一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。將腺病毒載體pAdEasy與連接有目的基因的pAdtrack?CMV重組載體共轉(zhuǎn)化攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所述的攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞在制備過程中經(jīng)過L?阿拉伯糖誘導(dǎo)。本發(fā)明使得腺病毒載體pAdEasy與pAdtrack?CMV的重組發(fā)生在能表達(dá)Red重組酶的菌體中，在L?阿拉伯糖誘導(dǎo)的條件下使其穩(wěn)定地表達(dá)Red重組酶，重組酶能促進(jìn)同源基因序列完成重組，大大提高了AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)的重組效率。
【專利說明】
一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒是一種線型雙鏈DNA無包膜病毒，它的DNA和核心蛋白形成內(nèi)核，蛋白外殼 是直徑約80nm的正二十面體，由240個六面體和12個位于正二十面體頂部的五面體構(gòu)成。它 通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)行靶標(biāo)蛋白 的表達(dá)，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。重組腺病毒是在體外和活體用于蛋白藥物表達(dá)的 常見病毒載體，體外構(gòu)建和包裝腺病毒載體是產(chǎn)生重組腺病毒顆粒的重要步驟。其中，體外 構(gòu)建攜帶目標(biāo)蛋白基因的腺病毒骨架基因載體是包裝腺病毒顆粒的先決條件。
[0003] 傳統(tǒng)的AdEasy腺病毒載體重組系統(tǒng)通過E. coli BJ5183載有的recET基因（RecE通 路)實施保守性雙鏈DNA斷裂修復(fù)，從而具有高度基因同源重組活性，且穩(wěn)定傳代的特點。 recE編碼一種核酸外切酶;recT編碼一種結(jié)合于ssDNA促使鏈交換的蛋白。傳統(tǒng)的腺病毒載 體重組系統(tǒng)很不穩(wěn)定，產(chǎn)生陽性重組子的效率并不高，而且篩選的工作量比較大。Red重組 系統(tǒng)屬于λ噬菌體的重組系統(tǒng)，其編碼基因 eX〇、bet和gam置于PL操縱子的控制之下。exo基 因的產(chǎn)物是λ核酸外切酶，它可將dsDNA5 '端切開，產(chǎn)生3 '端突出。bet基因編碼的β蛋白，可 與ssDNA結(jié)合促進(jìn)互補鏈的復(fù)性，并可以介導(dǎo)DNA鏈退火和交換反應(yīng)。它在溶液中的游離狀 態(tài)為環(huán)狀物，當(dāng)結(jié)合到ssDNA時形成大的環(huán)狀物，當(dāng)結(jié)合到dsDNA時形成螺旋狀纖維。gam基 因的產(chǎn)物是一個分子量為16000Da的多肽，結(jié)合到宿主的RecBCD蛋白，形成二聚體，抑制 RecB⑶的外切酶活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng) 重組效率的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0006] -種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法，包括如下步驟:將腺病毒載體 pAdEasy與連接有目的基因的pAdtrack-CMV重組載體共轉(zhuǎn)化攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受 態(tài)細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所述的攜帶PKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞在制備過程中經(jīng) 過L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。
[0007] 優(yōu)選的，所述的提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法，具體包括如下步驟： [0008] (1)將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183中，獲得含有pKD46質(zhì)粒的BJ5183菌株，利用L-阿拉 伯糖誘導(dǎo)其產(chǎn)生Red重組酶并且將其制備成感受態(tài)細(xì)胞。
