新型家禽腺病毒及其疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及新型家禽腺病毒及其疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 被稱為包涵體肝炎（Inclusion body hepatitis)或家禽腺病毒感染癥（Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)的疾病是因1群家禽腺病毒(FAdV)發(fā)病的傳染病。FAdV屬于腺病毒科 (Family Adenoviridae)，基因組（gemone)由沒有分節(jié)的線形雙鏈（double-stranded)DNA 構(gòu)成。屬于1群的家禽腺病毒共存在12個(gè)血清型，運(yùn)些血清型之間表現(xiàn)出非常不同的病原 性。已知危害韓國國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)的主要血清型是4型、8型、11型，在包涵體肝炎的情況下，大部 分血清型中均被發(fā)現(xiàn)，在4型的情況下，已知伴有屯、包積水癥，并且通常病原性最強(qiáng)。腺病毒 感染癥是通過感染作為主要祀標(biāo)的肝細(xì)胞并形成特征性的包涵體（Inclusion body)而引 起死亡的疾病。包涵體肝炎能夠垂直傳播或水平傳播，在垂直傳播的情況下，通常3~4周齡 時(shí)發(fā)病，也報(bào)道過當(dāng)進(jìn)行了垂直傳播時(shí)7日齡之前發(fā)病的案例。單獨(dú)感染時(shí)，死亡率為10% 左右，較低，但與甘保羅病或雞傳染性貧血等免疫抑制性疾病形成復(fù)合感染時(shí)，死亡率會進(jìn) 一步變高。已知在感染伴有屯、包積水的血清型4型的情況下，發(fā)病率和死亡率相對變高，在 敏感性高的肉雞中死亡率能夠達(dá)到80%，因此所處狀況是，對韓國國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng) 濟(jì)損失。
[0003] 該疾病于1949年首次從鳥類分離，目前已廣泛分布，全世界均有發(fā)病報(bào)告。之后， 于1987年伴有屯、包積水癥的血清型4型腺病毒感染癥在己基斯坦被報(bào)告，后來隨著全世界 性的發(fā)病報(bào)告，對養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的損害。在屯、包積水癥的情況下，與W往包涵體肝炎不 同，其特征在于，在沒有免疫抑制性疾病的狀態(tài)下，單獨(dú)感染也能夠?qū)е赂甙l(fā)病率和死亡 率。此外，是在幼齡敏感性高的疾病，并且能夠進(jìn)行蛋傳(egg化ansmission)，因此其是如 下疾病:種雞群受到感染后一直無癥狀，但蛋傳給后代維雞而引發(fā)嚴(yán)重病癥，從而能夠?qū)θ?雞產(chǎn)業(yè)造成損害。
[0004] 根據(jù)農(nóng)林畜產(chǎn)檢疫本部的報(bào)告，對于2007年至2010年申報(bào)發(fā)生包涵體肝炎的情況 可W確認(rèn)，血清型4型占46%，比率最高，之后是11型（31 % )，8b型（23%)，因此4型、m3型W 及11型所占比率高。此外，可W確認(rèn)總發(fā)病報(bào)告中，72%為來自肉雞的發(fā)病報(bào)告，蛋雞和± 雞占據(jù)剩余比率，包涵體肝炎所造成的災(zāi)害在肉雞中最為嚴(yán)重(圖1)。
[000引此外，根據(jù)農(nóng)林畜產(chǎn)檢疫本部，對于2周齡之前的雞中因疾病的垂直傳播而導(dǎo)致感 染的情況而言，在報(bào)告的共39件中占10件，因此所處狀況是，由來源于種雞群的包涵體肝炎 病毒的傳播導(dǎo)致的災(zāi)害也持續(xù)出現(xiàn)發(fā)病報(bào)告。
