一種可穩(wěn)定自發(fā)光的重組載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可穩(wěn)定自發(fā)光的重組載體的構(gòu)建方法及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌發(fā)光基因（lux)的成功分離和表達(dá)極大地促進(jìn)了其在基礎(chǔ)和應(yīng)用研宄上的 進(jìn)展，lux基因是編碼和調(diào)控發(fā)光細(xì)菌生物發(fā)光的操縱子，它可作為報(bào)告基因，具有快速、簡(jiǎn) 便、靈敏和對(duì)細(xì)胞無(wú)傷害的優(yōu)點(diǎn)。另外，可以通過(guò)植物基因工程技術(shù)將分離出的發(fā)光基因?qū)?入較大植物和樹(shù)木上，獲得一些可以自發(fā)光的植物，夜晚可以當(dāng)路燈，減少碳的排放量。
[0003] -個(gè)完整的細(xì)菌發(fā)光系統(tǒng)由多個(gè)基因融合而成，必須在一個(gè)啟動(dòng)子下啟動(dòng)表達(dá)。 葉綠體載體具有在同一啟動(dòng)子調(diào)控之下同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因的特點(diǎn)，為細(xì)菌發(fā)光基因在 真核中表達(dá)提供了可行性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組載體。
[0005] 本發(fā)明提供的重組載體的制備方法如下1)或2)所示：
[0006] 1)所述重組載體是將葉綠體rps7基因上游同源臂、脂肪酸還原酶編碼基因、轉(zhuǎn)移 酶編碼基因、熒光素酶a亞基編碼基因、熒光素酶0亞基編碼基因、合成酶編碼基因、黃素 還原酶編碼基因和葉綠體ndhB基因下游同源臂插入葉綠體表達(dá)載體中得到的載體；
[0007] 2)所述重組載體是將所述脂肪酸還原酶編碼基因、所述轉(zhuǎn)移酶編碼基因、所述熒 光素酶a亞基編碼基因、所述熒光素酶0亞基編碼基因、所述合成酶編碼基因和所述黃素 還原酶編碼基因插入葉綠體表達(dá)載體中得到的載體。
[0008] 上述重組載體中，所述脂肪酸還原酶、所述轉(zhuǎn)移酶、所述熒光素酶a亞基、所述熒 光素酶0亞基、所述合成酶和所述黃素還原酶均來(lái)源于細(xì)菌。
[0009] 上述重組載體中，所述脂肪酸還原酶如序列表中序列表6所示；所述轉(zhuǎn)移酶如序 列表中序列表7所示；所述熒光素酶a亞基的氨基酸序列如序列表中序列表4所示；所述 熒光素酶0亞基如序列表中序列表5所示；所述合成酶如序列表中序列表8所示；所述黃 素還原酶如序列表中序列表9所示。
[0010] 上述重組載體中，所述脂肪酸還原酶編碼基因、所述轉(zhuǎn)移酶編碼基因、所述熒光素 酶a亞基編碼基因、所述熒光素酶0亞基編碼基因、所述合成酶編碼基因和所述黃素還原 酶編碼基因是以從上游至下游依次由脂肪酸還原酶編碼基因、轉(zhuǎn)移酶編碼基因、熒光素酶 a亞基編碼基因、熒光素酶0亞基編碼基因、合成酶編碼基因和黃素還原酶編碼基因串聯(lián) 而成的DNA片段插入葉綠體表達(dá)載體；
[0011] 所述DNA片段的核苷酸序列具體如序列表中序列1所示；
[0012] 所述葉綠體rps7基因上游同源臂的序列如序列表中序列2所示；
[0013] 所述葉綠體ndhB基因下游同源臂的序列如序列表中序列3所示。
[0014] 上述重組載體中，1)中，所述插入為將所述葉綠體rps7基因上游同源臂、所述DNA 片段和所述葉綠體ndhB基因下游同源臂共同插入葉綠體表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，得到 所述重組載體；
[0015] 2)中，所述插入為將所述DNA片段插入葉綠體表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)中，得到所 述重組載體。
[0016] 上述重組載體中，所述葉綠體表達(dá)載體為pPTC2載體。
[0017] 上述重組載體中，1)中所述的重組載體為將序列表中序列1所示的DNA片段替換 PPTC2載體的NheI和AgeI酶切位點(diǎn)間的DNA片段，且將序列表中序列2所示的葉綠體 rps7基因上游同源臂替換pPTC2載體的KpnI和BbvII位點(diǎn)間的片段，且將序列表中序列 3所示的葉綠體ndhB基因下游同源臂替換pPTC2載體的SphI和Bsu36I酶切位點(diǎn)間的 DNA片段后得到的載體。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0019] 本發(fā)明提供的重組菌是將上述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的菌。
