢測(cè)和IFN-丫分泌性T細(xì)胞檢測(cè)。用特異性抗原膚化- 2d限制性)標(biāo)記的小鼠癌細(xì)胞株P(guān)815作為祀細(xì)胞，采用CFSE巧光標(biāo)記法檢測(cè)免疫鼠的CTL應(yīng) 答（圖23)。同時(shí)用化ISP0T法檢測(cè)T細(xì)胞釋放IFN-丫的能力（圖24)，陰性刺激物為培養(yǎng)基 (R10)，陽性刺激物為FAP混合小膚。
[0019] 圖25、26.不同形式FAP基因疫苗聯(lián)合環(huán)憐酷胺對(duì)4T1腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的治療作 用。在給Ba化/C小鼠皮下接種4T1腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對(duì)照組、環(huán)憐酷胺（CY)、CpVR- FAP/MVA-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY疫苗，測(cè)量腫瘤大小（圖25)至22天，測(cè)量瘤重情況（圖 26)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] -.上述片段FA陽的制備方法和條件
[0021] l.FAPa 的制備
[0022] FA陽含有2281個(gè)堿基，GenBank號(hào)為NM_004460(沈Q ID N0:1)。根據(jù)其的序列設(shè)計(jì) 了一對(duì)引物，人腸癌患者樣本cDNA中中擴(kuò)增出了FAPa的基因片段，序列為SEQ N0:1所示的 堿基序列。具體方法如下：
[0023] l)pGEM-T-FAP的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析
[0024] 將腸癌患者樣本cDNA的擴(kuò)增FAPa的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體進(jìn)行連接得到含 有FA陽的pGEM-T-FAP質(zhì)粒。經(jīng)序列分析證實(shí)正確。
[0025] 二.重組疫苗的獲得方法及相應(yīng)的條件
[0026] 1.DNA載體疫苗
[0027] l)CpVR-FAP 的構(gòu)建
[002引 CpVR載體含有CpG基序，CMV啟動(dòng)子，卡那霉素抗性基因，內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯 終止信號(hào)等常規(guī)部件組成，共4913bp，圖譜見圖1dWpGEM-T-FAP為模板，WF3和F4為引物通 過PCR擴(kuò)增序列（SEQ ID NO: 1)，正向引物F3引入Bgl 11和Sal I的酶切位點(diǎn)，反向引物F4引入 了 Κρη I、Sa 11和BamHI的酶切位點(diǎn)。
[0029] 將上述制得的PCR產(chǎn)物和載體經(jīng)Bglll和BamHI雙酶切后用膠回收試劑盒（北京天 根生化科技有限公司）回收基因片段和載體片段，雙酶切后具有相同粘性末端運(yùn)一性質(zhì)將 所回收的目的基因片段和載體片段，WT4DNA連接酶，在16°C下連接過夜。用所得連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO(invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培 養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)1化，l，20(K)rpm離屯、收獲菌體，用質(zhì)粒 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，用Bglll和BamHI進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒 定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒CpVR-FAP，圖譜見圖2。
[0030] 2.重組腺病毒疫苗(Ad-FAP)的獲得
[0031] 腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié) 構(gòu)，直徑約80-110皿。腺病毒基因組的兩端各有一段l(K)bp的反向末端重復(fù)序列（ITR)，是復(fù) 制的起始位點(diǎn)。在左端ITR的3M則有一段長約3(K)bp的包裝信號(hào)(Φ)介導(dǎo)腺病毒基因組包裝 入病毒衣殼。對(duì)腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(hào)(Φ)的約0.化b的序列是順式作 用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可W通過輔助病毒（或細(xì) 胞)反式補(bǔ)足。
