合歡皮皂苷佐劑及其制備方法和含該佐劑的疫苗制劑及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有免疫佐劑作用的合歡皮皂苷及其制備方法和含該皂苷佐劑的疫苗制劑，以及它們?cè)谥苽湟呙缰苿┲械膽?yīng)用。該皂苷是從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，可誘導(dǎo)局部組織產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，募集免疫細(xì)胞到注射部位，誘生機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫應(yīng)答，顯示出比現(xiàn)有技術(shù)中已知的鋁膠佐劑能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發(fā)揮理想的免疫效果。以該類皂苷為佐劑的疫苗制備工藝簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、質(zhì)量容易控制、使用方便、可冰凍保存。
【專利說明】合歡皮皂苷佐劑及其制備方法和含該佐劑的疫苗制劑及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及從中藥合歡皮中提取分離的具有免疫佐劑作用的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，及其制備方法和含該皂苷佐劑的疫苗制劑，以及它們?cè)谥苽湟呙缰苿┲械膽?yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]疫苗接種是預(yù)防和控制傳染性疾病最經(jīng)濟(jì)、有效的手段。DNA疫苗、重組疫苗和合成肽疫苗等新型疫苗是近年來發(fā)展迅速的一類生物制劑，比常規(guī)疫苗具有抗原純度高、特異性強(qiáng)、安全性好等優(yōu)勢(shì)。然而，這些新型疫苗免疫原性弱，免疫效力低下[Oyston P,Robinso K.The current challenges for vaccine development.J Med Microbiol2012; 61(7): 889-894]。同此，當(dāng)前疫苗研究正面臨一些復(fù)雜病原如瘧疾、結(jié)核、人免疫缺陷病毒等的重要挑戰(zhàn)[Leroux-Roels G.Unmet needs in modern vaccinology:Adjuvants to improve the immune response.Vaccine 2010; 28 (Supp.3): C25-36]。佐劑是傳統(tǒng)疫苗和當(dāng)前新型疫苗必不可少的組成成分，不僅能影響機(jī)體對(duì)疫苗免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，而且能針對(duì)特定病原體誘導(dǎo)最有效的免疫應(yīng)答類型[Mbow ML, De GregorioEj Valiante NMj et al.New adjuvants for human vaccines.Current Opinion inImmunology 2010; 22(3): 411-416]。目前研究的免疫佐劑種類很多，如油佐劑、弗氏佐劑、微生物及其代謝產(chǎn)物、核酸及其類似物、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體等[Dey AKj Srivastava IK.Novel adjuvants and delivery systems for enhancing immune responses inducedby immunogens.Expert Rev Vaccines 2011; 10: 227-51]，但由于存在不同程度的毒副作用或安全隱患等一些不可避免的缺陷而難以實(shí)際應(yīng)用[Mbow ML, De Gregorio EjValiante NMj Rappuoli R.New adjuvants for human vaccines.Curr Opin Immunol2010，22(3): 411-6; Batista-Duharte A，Lindblad EBj Oviedo-Orta E.Progressin understanding adjuvant immunotoxicity mechanisms.Toxicol Lett 2011;203(2): 97-105] o鋁膠佐劑自192`0s使用以來，直至最近由鋁鹽和TLR4激動(dòng)劑3_0_去?；鵢4’ -單磷酰脂質(zhì)A組成的AS04被批準(zhǔn)之前一直是唯一通過FDA批準(zhǔn)的人用疫苗佐劑[Marrack P， McKee AS， Munks MW.Towards an understanding of the adjuvantaction of aluminium.Nat Rev Immunol 2009; 9: 287-293]。然而，銀膠佐劑存在一些問題:①主要通過誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體起保護(hù)作用，不能誘生Thl型免疫應(yīng)答和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，只適用于以抗體為主要保護(hù)性免疫的疫苗(Exley C，SiesjoP，Eriksson H.The immunobiology of aluminium adjuvants: how do they reallywork? Trends Immunol 2010; 31: 103-109) 對(duì)人免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等多種抗原無佐劑作用[O’ HaganDTj De Gregorio E.The path to a successful vaccine adjuvant - ^the long andwinding road’.Drug Discov Today 2009; 14: 541 - 551] 可促進(jìn) IgE 抗體產(chǎn)生，容易誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生過敏反應(yīng)有局部反應(yīng)，會(huì)形成肉芽腫，極個(gè)別可發(fā)生局部無菌性膿腫；⑤因其理化性質(zhì)特點(diǎn)，含鋁膠疫苗怕凍，凍后鋁膠容易變性；⑥對(duì)人、畜神經(jīng)系統(tǒng)可能有影響。因此，鋁膠佐劑已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足新型疫苗發(fā)展的要求[Kool M, Fierens K，Lambrecht BN.Alum adjuvant: some of the tricks of the oldest adjuvant.J MedMicrobiol 012; 61 (7): 927-934]。尋找安全、有效、新型的免疫佐劑是當(dāng)前疫苗研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[Schijns VEJCj Lavelle EC.Trends in vaccine adjuvants.ExpertRev Vaccines 2011; 10(4): 539-550]。免疫佐劑研究現(xiàn)已被列為疫苗研究的優(yōu)先領(lǐng)域[Harandi AM， Medaglini D, Shattock RJ.Vaccine adjuvants: A priority forvaccine research.Vaccine 2010; 28(12): 2363-2366; Harand AM， Brewe J， SchijnV.Conference Scene: Recent advancements in immunopotentiators for modernvaccines.1mmunotherapy 2011; 3(11): 1297-301]。