[0009] (2)將腺病毒載體pAdEasy與連接有目的基因的pAdtrack-CMV重組載體共轉(zhuǎn)化步 驟(1)制備的感受態(tài)細(xì)胞，熱擊、冰浴后加入液體培養(yǎng)基先培養(yǎng)使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)并 且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素基因，再涂布到含卡那霉素(Kan)的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)去除pKD46質(zhì) 粒。挑取固體培養(yǎng)基上生長的單菌落培養(yǎng)、提取質(zhì)粒得到重組腺病毒載體。
[0010]本發(fā)明利用PKD46質(zhì)粒，構(gòu)建出含有Red重組系統(tǒng)的BJ5183菌株，使得腺病毒載體 pAdEasy與pAdtrack-CMV的重組發(fā)生在能表達(dá)Red重組酶的菌體中，在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)的條 件下使其穩(wěn)定地表達(dá)Red重組酶，重組酶能促進(jìn)同源基因序列完成重組，大大提高了 AdEasy 腺病毒載體系統(tǒng)的重組效率（產(chǎn)生的重組腺病毒載體的酶切鑒定陽性效率可以達(dá)到 100% )，為今后重組腺病毒載體構(gòu)建提供了很大的方便。
【附圖說明】
[0011] 圖1是對照組1重組提取的重組腺病毒載體電泳圖。1-7是重組腺病毒載體 pAdeasy-GFP的質(zhì)粒，質(zhì)粒大小全部正確;Μ是DL10000。
[0012] 圖2是PacI酶切鑒定對照1重組提取的重組腺病毒的電泳圖。1-7是PacI酶切重組 腺病毒載體pAdeasy-GFP質(zhì)粒的產(chǎn)物，陽性載體經(jīng)酶切后只有3和7為陽性，酶切鑒定陽性率 28.6% ;M是DL10000。
[0013] 圖3是實驗組1重組提取的重組腺病毒載體電泳圖。1-7是重組腺病毒載體 pAdeasy-GFP的質(zhì)粒，大小全部正確;Μ是DL15000。
[0014] 圖4是PacI酶切鑒定實驗組1重組提取的重組腺病毒載體的電泳圖。1-7是PacI酶 切重組腺病毒載體pAdeasy-GFP質(zhì)粒的產(chǎn)物；陽性載體經(jīng)酶切后全部為陽性重組子，酶切鑒 定陽性率100% ;M是DL15000。
[0015] 圖5是實驗組2重組提取的重組腺病毒載體電泳圖。1-7是重組腺病毒載體 pAdeasy-GFP/DrsB2 的質(zhì)粒，1、2、3、4、7質(zhì)粒大小正確;Μ是 DL15000 〇
[0016] 圖6是PacI酶切鑒定實驗組2重組提取的重組腺病毒載體的電泳圖。1-7是PacI酶 切重組腺病毒載體pAdeaSy-GFP/Dr SB2質(zhì)粒的產(chǎn)物，陽性載體經(jīng)酶切后全部為陽性重組子， 酶切鑒定陽性率100% ;M是DL15000。
[0017] 圖7是對照組2重組提取的重組腺病毒載體電泳圖。1-8是重組腺病毒載體 pAdeasy-GFP的質(zhì)粒，1、2、6質(zhì)粒大小正確;Μ是DL15000。
[0018] 圖8是PacI酶切鑒定對照組2重組提取重組腺病毒載體的電泳圖。1-8是PacI酶切 重組腺病毒載體P A d e a s y - GF P質(zhì)粒的產(chǎn)物，載體經(jīng)酶切后2和3是陽性，酶切鑒定陽性率 25% ;M是DL15000。
【具體實施方式】
[0019] 應(yīng)用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，以往的方法是將pAdEasy-ι質(zhì)粒和線性化pAdtrack-CMV和共轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)中，或者將線性化pAdtrack-CMV轉(zhuǎn)化到含有pAdEasy-Ι質(zhì)粒的 BJ5183感受態(tài)中。本發(fā)明是將線性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-Ι質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Red重組酶 的BJ5183感受態(tài)中。
[0020] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0021] 實施例1
[0022] 一、攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)菌的制備
[0023] (1)從平板挑取用普通轉(zhuǎn)化方法獲得的攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183菌株單菌落接種 到4mL含有Amp (終濃度25-50yg/mL)的S0B培養(yǎng)基中，30 °C、220rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。