[0032] 本實(shí)驗(yàn)中采用的腺病毒系統(tǒng)是AdMax? Adenovirus載體系統(tǒng)(Microbix公司），該 系統(tǒng)是位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，位點(diǎn)特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組 的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重組酶 只能催化特異性位點(diǎn)間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組，因 而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點(diǎn)特異性重組又稱保守重組，該重組過程不需 RecA酶參與。目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、化P和BP均為 特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、祀位點(diǎn)及重組機(jī)制十分相似， loxP、FRT和attBP為特異性位點(diǎn)，也有相似的結(jié)構(gòu)。AdMaxTM Adenovirus載體應(yīng)用的是化e/ loxP系統(tǒng)，Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個(gè)氨基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點(diǎn)特異 性重組發(fā)生所需的特異性重組酶，其識(shí)別位點(diǎn)被稱為loxP(locus of crossing-over P1)， 為一段34bp的DNA序列，由兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的不對(duì)稱間隔序列（又稱為 核屯、序列）組成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。loxP位點(diǎn)堿基重排后形成 十字形的結(jié)構(gòu)，核屯、序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識(shí)別與重組的 位點(diǎn)，對(duì)稱的13bp反向重復(fù)序列是化e重組酶結(jié)合的序列。
[0033] AdMaxTM Adenovirus載體系統(tǒng)是由穿梭載體和骨架載體(pBHGlox Δ E1,3Cre)構(gòu) 成，各含有一個(gè)同向排列的LoxP位點(diǎn)，其中骨架載體還含有由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的Cre基因。將 穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株293,骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達(dá)，介導(dǎo)兩 個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因 W及Cre基因，同 時(shí)完成目的基因的插入。由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成 有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(hào)(Φ)，而穿梭載體則含有Φ，因此只有在兩個(gè)載體 之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒;另外，骨 架載體缺失E1基因，因此需要轉(zhuǎn)染組成型表達(dá)E1蛋白的293細(xì)胞。將骨架載體和穿梭載體 (本研究選用的穿梭載體為PDC316,圖譜見圖4)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用293細(xì)胞中的E1蛋白， 10左右天就可W產(chǎn)生出含有外源基因的重組腺病毒隧斑(見圖3)，挑取隧斑，進(jìn)行PCR(反應(yīng) 條件為:951：3〇3、531：3〇3、72°(：1111111，進(jìn)行30個(gè)循環(huán))鑒定，選取正確的克隆進(jìn)行大量擴(kuò)增、 純化和滴度測(cè)定。
[0034] 1)穿梭重組質(zhì)粒PDC316-FAP的獲得
[0035] 將PGEM-T-S8用Bglll/Sall雙酶切后回收得到FAPa目的片段，將PDC316用Bglll/ Sail雙酶切后回收作為載體，利用Bglll/Sall具有相同粘性末端的性質(zhì)，將回收目的基因 片段和載體片段進(jìn)行用T4DNA連接酶，16度連接過夜。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 ToplO(Invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌 落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，l，2000巧m離屯、收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天 根生化科技有限公司）提取質(zhì)粒，用Bglll/Sall進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到 了重組質(zhì)粒PDC316-FAP(圖譜見圖5)質(zhì)粒。
[0036] 2)Ad-FAP重組病毒的獲得
[0037] 將pBHGloxAEl，3Cre和PDC316-FAP共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，經(jīng)過四輪篩選、擴(kuò)增、純化 后，獲得含有FA陽片段的重組腺病毒Ad-FAP。
[003引 3.重組MVA疫苗(MVA-FAP)的獲得