[0006] 目前韓國國內(nèi)的狀況是，由于未實(shí)施包涵體肝炎疫苗，因此相應(yīng)疾病已胚胎繼代， 引起了后代維雞中的死亡率增加，生產(chǎn)性降低等問題，養(yǎng)雞產(chǎn)業(yè)正遭受著打擊。因此，切實(shí) 的狀況是，引入一種包涵體肝炎疫苗，其在種雞群中，能夠在抑制疾病感染的同時(shí)保持高抗 體滴度，并且有助于傳遞母源抗體。
[0007] 現(xiàn)有專利文獻(xiàn)
[000引韓國專利公開號第1020110132316
[0009] 韓國專利公開號第1020110092316

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 技術(shù)課題
[0011] 本發(fā)明是依據(jù)上述必要性而提出的，本發(fā)明的目的在于，提供一種韓國國內(nèi)分離 的新型家禽腺病毒。
[0012] 解決技術(shù)的方法
[001引為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供W保藏號KCTC 12425BP保藏的FAdVK4家禽腺病 0
[0014] 本發(fā)明的菌株已于2013年6月12日保藏在韓國典型菌種保藏中屯、（韓國大田儒城 區(qū)科學(xué)路125,韓國生物科學(xué)和生物技術(shù)研究院，305-806)。
[0015] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述病毒優(yōu)選為從韓國國內(nèi)的雞分離的病毒，并且 優(yōu)選包含序列號1的堿基序列，但不限于此。
[0016] 此外，本發(fā)明提供包含上述本發(fā)明的家禽腺病毒和可藥用的載體或稀釋劑的針對 由家禽腺病毒感染引發(fā)的疾病的家禽保護(hù)用疫苗。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述疫苗優(yōu)選對預(yù)防或治療包涵體肝炎有效，優(yōu)選 為滅活的形態(tài)，優(yōu)選進(jìn)一步包含助劑，優(yōu)選進(jìn)一步包含一種W上對家禽具有感染性的其他 病原菌的疫苗成分，但不限于此。
[0018] 此外，本發(fā)明提供家禽腺病毒的制造方法，該制造方法包括：向易受感染的基質(zhì)接 種上述本發(fā)明所定義的家禽腺病毒的步驟;b)使上述家禽腺病毒增殖的步驟;及C)收集含 有上述家禽腺病毒的物質(zhì)的步驟。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，上述基質(zhì)優(yōu)選為選自由雞肝胚細(xì)胞(CEL)、雞胚成纖 維細(xì)胞(CEF)、雞腎細(xì)胞(CK)和非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)細(xì)胞株組成的組中的一種細(xì)胞，但不 限于此。
[0020] 此外，本發(fā)明提供針對由家禽腺病毒感染引發(fā)的疾病的家禽保護(hù)用疫苗的制造方 法，其特征在于，包括將通過上述本發(fā)明的方法得到的收集后的家禽腺病毒與可藥用的載 體或稀釋劑結(jié)合的步驟，必要時(shí)在將上述家禽腺病毒滅活后實(shí)施上述步驟。
[0021] 此外，本發(fā)明提供在家禽中控制由家禽腺病毒感染引發(fā)的疾病的方法，該方法包 括將上述本發(fā)明的疫苗施用于鳥。
[0022] 本發(fā)明的疫苗例如能夠根據(jù)用于市售的活的滅活的家禽腺病毒疫苗所經(jīng)常使用 的常規(guī)方法來準(zhǔn)備。獸醫(yī)學(xué)疫苗組合物的制造尤其在巧andbunch der Schutzimp化ngen in der Tiermedizin"(編寫：Mays , A.等人，Verlag Paul Parey,Berlin und Hamburg, Germany, 1984)和"Vaccines or Veterinary Applications"(編寫：Peters ,A.R.等人， Butterworth-Heinemann Ltd, 1993)中已被說明。