[0024] (2)實驗組感受態(tài)細(xì)胞：取lmL(接種量1%~2%)培養(yǎng)物接種到裝lOOmL含有Amp (終濃度25-50yg/mL)S0B培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30°C、220rpm，先振蕩培養(yǎng)lh，然后加入 L-阿拉伯糖(終濃度0.2% )誘導(dǎo)培養(yǎng)至0D6Q() = 0.4~0.5。對照組感受態(tài)細(xì)胞:除不加入L-阿 拉伯糖誘導(dǎo)外，其余操作同上。
[0025] (3)在已滅菌的超凈臺中將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移到2個已滅菌的50mL離心管中，冰浴 30min〇
[0026] (4)4°C、4100rpm離心10min。在超凈臺中棄去上清液，倒置在濾紙上使液體盡可能 流盡。
[0027] (5)先分別用0.5mL冷的O.lmol/L的CaCl2溶液懸浮菌體(菌體朝上用手輕輕拍打 混勻至菌液呈云霧狀），再加 CaCl2溶液至30mL混勻，冰浴90min。
[0028] (6)4°C、4100rpm離心10min。在超凈臺中棄去上清液，倒置在濾紙上使液體盡可能 流盡。
[0029] (7)先分別用0.5mL冷的0.1m〇l/L的CaCl2溶液懸浮菌體(菌體朝上用手輕輕拍打 混勻至菌液呈云霧狀），再加 CaCl2溶液至30mL混勻，冰浴60min。
[0030] (8)4°C、4100rpm離心10min。在超凈臺中棄去上清液，倒置在濾紙上使液體盡可能 流盡。
[0031] (9)先分別用0.511^冷的甘油0&(：12溶液(0.1111 〇1/1^&(：12與甘油體積比85:15)懸浮 菌體(菌體朝上用手輕輕拍打混勻至菌液呈云霧狀），再加甘油CaCl2溶液至2mL混勻，分裝 至已滅菌的1.5mL EP管中（每管20(^〇。-70°(：條件下可以長期保存使用。
[0032]通過上述方法制備得到經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)(實驗 組)和未經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)(對照組）。
[0033] 二、pAdtrack-CMV 質(zhì)粒的線性化
[0034] (1)可選方法A(本操作中使用方法A):Pme I單酶切
[0035] 向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/ DrsB2 3_5yg，10XB Buffer 5yL，PmeI(5U/yL)lyL，ddH2〇加至50yL。
[0036] 可選方法B:EcoR I單酶切
[0037] 向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：pAdtrack-CMV或pAdTrack-CMV/ DrsB2 3_5yg，10XH Buffer 5yL，EcoRI(15U/yL)0.5yL，ddH2〇加至50yL。
[0038] 上述pAdTrack_CMV/DrsB2質(zhì)粒的構(gòu)建如下：
[0039] DrsB2基因是根據(jù)其氨基酸序列設(shè)計兩對引物使用重疊 PCR拼接獲得，引物序列如 下：
[0040] Dr sB2 ( sense ) : GGGGTACCATGGGCCTGTGGAGCAAGATCAAGGAGGTGG GCAAGGAGGCCGCCAAGGCCGCCGCCAAG；
[0041 ] DrsB2(anti sense)：GCTCTAGATCACACGGCCTCGCTCACGGCGCCCAGGG CGGCCTTGCCGGCGGCCTTGGCGGCGGCCTTG〇
[0042] (a)應(yīng)用常規(guī)重疊 PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因。
[0043] 重疊疊 PCR反應(yīng)體系如下：10 Xbuffer 2yL，DrsB2(sense)2yL，DrsB2(antisense) 241^，139酶0.241^，(1(1!12〇11.84匕
[0044] 重疊 PCR程序設(shè)定如下：941€5111丨11;941€3〇8,64 1€3〇8,721€3〇8,35個循環(huán)；721€ 5min，16°C15min〇
[0045] (b)用普通DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，分別對PCR產(chǎn)物和pAdTrack-CMV做雙酶切 處理。
[0046] 雙酶切體系如下：lOXTagon buffer 5yL，KpnI 2yL，XbaI lyL，PCR產(chǎn)物或 pAdTrack-CMV 20yL,ddH20 22yL〇
[0047] (c)普通瓊脂糖凝膠電泳后，切取目標(biāo)條帶使用普通DNA回收試劑盒回收酶切產(chǎn) 物，構(gòu)建連接體系。16°C恒溫水浴槽連接過夜。10yL連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化到感受態(tài)DH5a中并第 二天挑取單克隆過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒鑒定獲得pAdTrack-CMV/DrsB2。