[0039] 改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量 大等優(yōu)點(diǎn)使其得W廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療中。MVA含有胸巧激酶基因（TK)(參見圖6); PSCIU參見圖7)是它的穿梭質(zhì)粒，具有多克隆酶切位點(diǎn)可W插入外源基因、具有胸巧激酶 的左臂和右臂（TKL、TKR)可W與MVA進(jìn)行同源重組，同時(shí)含有l(wèi)acZ基因，可W用于重組MVA (rMVA)的藍(lán)斑篩選。
[0040] 1)穿梭重組質(zhì)粒pSCll-FAP的獲得
[0041 ] 將CpVR-FAP和pSCll經(jīng)Sail/時(shí)nl雙酶切后回收，將回收目的基因片段FAPa和 pSCl 1載體片段用T4DNA連接酶，16度連接過夜。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplO (invi化ogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于 5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，1200化pm離屯、收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化 科技有限公司）提取質(zhì)粒，用Sall/Kpnl進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì) 粒 pSCll-FAP(見圖8)。
[0042] 2)MVA-FAP重組病毒的獲得
[0043] 首先 W滴度 0.05pfu/cell 的 MVA 感染 tk-tsl3 細(xì)胞（購自 ATCC，ATCC 號(hào)為 CR^ 1632?，是不含有TK基因的BHK-21的突變株）。感染2小時(shí)后，利用Lipofection2000 (INVITR0GEN)的方法將pSCll-FAP轉(zhuǎn)染到感染了 MVA的tk-tsl3細(xì)胞中。MVA在tk-tsl3細(xì)胞 內(nèi)復(fù)制的過程中，由于pSCl 1-FAP具有與MVA的TK基因同源的T化和TKR，所W有一定比例的 MVA病毒與pSCl 1-FAP發(fā)生重組，結(jié)果FA陽和LacZ閱讀框架被重組到MVA病毒基因組中，形成 MVA-FAP重組病毒。W上被感染細(xì)胞培養(yǎng)Ξ天后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，超聲波處理，300化pm 離屯、lOmin除去細(xì)胞殘?jiān)Ａ羯锨?。取一定量上清，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成 1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6，感染*4-*813細(xì)胞2}1。將等體積的在42°(：下預(yù)溫的2%低烙點(diǎn)瓊脂 糖和2 X DMEM-10/Br加(化加，5-漠脈喀晚，可被TK憐酸化，憐酸化的化加可滲入到野生型 MVA中，產(chǎn)生致死性突變，從而可W使野生型MVA逐漸減少)培養(yǎng)基混勻，每孔加入3ml培養(yǎng) 基，在室溫下凝固，在37Γ下于含5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她。鋪上層選擇性培養(yǎng)基，成分比 下層瓊脂多了 1/120體積的4%X-gal。培養(yǎng)過夜，挑選藍(lán)色單斑，反復(fù)凍融Ξ次裂解釋放病 毒，進(jìn)行下一輪的篩選，步驟相同，如此進(jìn)行4輪W上篩選，最后直至得到只含重組病毒MVA- FAP的克隆株。經(jīng)過擴(kuò)增純化，獲得大量的重組病毒MVA-FAP。
[0044] 疫苗免疫效果
[0045] 1.FA陽疫苗免疫效果
[0046] 1.1 FAPa疫苗的免疫原性
[0047] 本部分實(shí)驗(yàn)從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面探討FAPa的DNA疫苗和重組腺病毒疫 苗共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)將Balb/C小鼠按表1進(jìn)行分組，1組在第0、2、4周注射 PBS; 2組在第0、2周注射PBS，第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4組在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗， 第四周分別注射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗;考察DNA疫苗單獨(dú)免疫的免疫效果、W及重組腺病 毒的免疫增強(qiáng)作用。
[004引表1 FAP疫苗免疫原性 [0049]
[0051 ] 1.1.1細(xì)胞免疫一細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞(CTL)活性，刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN- 丫的能力