[0023] 將增殖步驟后收集的病毒滅活的目的在于，防止病毒的再生。一般而言，滅活能夠 通過化學(xué)或物理方法來實(shí)施?；瘜W(xué)滅活例如能夠通過用酶、甲醒、β-丙內(nèi)醋、乙締亞胺或其 衍生物處理病毒來實(shí)施。必要時(shí)，滅活的化合物在后期被中和。被甲醒滅活的物質(zhì)例如可W 由硫代硫酸鹽中和。物理滅活能夠優(yōu)選通過向病毒照射能量充分的射線、例如UV光而實(shí)施。 必要時(shí)，照射后抑能夠被調(diào)整為約7的值。
[0024] 含有滅活的家禽腺病毒的疫苗例如可W包含一種W上符合該目的的前述可藥用 的載體或稀釋劑。優(yōu)選的是，本發(fā)明的滅活的疫苗包含一種W上具有輔助活性的化合物。符 合該目的化合物或組合物包含將氨氧化侶、憐酸侶、氧化侶、礦物油、維生素 E乙酸醋等植物 油和皂巧作為主成分的水包油型或油包水型乳劑。
[0025] 滅活的疫苗主要非經(jīng)口施用，即通過肌肉內(nèi)或皮下內(nèi)施用。
[0026] 本發(fā)明的疫苗包含有效量的家禽腺病毒作為活性成分，所述有效量是指通過抵抗 毒性病毒所引起的攻擊(施用抗原），在接種疫苗的鳥類或其后代中使能夠誘導(dǎo)免疫的家禽 腺病毒物質(zhì)免疫化的量。本申請中，免疫被定義為，與未進(jìn)行疫苗接種的組相比，疫苗接種 后在鳥類群體中誘導(dǎo)相當(dāng)高水平的免疫。
[0027] 通常，滅活疫苗包含與每只鳥類104-1〇WtCID50等效的抗原。
[0028] 本發(fā)明的家禽腺病毒疫苗能夠有效地用于雞，但火雞、珍珠雞(guinea fowl)和鶴 譜等其他家禽也能夠有效地W疫苗來接種。雞包含食用雞、克隆家畜和下蛋的家畜。
[0029] 有益效果
[0030] 本發(fā)明通過提供新型家禽腺病毒、包含其的疫苗及它們的制造方法，能夠有效保 護(hù)家禽不受家禽腺病毒感染。
【附圖說明】
[0031] 圖1是2007年至2010年之間韓國國內(nèi)成功分離的包涵體肝炎病毒的血清型和發(fā)病 比率。< 出處:農(nóng)林畜產(chǎn)檢疫本部〉
[0032] 圖2是其他病原體感染與否的試驗(yàn)。
[0033] 圖3是HEX0N基因部位的系統(tǒng)學(xué)分析。
【具體實(shí)施方式】
[0034] W下，通過非限制性的實(shí)施例來更詳細(xì)說明本發(fā)明。但，下述實(shí)施例是為了例示本 發(fā)明而記載的，本發(fā)明的范圍不應(yīng)理解為受到下述實(shí)施例的限制。
[00巧]①韓國國內(nèi)露天養(yǎng)殖場中的化wl Adenovirus FAdV K4株分離、鑒定，其他病原體 否定試驗(yàn)
[0036] 從2010年位于京畿道的肉雞養(yǎng)殖場委托的肉雞摘取肝并放入滅菌憐酸緩沖溶液 (pH7.2)，從而制作10重量％的乳液。將其在3,000g下離屯、分離15分鐘使細(xì)胞和組織沉淀， 將上清液用〇.45μπι的注射器過濾器過濾。通過解化11日齡的SPF雞胚的絨毛尿囊膜 (chorioallantoic membrane : CAM)接種法分離，并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)最終鑒定 FAdV K4細(xì)胞株。
[0037] ②新型FAdV露天分離株內(nèi)其他病原體否定試驗(yàn)
[0038] 為了確認(rèn)能夠在雞胚胚胎的尿囊液和絨毛尿囊膜中增殖的其他病原體的存在與 否，對傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV)、新城疫病毒(Newcastle disease,NDV)、傳染性F囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV)、雞傳染性貧 血病毒（Qiicken infectious anemia virus,CIAV)、支原體(Mycoplasma)實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR),從而確認(rèn)除了甘保羅病病毒分離株（IBD K7)W外沒有其他病原體。
[0039] ③基因組堿基序列分析