[0048] 連接體系如下：10XT4連接buffer lyL，T4連接酶lyL，酶切回收的PAdTrack7yL， 酶切回收的PCR產(chǎn)物lyL。
[0049] (2)37°(：溫浴酶切411。
[0050] (3)酶切產(chǎn)物全部上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳回收，110V 100mA。
[0051 ] (4)用普通膠回收試劑盒回收，加30yL Elution Solution，線性化pAdtrack-CMV 濃度可以在50ng/yL以上。提取步驟詳見試劑盒說明書。
[0052] 三、線性化pAdtrack-CMV和pAdEasy-Ι質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化
[0053] (1)實驗組 1 為取 100ng pAdEasy-Ι和400_500ng線性化質(zhì)粒pAdtrack-CMV在已滅 菌的微量EP管中混勻（混合質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)體積的10 %)共轉(zhuǎn)化于100yL上述制備的 攜帶PKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)(實驗組感受態(tài)）中，冰浴30min。
[0054] 實驗組2為取100ng pAdEasy-Ι和400_500ng線性化攜帶革巴標(biāo)基因 BrsB2的載體質(zhì) 粒pAdtrack-CMV/BrsB2在已滅菌的微量EP管中混勾（混合質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)體積的 10%)共轉(zhuǎn)化于l〇〇yL上述制備的攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)(實驗組感受態(tài)）中，冰浴 30min〇
[0055] 對照組1為取100ng pAdEasy-Ι和400_500ng線性化質(zhì)粒pAdtrack-CMV在已滅菌的 微量EP管中混勻(混合質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)體積的10%)共轉(zhuǎn)化于100yL用普通氯化鈣法 制備的不攜帶PKD46的BJ5183感受態(tài)中，冰浴30min。
[0056] 對照組2為取100ng pAdEasy-Ι和400_500ng線性化質(zhì)粒pAdtrack-CMV在已滅菌的 微量EP管中混勻(混合質(zhì)粒體積不超過感受態(tài)體積的10% )共轉(zhuǎn)化于100此上述制備的不使 用阿拉伯糖誘導(dǎo)的對照組BJ5183感受態(tài)(對照組感受態(tài)）中，冰浴30min。
[0057] (2)42°C保溫90s進(jìn)行熱擊。熱擊后迅速放入冰中，冰浴10min。
[0058] (3)加入900yL SOB培養(yǎng)基混勻后，30°C振蕩（搖床轉(zhuǎn)速不超過150rpm)培養(yǎng)60min， 使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素基因。
[0059] (4)室溫下5000rpm離心3min。用移液槍小心吸去800yL上清液。
[0060] (5)再將剩余菌液混勻后在含Kan(終濃度25yg/mL)的LB固體培養(yǎng)基的平板上全部 涂布，靜置1~2min。在37°C的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜（一般要培養(yǎng)16h)，可以去除pKD46質(zhì) 粒。
[0061 ] (6)培養(yǎng)完成，從平板上挑單菌落提質(zhì)粒鑒定。
[0062]四、重組腺病毒載體的提取
[0063] (1)隨機挑取平板上若干個單菌落接種到5mL含Kan(終濃度25yg/mL)的LB液體培 養(yǎng)基中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0064] (2)將搖混濁的菌液在已滅菌的超凈臺中首先進(jìn)行保菌，取600yL菌液于已滅菌的 1.5mL EP管中加入400yL已滅菌的50%甘油，-70°C冰箱凍存，剩余菌液用于提質(zhì)粒鑒定。 [0065] (3)將剩余菌液分別富集到1.5mLEP管中，8000rpm離心lmin，棄上清。
[0066] (4)向菌體沉淀中加入150yL溶液I，用移液槍吹打混勻或在旋渦混合器上劇烈振 蕩，使菌體充分懸浮。
[0067] (5)加入200yL新配制的溶液II(呈澄清狀，使細(xì)胞裂解），溫和上下顛倒4~6次EP 管以便使菌體充分裂解，直至形成透亮溶液。