[0052] 末次免疫后兩周處死小鼠，取脾并分離淋己細(xì)胞。W從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離 的淋己細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并W用FAP特異性抗原膚混合物標(biāo)記的P815細(xì)胞(購自ADCC)，按一 定比例混合上述效應(yīng)細(xì)胞和祀細(xì)胞，采用CFSE巧光標(biāo)記法最后通過流式檢測(cè)淋己細(xì)胞對(duì)祀 細(xì)胞的殺傷情況，用來表征所述疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度。
[0053] 本發(fā)明根據(jù)SYFPEITHI算法(WWW. syf-peithi.de)預(yù)測(cè)生存素的H-2Dd MHCI限制 性表位膚，選擇與H-2〇d MHCI的結(jié)合常數(shù)值較高的抗原膚F105-113化SPDRQFVY)，F(xiàn)275-283 (VGP犯VPVP)and F542-550(GGPCSQSVR)，作為抗原膚進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。
[0054] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖9可W看出，與PBS對(duì)照組相比，Ad-FAP組未檢測(cè)到FAP特異性CTL(p >0.05) ;CpVR-FAP組在效祀比為100:1時(shí)可檢測(cè)到CTL應(yīng)答并且統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05); CpVR-FAP/Ad-FAP組在注射了兩針DNA疫苗后又注射了 一針重組腺病毒疫苗Ad-FAP加強(qiáng)免 疫，結(jié)果在效祀比為100:1、50:1時(shí)均檢測(cè)到了特異性CTL應(yīng)答(p<0.05)，與CpVR-FAP組比 較CTL應(yīng)答也明顯提高(p<0.05)。
[0055] 圖10是W用FAP特異的限制性表位膚與相應(yīng)數(shù)目的各個(gè)疫苗組脾細(xì)胞解育，檢測(cè) 不同的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生FAP特異性IFN- 丫的情況。由圖可W看出與PBS對(duì)照組和其他疫苗 組但不加抗原膚刺激(R10)相比，Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP組，均產(chǎn)生了 FAP特異 性的IFN-丫，產(chǎn)生的IFN-丫水平依次升高，聯(lián)用組加膚實(shí)驗(yàn)組與不加膚刺激的對(duì)照組之間 相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<〇.05)，CpVR-FAP/Ad-FAP相對(duì)于CpVR-FAP組也有明顯的提高(P< 0.05)。
[0056] 1.1.2體液免疫一化ISA檢測(cè)特異性抗體
[0057] 每次免疫后1周，對(duì)小鼠進(jìn)行眼靜脈取血，加上免疫前取血共四次，將所分離血清 用于特異性抗體檢測(cè)。FAP蛋白包被化ISA板，作為檢測(cè)小鼠血清的抗原。從各實(shí)驗(yàn)組中取1: 125稀釋(稀釋液為PBS配制的1%的牛奶)的免疫血清作為第一抗體，加入1:3000稀釋的HRP 標(biāo)記抗鼠二抗，之后加入TMB顯色液顯色，每孔加入50ul 2M此S化終止后馬上用酶標(biāo)儀在 450nm處讀數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。由圖11可W看出各組產(chǎn)生了針對(duì)FAP的特異性抗體，每次免疫后 抗體水平均被增強(qiáng)，CpVR-FAP/Ad-FAP與CpVR-FAP組刺激產(chǎn)生抗體滴度水平相當(dāng)。
[0058] 由上述體液免疫和細(xì)胞免疫結(jié)果可W看出單獨(dú)應(yīng)用CpVR-FAP基因疫苗可W誘導(dǎo) 小鼠產(chǎn)生針對(duì)FAPa的特異性抗體和CTL免疫應(yīng)答。重組腺病毒疫苗在兩針針DNA疫苗免疫后 進(jìn)行加強(qiáng)免疫可明顯提高CpVR-FAP疫苗免疫組的CTL應(yīng)答水平和IFN-丫分泌能力，起到了 加強(qiáng)免疫的作用。
[0059] 1.2 FA陽疫苗的腫瘤保護(hù)性
[0060] 1.2.1 預(yù)防性
[0061] 根據(jù)前面的結(jié)果可知FAPa基因疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免 疫，本節(jié)采用FAPa的DNA疫苗和重組腺病毒疫苗進(jìn)行模型小鼠腫瘤的預(yù)防實(shí)驗(yàn)，W考察生存 素基因疫苗W及prime-boost免疫方式是否可W在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng) 答。
[0062] 表2 FAP疫苗預(yù)防分組
[0063]
[0064] 將Ba化/C小鼠按表2隨機(jī)分為4組（10只/組）。1組在第0、2、4周注射PBS;2組在第0、 2周注射PBS，第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4組在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分別注 射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗;所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右側(cè)背下部皮下接種4T1 腫瘤細(xì)胞，考察成瘤時(shí)間和腫瘤大小的變化.