[0003]天然藥物用于防治疾病具有悠久的歷史。當(dāng)今，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的藥物約30%來源于天然藥物。新的具有免疫活性的天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)日益成為研究重點(diǎn)，尤其在尋找新一代疫苗佐劑方面[Licciardi PVj Underwood JR.Plant-derived medicines: A novel classof immunological adjuvants.1nt ImmunopharmacoI 2011; 11 (3): 390-398]。阜苷(saponin)是一類廣泛存在于中藥和天然藥物中的重要免疫活性物質(zhì)[Rios JL.Effectsof triterpenes on the immune system.J Ethnopharmacol 2010; 128: 1-14]。自1951年發(fā)現(xiàn)皂苷能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)口蹄疫疫苗的免疫應(yīng)答以來，其佐劑作用受到了廣泛的關(guān)注。研究最多的是南美阜樹(Quillaja saponaria Molina )樹皮中篩選到具有佐劑活性
總阜苷-Quil A 及其活性成分 QS-21 [Skene CD and Sutton P.Saponin-adjuvanted
particulate vaccines for clinical use.Methods 2006; 40: 53-9]0 Quil A和 QS-21對(duì)外源性抗原既能剌激Thl免疫應(yīng)答，又能誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)應(yīng)答。這一獨(dú)特的特性使其成為亞單位疫苗、細(xì)胞內(nèi)病原體疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑[MbawuikeI， Zang Y， Couch RB.Humoral and cell-mediated immune responses of humans toinactivated influenza `vaccine with or without QS21 adjuvant.Vaccine 2007;25(17): 3263-9]。但Quil A存在嚴(yán)重的缺陷:①溶血性強(qiáng)、毒副作用大，可引起局部組織壞死，甚至全身不良反應(yīng)和中毒[Waite DC, Jacobson EWj Ennis FA, Edelman R，WhiteB, Kammer R， et al.Three double-blind, randomized trials evaluating the safetyand tolerance of different formulations of the saponin adjuvant QS-21.Vaccine2001; 19: 3957-7.]。臨床安全性評(píng)價(jià)結(jié)果表明:Quil A用于人不安全。目前除了用于為某些絕癥設(shè)計(jì)的疫苗如癌癥疫苗和人免疫缺陷病重組疫苗等人用疫苗外，主要限用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗等獸用疫苗。②其主要活性成分如QS-21、QS-17、QS-18和QS-7等分子結(jié)構(gòu)中均存在?；?，易水解，其去?；猱a(chǎn)物失去誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答及產(chǎn)生特異性CTL 的能力，只能引發(fā) Th2 型免疫應(yīng)答[Kensil CR.1mmunomodulatory adjuvants fromQuillaja saponaria.1mmunopotentiators in Modern Vaccines 2007; 109-22.] ；(3)南美皂樹資源匱乏，總皂苷含量低，同時(shí)Quil A中單體化合物分子量大，化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，分離制備困難。因此，從天然藥物中尋找篩選高效、低毒的皂苷佐劑受到國內(nèi)外學(xué)者高度的關(guān)注[Sun HX, Xie Y，Ye YP.Advances in saponin-based adjuvants.Vaccine 2009,27(12): 1787-1796]。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一類用于疫苗的具有顯著免疫佐劑作用的合歡皮皂苷佐劑。
[0005]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供從中藥合歡皮中提取分離合歡皮皂苷佐劑的方法。
[0006]本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供一種包含所述合歡皮皂苷佐劑的疫苗制劑。
[0007]本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供所述合歡皮皂苷佐劑在制備疫苗制劑中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的合歡皮皂苷佐劑包括從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
[0009]本發(fā)明提供的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B是從中藥合歡皮中提取分離的，制備方法包括以下步驟，
以下所說濃度均為質(zhì)量濃度:
a.將合歡皮藥材粉碎后，以乙醇提取；
b.濃縮乙醇提取液，以水混懸，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有機(jī)溶劑層近無色，得到水層溶液；
c.取水層以水飽和的正丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取
物；
