一種疫苗佐劑及利用其制成的佐劑疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明屬于醫(yī)藥與醫(yī)學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種疫苗佐劑及利用其制成的佐劑疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)已成為全球一大產(chǎn)業(yè)，且規(guī)模呈不斷擴(kuò)展態(tài)勢(shì)。疫苗的應(yīng)用對(duì)于養(yǎng)殖業(yè)控制動(dòng)物疾病的流行起到了非常重要的作用，除傳統(tǒng)的減毒疫苗外，新型疫苗不斷得到開發(fā)利用，如多肽疫苗、DNA疫苗和滅活蛋白疫苗等。這些疫苗雖然比傳統(tǒng)疫苗安全，但其和傳統(tǒng)疫苗一樣都存在免疫原性較弱，致使誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答不夠強(qiáng)，因此，有必要配合安全高效的佐劑來增強(qiáng)其免疫原性或增強(qiáng)宿主對(duì)抗原的保護(hù)性應(yīng)答。
[0003]目前常用的免疫佐劑大致有幾十種，如常用的有鋁鹽及礦物質(zhì)佐劑(氫氧化鋁、氯化鈣硫酸鋅)、油佐劑(弗式佐劑、白油)、左旋咪哇、蜂膠、轉(zhuǎn)移因子和干擾素等。然而，油乳類和鋁鹽礦物類化學(xué)佐劑副作用較大，皮下注射時(shí)常有持續(xù)性肉芽腫、不能很好地吸收、也不能有效刺激保護(hù)性T細(xì)胞免疫。這些反應(yīng)較多與佐劑引起對(duì)特定抗原的免疫應(yīng)答、產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生有關(guān)。此外，這一類佐劑在機(jī)體內(nèi)降解吸收慢、殘留時(shí)間長、影響畜禽的外觀及食用安全。因此，開發(fā)研制新型免疫佐劑以增強(qiáng)疫苗免疫效力并減少疫苗的毒副作用是未來的發(fā)展趨勢(shì)，理想的佐劑應(yīng)該有以下特征:①作用于弱免疫性抗原，促進(jìn)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答，不引起有害的副作用；②能以不同途徑免疫，也能用于不同抗原在免疫抑制個(gè)體中發(fā)揮作用；④應(yīng)用于食用動(dòng)物不應(yīng)有毒素殘留；⑤能有效影響免疫反應(yīng)質(zhì)量；⑥穩(wěn)定且易生產(chǎn)。
[0004]中藥是我國的國粹，具有天然、無毒、無副作用的突出特點(diǎn)，一些補(bǔ)中益氣中藥可提高免疫系統(tǒng)組織細(xì)胞的活性、提高機(jī)體免疫力，可研究成為新的疫苗佐劑。如鮑國連等人將中藥方劑應(yīng)用到對(duì)鴨疫里氏桿菌疫苗的免疫佐劑實(shí)驗(yàn)中，證明其可提高受免疫鴨的抗體水平，且對(duì)鴨生長沒有任何負(fù)面影響。另外還有專利ZL201210116643.3、ZL200710027063.6和ZL200810059353.3等分別對(duì)中藥巴戟天、人參等8種中藥、木鱉子的提取物作為主要有效成分用于免疫佐劑，均取得了理想的效果。
[0005]中藥太子參為石竹科孩兒屬植物孩兒參的干燥根，別名孩兒參、童參、雙批七、四葉參或米參，為珍貴中藥，富含多種人體必需氨基酸、活性多糖和皂苷類化合物等，具有益氣生津、補(bǔ)肺健脾的功效，特點(diǎn)為益氣但不提升，生津但不助濕，扶正但不戀邪，補(bǔ)虛又不峻猛。主治心悸自汗，疲倦乏力，脾虛食少，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳等癥。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種疫苗佐劑及利用其制成的佐劑疫苗。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種疫苗佐劑，其有效成分為太子參為主料的中藥提取物，所述太子參為主料的中藥提取物按下述步驟制備而得:
(i)、干燥和粉碎:將太子參、淫羊藿、黃芪和靈芝分別進(jìn)行干燥后，以質(zhì)量比計(jì)，按太子參:淫羊藿:黃芪:靈芝=5-7: 0.5-1.5: 1.5-2.5: 0.5-1.5的固定比例混合并粉碎；
(ii)、超聲預(yù)處理:將步驟(i)獲得的中藥粉按固液比g/ml=l:10-1:30加入乙醇進(jìn)行超聲；
(iii)、低溫超臨界C02萃取:將步驟(ii)超聲后獲得的中藥乙醇分散液進(jìn)行烘干后，再在夾帶劑存在的條件下進(jìn)行低溫超臨界C02萃取，萃取操作參數(shù)為:夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為1_3%，萃取溫度35-50°C，萃取壓力10-25MPa，C(V流量2_4L/h，萃取時(shí)間
0.5-2h;所述夾帶劑為乙醇、乙二醇、丙酮和乙酸乙酯中的一種或多種；待萃取結(jié)束后，減壓回收夾帶劑，即得太子參為主料的中藥提取物。