[00化]1.2.1.1腫瘤生長的抑制作用
[0066] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PBS免疫組相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/Ad-FAP免疫組的模型小 鼠腫瘤生長明顯減慢.圖12、圖13為預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組腫瘤體積變化和瘤重情況，由圖可W看出 Ad-FAP免疫組與PBS對(duì)照組比較，腫瘤生長也有明顯變化;CpVR-FAP W及CpVR-FAP/Ad-FAP 免疫組與PBS組比較，小鼠腫瘤的生長緩慢，二者有顯著差異（在接種腫瘤后16-24天，p< 0.001);與CpVR-FAP單獨(dú)免疫組比較，CpVR-FAP/Ad-FAP共免疫組腫瘤生長沒有明顯緩慢。
[0067] 1.2.1.2細(xì)胞免疫一細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞(CTU活性，刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生I FN-丫的能 力
[0068] 末次免疫后兩周處死小鼠，取脾并分離淋己細(xì)胞。W從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離 的淋己細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并W用FAP特異性抗原膚混合物標(biāo)記的P815細(xì)胞(購自ADCC)，按一 定比例混合上述效應(yīng)細(xì)胞和祀細(xì)胞，采用CFSE巧光標(biāo)記法最后通過流式檢測(cè)淋己細(xì)胞對(duì)祀 細(xì)胞的殺傷情況，用來表征所述疫苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的特異性CTL反應(yīng)強(qiáng)度。
[0069] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖14可W看出，與PBS對(duì)照組相比，Ad-FAP組未檢測(cè)到FAP特異性CTL(p> 0.05); CpVR-FAP與CpVR-FAP/Ad-FA組在效祀比為100:1時(shí)可檢測(cè)到CTL應(yīng)答并且統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(p<0.05);與CpVR-FAP組比較CTL應(yīng)答沒有明顯提高(p>0.05)。
[0070] 圖15是W用FAP特異的限制性表位膚與相應(yīng)數(shù)目的各個(gè)疫苗組脾細(xì)胞解育，檢測(cè) 不同的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生FAP特異性I FN- 丫的情況。由圖可W看出與PBS對(duì)照組和其他疫 苗組但不加抗原膚刺激(R10)相比，CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP組，均產(chǎn)生了FAP特異性的 IFN-丫，產(chǎn)生的IFN-丫水平依次升高，聯(lián)用組加膚實(shí)驗(yàn)組與不加膚刺激的對(duì)照組之間相比 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<〇.〇5)，CpVR-FAP/Ad-FAP相對(duì)于CpVR-FAP組也有所提高，但不具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P大于0.05)
[0071] 1.2.2 prime-boost策略聯(lián)合環(huán)憐酷胺的預(yù)防性作用
[0072] Ba化/C小鼠隨機(jī)分為6組，攻瘤前第5,3，1周按照下表的順序進(jìn)行免疫，第0天于小 鼠右后背部皮下接種2X 1〇4 4T1細(xì)胞，腫瘤接種后第3，10，17天每只小鼠腹腔注射Img環(huán)憐 酷胺(CY).腫瘤接種后第22天，處死全部實(shí)驗(yàn)小鼠，剝瘤稱取瘤重，取脾檢測(cè)疫苗在荷瘤小 鼠體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
[0073] 表3:聯(lián)合疫苗免疫情況分組
[0074]
[0075]
[0076] 1.2.2.1腫瘤生長的抑制作用