d.取步驟b中的水層溶液或步驟C中的醇萃取物在大孔吸附樹脂柱中進(jìn)行色譜純化，以水和濃度75%乙醇依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷;`
e.合歡皮粗皂苷經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離，以濃度30%、50%、75%乙醇依次洗脫，分別收集濃度50%乙醇和濃度75%乙醇的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到2個(gè)流份；
f.取步驟d中合歡皮粗皂苷和步驟e中2個(gè)流份再分別經(jīng)離子交換樹脂色譜柱精制，以濃度70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集濃度70%乙醇吸收液，濃縮，冷凍干燥，得到合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)。
[0010]上述步驟d和步驟e的中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂；步驟f中所說的離子交換樹脂為D941弱堿性陰離子交換樹脂。
[0011]本發(fā)明的含合歡皮皂苷佐劑的疫苗制劑，包含有免疫有效量的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B以及含有一種或多種藥物學(xué)上可接受的載體。
[0012]本發(fā)明的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B可在制備疫苗制劑中應(yīng)用。
[0013]上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域的藥物載體。例如:稀釋劑、賦形劑如水、生理鹽水、葡萄糖、甘露醇、甘油、乙醇及其混合物等；填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、海藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕潤劑如甘油；崩解劑如碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如吐溫-80 ;潤滑劑如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和聚乙二醇等。另外還可以在組合物中加入其它輔料如香味劑、甜味劑等。
[0014]本發(fā)明的疫苗制劑可以是溶液、混懸液或乳濁液形式，可通過口服、鼻吸入、直腸、腸胃外或經(jīng)皮給藥的方式施用于需要接種的對(duì)象。本發(fā)明的疫苗制劑用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋微丸、固體分散體、包含物等，制成的液體制劑如混懸劑、乳劑、溶膠劑、糖漿劑、合劑、溶液劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性混懸劑、乳劑、凍干粉、脂質(zhì)體、微囊、微球、納米囊、納米球等。優(yōu)先的形式是注射用凍干粉及溶液。
[0015]本發(fā)明的疫苗制劑可按照藥學(xué)和疫苗領(lǐng)域的任何常規(guī)生產(chǎn)方法制備。
[0016]疫苗制劑的典型單劑量可以根據(jù)制劑的形式而變化，并根據(jù)抗原種類、所需的抗體水平、接種對(duì)象的特異性及所需的免疫程序等各種因素進(jìn)行確定。本發(fā)明的疫苗制劑中合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的量可為0.0 Iiig~I g /單劑量，優(yōu)選為0.1~IOOiig/單劑量?？梢砸淮位蚨啻问┯谩?[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明具有免疫佐劑作用的皂苷(包括合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B)可誘導(dǎo)局部組織產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，募集免疫細(xì)胞到注射部位，誘生機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生Thl型和Th2型免疫應(yīng)答，且顯示出比現(xiàn)有技術(shù)中已知的鋁膠佐劑能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。因此，可以作為多種疫苗的免疫佐劑，發(fā)揮理想的免疫效果。以該類皂苷為佐劑的疫苗制備工藝簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、質(zhì)量容易控制、使用方便、可冰凍保存。該類皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本發(fā)明的皂苷有望開發(fā)成疫苗佐劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)OVA受免小鼠血清中特異性IgG抗體效價(jià)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對(duì)照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0019]圖2為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)OVA受免免疫小鼠血清中特異性IgGl抗體效價(jià)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、屮〈0.01 和 C/K0.001 ks OVA 對(duì)照組；d/X0.05,^0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0020]圖3為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對(duì)OVA受免小鼠血清中特異性IgG2a抗體效價(jià)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對(duì)照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0021]圖4為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對(duì)OVA受免小鼠血清中特異性IgG2b抗體效價(jià)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠,/X0.05、bZX0.01 和 C/X0.001 ks OVA 對(duì)照組；d/X0.05、^<0.01 和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0022]圖5為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)Con A刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠；a/X0.05、b/X0.01 和 CP<S).001 ks OVA 對(duì)照組；d/X0.05 和e/X0.01 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0023]圖6為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A(AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)對(duì)LPS刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠 ^/X0.05、b/X0.01 和。/X0.001 ks OVA對(duì)照組；d/X0.05 和 eZX0.01 ks