[0008]較好地，步驟(i)中:干燥至水分的質(zhì)量百分含量不高于10% ;粉碎目數(shù)為65-80目。步驟(ii)中:乙醇為體積純度為85%以上的乙醇；超聲時(shí)的參數(shù)為:超聲功率50-200W，超聲頻率20-40 kHz，超聲時(shí)間30-50min。步驟(iii)中:烘干時(shí)的溫度為60_80°C，夾帶劑的體積純度為80-100% ;若夾帶劑為多種時(shí)，等體積比混合使用。
[0009]利用所述疫苗佐劑制備而成的佐劑疫苗:將疫苗佐劑先與無菌去離子水按體積比例1:5-10混勻，獲得疫苗佐劑稀釋液；再將疫苗佐劑稀釋液直接和疫苗混合，即制得佐劑疫苗；其中所述疫苗佐劑在制備得到的佐劑疫苗中所占的體積比為2.5-8%。
[0010]較好地，所述疫苗為減毒疫苗、滅活疫苗、多肽疫苗或DNA疫苗，更優(yōu)選為鴨疫里氏桿菌減毒疫苗，0型口蹄疫滅活疫苗，0型口蹄疫多肽疫苗或0型口蹄疫DNA疫苗。
[0011]本發(fā)明采取太子參為主料的中藥提取物做疫苗佐劑的有效成分，用于免疫小鼠和鴨，小鼠和鴨不僅能健康成長，且其體內(nèi)抗血清中較長時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)到高滴度抗體；適用于不同免疫疫苗抗原，具有綠色無殘留、長效、穩(wěn)定等實(shí)際應(yīng)用功效。
【附圖說明】
[0012]圖1為0型口蹄疫滅活疫苗免疫小鼠后血清抗體效價(jià)隨時(shí)間變化柱形圖；
圖2為0型口蹄疫多肽疫苗免疫小鼠后血清抗體效價(jià)隨時(shí)間變化柱形圖；
圖3為0型口蹄疫DNA疫苗免疫小鼠后血清抗體效價(jià)隨時(shí)間變化柱形圖；
圖4為鴨疫里氏桿菌減毒疫苗免疫鴨后血清抗體效價(jià)隨時(shí)間變化柱形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下以具體實(shí)施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0014]以下實(shí)施例中的太子參購自于福建省寧德市柘榮縣。
[0015]實(shí)施例1
先將太子參、淫羊藿、黃芪和靈芝分別進(jìn)行干燥，水分質(zhì)量百分含量不高于10%;干燥后，以質(zhì)量比計(jì)，按太子參:淫羊藿:黃芪:靈芝=5: 1.5: 2: 1.5的固定比例混合并粉碎，粉碎目數(shù)為70目；再按固液比g/ml=l:15加入體積純度85%的乙醇進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲功率90 W，超聲頻率25 kHz，超聲時(shí)間45 min ;然后將預(yù)處理后的太子參進(jìn)行60°C烘干，再在夾帶劑存在的條件下進(jìn)行低溫超臨界0)2萃取過程，萃取溫度45°C，萃取壓力25 MPa,C(V流量2.5 L/h，萃取時(shí)間1.5 h，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為1.5%，夾帶劑為乙二醇；待萃取結(jié)束后，減壓回收乙二醇，即得太子參為主料的中藥提取物。
[0016]將太子參為主料的中藥提取物先與無菌去離子水按體積比例1:10混勻，且過濾膜除菌；最終將除菌后的太子參為主料的中藥提取物稀釋液分別與0型口蹄疫滅活疫苗、0型口蹄疫多肽疫苗、0型口蹄疫DNA疫苗及鴨疫里氏桿菌減毒疫苗進(jìn)行體積比1:25混合制成相應(yīng)的太子參為主料的中藥提取物佐劑疫苗。
[0017]實(shí)施例2
先將太子參、淫羊藿、黃芪和靈芝分別進(jìn)行干燥，水分質(zhì)量百分含量不高于10%;干燥后，以質(zhì)量比計(jì)，按太子參:淫羊藿:黃芪:靈芝=6:1:2:1的固定比例混合并粉碎，粉碎目數(shù)為80目；再按固液比g/ml=l:20加入體積純度85%的乙醇進(jìn)行超聲預(yù)處理，超聲功率100 W，超聲頻率30 kHz，超聲時(shí)間40min ;然后將預(yù)處理后的太子參進(jìn)行60°C烘干，再在夾帶劑存在的條件下進(jìn)行低溫超臨界0)2萃取過程，萃取溫度40°C，萃取壓力20MPa，CO 2流量3 L/h，萃取時(shí)間1 h，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為2%，夾帶劑為無水乙醇；待萃取結(jié)束后，減壓回收無水乙醇，即得太子參為主料的中藥提取物。
[0018]將太子參為主料的中藥提取物先與無菌去離子水按體積比例1:5混勻，且過濾膜除菌；最終將除菌后的太子參為主料的中藥提取物稀釋液分別與0型口蹄疫滅活疫苗、0型口蹄疫多肽疫苗、0型口蹄疫DNA疫苗及鴨疫里氏桿菌減毒苗進(jìn)行體積比1:20混合制成相應(yīng)的太子參為主料的中藥提取物佐劑疫苗。
[0019]作為對(duì)照，將不完全弗氏佐劑先與無菌去離子水按體積比例1:5混勻，且過濾膜除菌；最終將除菌后的不完全弗氏佐劑稀釋液分別與0型口蹄疫滅活疫苗、0型口蹄疫多肽疫苗、0型口蹄疫DNA疫苗及鴨疫里氏桿菌減毒疫苗進(jìn)行體積比1:20混合制成相應(yīng)的不完全弗氏佐劑疫苗。
[0020]實(shí)施例3
以實(shí)施例2制備的太子參為主料的中藥提取物佐劑0型口蹄疫滅活疫苗與不完全弗氏佐劑0型口蹄疫滅活疫苗進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn):
將168只昆明系小鼠(培養(yǎng)于福建貝迪藥業(yè)有限公