[0077] 圖16為治療實(shí)驗(yàn)各組腫瘤體積變化情況。相對(duì)于CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP組， CpVR-FAP/CY組、CpVR-FAP/AD-FAP/CY組均能更明顯抑制腫瘤的生長(p<0.01 ;!)<0.0001); CpVR-FAP/AD-FAP/CY與CpVR-FAP/CY二組相比較，腫瘤生長速度也有所減慢，并且具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(p<〇.05)，CY與疫苗聯(lián)合應(yīng)用能起到協(xié)同和累加的效果。圖17為治療各個(gè)組腫瘤質(zhì) 量的變化情況。相對(duì)于 CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP 組，CpVR-FAP/CY 組與 CpVR-FAP/AD-FAP/ CY組抑制腫瘤的水平明顯更強(qiáng)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體數(shù)據(jù)如下：PBS肝〇叫= 1.211±0.5315g, CpVR-FAP group = 0.8±0.4586g, CpVR-FAP/Ad-FAP group = 0.8013 ± 0.3978g，CY group = 0.3788 ±0.101 Ig，CpVR-FAP/CY grow = 0.2438±0.0778g，CpVR- FAP/Ad-FAP/CY group = 0.1623±0.0703g，瘤重的數(shù)據(jù)與腫瘤生長曲線的結(jié)果相對(duì)應(yīng)，聯(lián) 合疫苗組的抑瘤率相對(duì)于CpVR-FAP/Ad-FAP組提高了53%，再次證明聯(lián)合疫苗展現(xiàn)出良好 的協(xié)同作用。
[007引 1.3 MVA-FAP疫苗的免疫原性
[0079] 本部分實(shí)驗(yàn)從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面探討FAPa的DNA疫苗和重組腺病毒疫 苗共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實(shí)驗(yàn)將Balb/C小鼠按表1進(jìn)行分組，1組在第0、2、4周注射 PBS; 2組在第0、2周注射PBS，第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4組在第0、2周注射CpVR-FAP疫 苗，第四周分別注射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗;考察DNA疫苗單獨(dú)免疫的免疫效果、W及重組 腺病毒的免疫增強(qiáng)作用。
[0080] 表4 MVA-FAP疫苗免疫原性
[0081]
[0083] 1.3.1細(xì)胞免疫水平檢測(cè)
[0084] 本組實(shí)驗(yàn)中主要通過體外檢測(cè)CD8+細(xì)胞數(shù)目和化I SPOT來評(píng)價(jià)疫苗刺激產(chǎn)生細(xì)胞 免疫水平。IFN- 丫分泌性T細(xì)胞方面檢測(cè)：處理好免疫的小鼠脾細(xì)胞，加入全長FAPa蛋白作 為刺激劑，培養(yǎng)基R10作對(duì)照，結(jié)果顯示如圖18。由圖可W看出，除PBS組外，與未加刺激對(duì)照 相比，各實(shí)驗(yàn)組刺激后T細(xì)胞分泌IFN- 丫有顯著提高。即各組都產(chǎn)生了針對(duì)FA陽特異性IFN- 丫細(xì)胞免疫反應(yīng)。而且prime-boost免疫策略的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生分泌性IFN- 丫高于DNA疫苗免疫 組(P<0.05)，符合我們的預(yù)期。同時(shí)將各組脾細(xì)胞進(jìn)行CD3XD8表面分子抗體的巧光染色， 解育一段時(shí)間后用Cell Staining buffer洗兩次，最后在重懸送去流式檢測(cè)CD8+細(xì)胞在脾 細(xì)胞的比例，結(jié)果如圖19所示，可W看出prime-boost疫苗組刺激產(chǎn)生CD8+化k例高于DNA疫 苗免疫組。1.3.2體液免疫一特異性FA陽抗體檢測(cè)
[0085] 每次免疫后1周，對(duì)小鼠進(jìn)行眼靜脈取血，加上免疫前取血共四次，將所分離血清 用于特異性抗體檢測(cè)。FAP蛋白包被化ISA板，作為檢測(cè)小鼠血清的抗原。從各實(shí)驗(yàn)組中取1: 125稀釋(稀釋液為PBS配制的1%的牛奶)的免疫血清作為第一抗體，加入1:3000稀釋的HRP 標(biāo)記抗鼠二抗，之后加入TMB顯色液顯色，每孔加入50ul 2M此S化終止后馬上用酶標(biāo)儀在 450nm處讀數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。由圖20可W看出DNA疫苗組和prime-boost組產(chǎn)生了針對(duì)FAP的特 異性抗體，每次免疫后抗體水平均被增強(qiáng)，CpVR-FAP/Ad-FAP與CpVR-FAP組刺激產(chǎn)生抗體滴 度水平相當(dāng)。