[0020] 上述重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌。
[0021] 上述重組載體或上述重組菌在制備自發(fā)光產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0022] 本發(fā)明從發(fā)光菌株中克隆了發(fā)光基因，將其構(gòu)建到葉綠體表達(dá)載體中，得到重組 載體。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后可穩(wěn)定存在于大腸桿菌中，并可 大量復(fù)制質(zhì)粒，發(fā)出肉眼可見(jiàn)的藍(lán)綠光。本發(fā)明的重組載體上還有兩段來(lái)源于楊樹(shù)（山新 楊）葉綠體DNA的序列作為同源重組片段，將來(lái)可將發(fā)光基因定點(diǎn)插入楊樹(shù)葉綠體基因組 中的rps7基因和ndhB基因之間的間隔區(qū)，并使之在楊樹(shù)葉綠體基因組中高效表達(dá)，可以獲 得自發(fā)光的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)。本發(fā)明不僅在一定程度上克服了核基因轉(zhuǎn)化的不足，而且具有外 源基因可定點(diǎn)插入、外源基因表達(dá)效率高、變異小、便于遺傳操作、安全性好（母系遺傳，外 源基因不隨花粉擴(kuò)散）等優(yōu)越性，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為重組載體pPTC2_seq6612的構(gòu)建示意圖。
[0024] 圖2為重組載體pPTC2_seq6612的酶切鑒定圖。其中1為Marker;2為pstI單 酶切；3為未酶切。
[0025] 圖3為不同生長(zhǎng)時(shí)期的含有重組載體pPTC2-Seq6612的大腸桿菌。其中，左邊是 衰亡期；右邊是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0026] 圖4為含有重組載體pPTC2-seq6612的大腸桿菌和不含有重組載體 pPTC2-seq6612的大腸桿菌的對(duì)比圖。其中左邊為含有重組載體的大腸桿菌；右邊為含有 轉(zhuǎn)空載體的大腸桿菌。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0028] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0029] pPTC2載體在文獻(xiàn)"王玉華，張秀海，吳忠義，楊清，陳國(guó)強(qiáng)，吳瓊，黃叢林.通過(guò)葉 綠體基因工程在煙草中合成中長(zhǎng)鏈羥基脂肪酸聚酯.科學(xué)通報(bào)，2005,50(10) :979-986. " 中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0030] 實(shí)施例1、可穩(wěn)定自發(fā)光的重組載體及其應(yīng)用
[0031] 一、重組載體的構(gòu)建
[0032] 1、發(fā)光基因luxCDABEG的獲得
[0033]提取鰒發(fā)光桿菌（Photobacteriumleiognathi，IA00149)的基因組DNA，以鰒發(fā) 光桿菌（Photobacteriumleiognathi，IA00149)的基因組DNA為模板，采用PF和PR引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到如序列表中序列1所示的發(fā)光基因luxCDABEG。引物序列如下所示：
[0034]PF:5'-ATACCGAAACTACATACTCAG-3' ；
[0035]PR:5'-TACCCAGAATAAGTAGGTCGA-3'。
[0036] 發(fā)光基因luxCDABEG是依次由脂肪酸還原酶編碼基因（luxC)、轉(zhuǎn)移酶編碼基因 (luxD)、熒光素酶a亞基編碼基因（luxA)、熒光素酶0亞基編碼基因（luxB)、合成酶編碼 基因（luxE)和黃素還原酶編碼基因（luxG)串聯(lián)在一起組成的。所述脂肪酸還原酶如序列 表中序列表6所示；所述轉(zhuǎn)移酶如序列表中序列表7所示；所述熒光素酶a亞基的氨基酸 序列如序列表中序列表4所示；所述熒光素酶0亞基如序列表中序列表5所示；所述合成 酶如序列表中序列表8所示；