[0068] (6)加入200yL溶液III，上下顛倒6~8次混勻，切記不可振蕩，有白色絮狀物產(chǎn)生， 靜置311^11。4°(：、1200(^離心10min。將上清液小心吸至新的已滅菌的EP管中。
[0069] (7)加入200yL (上清液的體積)苯酚/氯仿/異戊醇，充分混勻，室溫下12000g離心 10min〇
[0070] (8)吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新的已滅菌的EP管中，并加入2倍體積的預(yù)冷的無水乙醇 上下顛倒混勾。4°C、12000g離心10min，棄上清。
[0071] (9)加入lmL 70%預(yù)冷的乙醇上下顛倒混勻，洗滌沉淀和去鹽。4°C、12000g離心 lOmin，棄上清。倒置于潔凈的濾紙上，讓液體流盡，沉淀物自然干燥，然后加入30yL ddH20 和適量RNA酶溶解沉淀，37°C溫育20-30min。
[0072] (10)提取的質(zhì)粒通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖1、3、5、7。圖1為對照組 1: pAdTrack-CMV與pAdEasy-Ι重組獲得pAdEasy-GFP，從質(zhì)粒大小判斷，全部正確，可以進(jìn)行 酶切鑒定；圖3為實驗組1 :pAdTrack-CMV與pAdEasy-Ι重組獲得pAdEasy-GFP，從質(zhì)粒大小判 斷，全部正確，可以進(jìn)行酶切鑒定；圖5為實驗組2:pAdTrack-CMV/DrsB2與pAdEasy-Ι重組獲 得pAdEasy-GFP/DrsB2,從質(zhì)粒大小判斷，1、2、3、4、7為正確質(zhì)粒，可以進(jìn)行酶切鑒定；圖7為 對照組2: pAdTrack-CMV與pAdEasy-Ι重組獲得pAdEasy-GFP，從質(zhì)粒大小判斷，全部正確，可 以進(jìn)行酶切鑒定。
[0073] (11)選出疑似正確的質(zhì)粒，質(zhì)量分子量應(yīng)該大于36kbp，用于酶切鑒定。
[0074]五、重組腺病毒載體的酶切鑒定
[0075] (1)向已滅菌的微量離心管中，依次加如下組分：重組腺病毒載體3μg，10 X Η Buffer 2yL，Pac I (1 OU/yL) Ο · 2yL，ddH20加至20yL。
[0076] (2)37。(：酶切311。
[0077] (3)酶切產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果見圖2、4、6、8。經(jīng)Pac頂每切后，陽 性重組腺病毒載體會產(chǎn)生一個大片段大約30kb和一個小片段大約3kb或4.5kb。圖2為對照 組1: p A d E a s y - G F P重組載體酶切，從酶切小片段判斷，3和7是正確的，酶切鑒定陽性率 28.6% ;圖4為實驗組1:pAdEasy-GFP重組載體酶切，從酶切小片段判斷，酶切鑒定陽性率 100 % ;圖6為實驗組2: pAdEasy-GFP/BrsB2重組載體酶切，對1、2、3、4、7從酶切小片段判斷， 酶切鑒定陽性率100% ;圖8為對照組2:pAdEasy-GFP重組載體酶切，從酶切小片段判斷，2和 3是正確的，酶切鑒定陽性率25%。
[0078] (4)將含陽性重組腺病毒載體的菌株保菌，_70°C凍存。
[0079]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法，其特征在于：將腺病毒載體 pAdEasy與連接有目的基因的pAdtrack-CMV重組載體共轉(zhuǎn)化攜帶pKD46質(zhì)粒的BJ5183感受 態(tài)細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基中培養(yǎng);所述的攜帶PKD46質(zhì)粒的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞在制備過程中經(jīng) 過L-阿拉伯糖誘導(dǎo)。2. -種提高AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)重組效率的方法，其特征在于:包括如下步驟： (1) 將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BJ5183中，獲得含有pKD46質(zhì)粒的BJ5183菌株，利用L-阿拉伯糖 誘導(dǎo)其產(chǎn)生Red重組酶并且將其制備成感受態(tài)細(xì)胞； (2) 將腺病毒載體pAdEasy與連接有目的基因的pAdtrack-CMV重組載體共轉(zhuǎn)化步驟（1) 制備的感受態(tài)細(xì)胞，熱擊、冰浴后加入液體培養(yǎng)基先培養(yǎng)，再涂布到含Kan的固體培養(yǎng)基培 養(yǎng)去除PKD46質(zhì)粒。
【文檔編號】C12N15/861GK105950659SQ201610462362
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】張軍林, 田馳, 郭書奎, 郭曉紅, 李毅
【申請人】武漢生物工程學(xué)院