[0086] 由上述體液免疫和細(xì)胞免疫結(jié)果可W看出單獨(dú)應(yīng)用CpVR-FAP基因疫苗可W誘導(dǎo) 小鼠產(chǎn)生針對(duì)FAPa的特異性抗體和CTL免疫應(yīng)答。重組MVA-FAP在兩針針DNA疫苗免疫后進(jìn) 行加強(qiáng)免疫可明顯提高CpVR-FAP疫苗免疫組的CTL應(yīng)答水平和IFN- 丫分泌能力，起到了加 強(qiáng)免疫的作用。
[0087] 1.4 prime-boost疫苗的腫瘤保護(hù)性
[008引 1.4.1預(yù)防性
[0089] 根據(jù)前面的結(jié)果可知FAPa基因疫苗能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免 疫，本節(jié)采用FAPa的DNA疫苗和重組痘病毒疫苗進(jìn)行模型小鼠腫瘤的預(yù)防實(shí)驗(yàn)，W考察生存 素基因疫苗W及prime-boost免疫方式是否可W在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗腫瘤免疫應(yīng) 答。
[0090] 表5 MVA-FAP疫苗預(yù)防分組
[0091]
[0092] 將Ba化/C小鼠按表2隨機(jī)分為4組（10只/組）。1組在第0、2、4周注射PBS;2組在第0、 2周注射PBS，第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4組在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分別注 射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗;所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右側(cè)背下部皮下接種4T1 腫瘤細(xì)胞，考察成瘤時(shí)間和腫瘤大小的變化.
[0093] 1.4.1.1腫瘤生長的抑制作用
[0094] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與PBS免疫組相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/MVA-FAP免疫組的模型小 鼠腫瘤生長明顯減慢.圖21，22為預(yù)防實(shí)驗(yàn)各組腫瘤體積變化和瘤重情況，由圖21和22可W 看出MVA-FAP免疫組與PBS對(duì)照組比較，腫瘤生長無明顯變化;Cp VR-FAP W及Cp VR-FAP/Ad- FAP免疫組與PBS組比較，小鼠腫瘤的生長緩慢，二者有顯著差異(在接種腫瘤后22-24天，p< 0.001);與CpVR-FAP單獨(dú)免疫組比較，CpVR-FAP/MVA-FAP共免疫組腫瘤生長沒有明顯緩慢。 [00對(duì) 1.4.1.2細(xì)胞免疫一細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞(CTU活性，刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生I FN-丫的能 力
[0096] 我們通過體外檢測(cè)CTL和化ISP0T來評(píng)價(jià)疫苗產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞免疫水平。體外CTL 殺傷檢測(cè)：用FAPa特異性抗原膚混合物標(biāo)記的P815細(xì)胞作為祀細(xì)胞，被免疫小鼠中分離的 脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，按照效祀比50:1混合上述脾細(xì)胞和祀細(xì)胞，共解育一段時(shí)間后流式 檢測(cè)祀細(xì)胞被殺傷的比例。結(jié)果如圖23所示;ELISP0T檢測(cè)疫苗組脾細(xì)胞與FAP蛋白解育刺 激后產(chǎn)生IFN-丫的水平，結(jié)果Prime-boost組相對(duì)于PBS雖然展現(xiàn)了一定特異性的CTL殺傷 作用和刺激T細(xì)胞分泌IFN- 丫能力（圖24)，但是相對(duì)于DNA疫苗組，Prime-boost組的殺傷能 力和IFN-丫分泌能力沒有得到顯著的提高。
[0097] 1.4.2治療性FAP疫苗的抑瘤效果
[0098] 因?yàn)榍捌诘墓ぷ骰A(chǔ)可W確定預(yù)防性疫苗的抗腫瘤效果，而治療性疫苗的意義通 常要高于預(yù)防性疫苗，所W運(yùn)次我們直接把Ba化/C小鼠隨機(jī)分為7組檢測(cè)疫苗治療4T1的能 力，其治療效果在之前是評(píng)價(jià)過的，第0天于小鼠右后背部皮下接種2Xl〇4 4T1細(xì)胞，攻瘤 后第2,9,16天按照下表的順序進(jìn)行免疫，每次疫苗免疫前一天每只小鼠腹腔注射Img環(huán)憐 酷胺(CY)。腫瘤接種后第25天，處死全部實(shí)驗(yàn)小鼠，剝瘤稱取瘤重，取脾處理計(jì)數(shù)檢測(cè)疫苗 在荷瘤小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
[0099] Table 6治療性疫苗免疫程序
[0100]
[0101] 1.4.2.1腫瘤生長的抑制作用
[0102] 圖25和26為治療實(shí)驗(yàn)各組腫瘤體積變化情況。因?yàn)榻M數(shù)稍多，腫瘤生長曲線放在 一起比較亂，所W分為兩組展示，結(jié)果顯示相對(duì)于CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP組，CpVR- FAP/CY組、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY組均能更明顯抑制腫瘤的生長(p<0.01; !)<0.001); CpVR- FAP/MVA-FAP/CY與CpVR-FAP/CY二組相比較，腫瘤生長速度也有所減慢，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義(p<0.05)，CY與FAP疫苗聯(lián)合應(yīng)用能起到協(xié)同和累加的效果。
[0103] 從上述治療性和預(yù)防性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W看出，CpVR-FAP，W及CpVR-FAP prime-Ad- FAP/MVA-FAP boost策略能明顯抑制4T1模型小鼠腫瘤的生長，但DNA疫苗和prime-boost策 略之間沒有顯著性差異，CpVR-FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP，CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗與環(huán)憐酷胺 聯(lián)合應(yīng)用不但能顯著抑制模型小鼠腫瘤的生長而且相對(duì)與單獨(dú)疫苗組具有協(xié)同作用。因 此，我們認(rèn)為環(huán)憐酷胺與FAP疫苗聯(lián)合應(yīng)用與二者單獨(dú)應(yīng)用相比對(duì)模型鼠腫瘤的保護(hù)力和 抗腫瘤能力有明顯提高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種序列為SEQ ID NO: 1的DNA片段FAPa片段在制備用于進(jìn)行抗腫瘤免疫的蛋白疫 苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗中的用途。2. -種重組質(zhì)粒Cp VR-FAP，其特征在于所述重組質(zhì)粒骨架載體為如圖1的CpVR，在所述 CpVR的多克隆位點(diǎn)中插入一種序列為SEQ ID NO: 1的DNA片段FAPa片段;優(yōu)選地，其中所述 插入的多克隆位點(diǎn)為Bglll/BamHI。3. -種重組腺病毒Ad-FAP，其特征在于在腺病毒中插入一種序列為SEQ ID NO: 1的DNA 片段FAPa片段;優(yōu)選地，其中所述腺病毒載體構(gòu)架為pBHGlox Δ El，3Cre;更優(yōu)選地，其中所 述插入的多克隆位點(diǎn)為Bglll/Sall。4. 一種重組改良安卡拉痘病毒MVA-FAP，其特征在于在所述重組改良安卡拉痘病毒中 插入權(quán)利要求1中所述的FAPa序列;優(yōu)選地，其中所述痘病毒載體構(gòu)架為改良安卡拉痘苗病 毒MVA;更優(yōu)選地，其中所述插入的多克隆位點(diǎn)為Sa11/KpnI。5. -種疫苗組合物，包括權(quán)利要求2中的重組質(zhì)粒Cp VR-FAP;優(yōu)選地，還包括權(quán)利要求3 中的重組腺病毒Ad-FAP或/和權(quán)利要求4中的重組痘病毒MVA-FAP;更優(yōu)選地，采用Cp VR-FAP 初免，Ad-FAP或/和MVA-FAP加強(qiáng)的免疫策略。6. 權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，權(quán)利要求3所述的重組腺病毒，權(quán)利要求4所述的重組痘 病毒和權(quán)利要求5所述的疫苗組合物在制備用于治療腫瘤的疫苗中的用途;優(yōu)選地，其中所 述的疫苗還包括化療藥物;更優(yōu)選地，其中所述化療藥物選自環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、甘磷 酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、順鉑和奧沙利鉑。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105879060SQ201610363126
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】張海紅, 于湘暉, 孔維, 夏秋, 耿飛
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)