鋁膠對(duì)照組。
[0024]圖7為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)OVA刺激的OVA受免小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠；b/X0.01和。/X0.001 ks OVA對(duì)照組；少〈0.05 ks鋁膠對(duì)照組。
[0025]圖8為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)OVA受免小鼠自然殺傷(NK)細(xì)胞活性的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠^/X0.05和bZX0.01 ks OVA對(duì)照組；少〈0.05 ks鋁膠對(duì)照組。
[0026]圖9為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A(AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgG 抗體效價(jià)的影響。Alum:鋁膠；^<0.01 和 cZX0.001 ks OVA 對(duì)照組;屮〈0.05，eZX0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0027]圖10為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgGl抗體效價(jià)的影響。Alum:鋁膠；^<0.001 Ks OVA對(duì)照組；^<0.05、e/X0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0028]圖11為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性IgG2a抗體效價(jià)的影響。Alum:鋁膠;bP<0.01和C/X0.001 ks OVA對(duì)照組；^<0.01和f/X0.001 Ks鋁膠對(duì)照組。
[0029]圖12為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中特異性 IgG2b 抗體效價(jià)的影響。Alum:鋁膠；CP<0.001 ks OVA 對(duì)照組；e/X0.01 和 f/X0.001 ks鋁膠對(duì)照組。 [0030]圖13為合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)對(duì)OVA免疫小鼠遲發(fā)性超敏(DTH)反應(yīng)的影響。OVA:卵清蛋白；Alum:鋁膠。bZX0.01 和 e/X0.001 ks OVA 對(duì)照組。
[0031]圖14為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內(nèi)注射對(duì)小鼠局部組織細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響。
[0032]圖15為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內(nèi)注射對(duì)小鼠局部組織趨化因子蛋白表達(dá)的影響。
[0033]圖16為合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)肌內(nèi)注射對(duì)局部組織免疫細(xì)胞募集的影響。DCs:樹突狀細(xì)胞；neutrophils:中性粒細(xì)胞；eosinophils:嗜酸性粒細(xì)胞；mastcells:肥大細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下通過實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制其范圍。
[0035]以下所說濃度均為質(zhì)量濃度。[0036]實(shí)施例1:合歡皮皂苷制備 制備合歡皮總皂苷
藥材桔梗粗粉I kg，以濃度70%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以水飽和正丁醇萃取，直至萃取液近無色，合并萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取物。醇萃取物經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂柱，依次用水和濃度75%乙醇進(jìn)行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷。粗皂苷混懸于蒸餾水中，上D941弱堿性陰離子交換樹脂色譜柱純化，濃度70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮總皂苷(AJS)。
[0037]藥材桔梗粗粉I kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇進(jìn)行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷。粗皂苷混懸于蒸餾水中，上D941弱堿性陰離子交換樹脂色譜柱純化，濃度70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮總皂苷(AJS)。
[0038]合歡皮總阜苷為淺黃白色粉末。Lieberman-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽性，示含三萜皂苷化合物。以齊墩果酸為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀于540 nm比色測(cè)得AJS中總皂苷含量為37.65%。
[0039]制備合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A
藥材桔梗粗粉I kg，以70%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷。合歡皮粗皂苷進(jìn)行大孔吸附樹脂柱色譜，以水、濃度30%乙醇和濃度50%乙醇依次洗脫，收集濃度50%乙醇洗脫液，減壓回收、`濃縮，濃縮液上D941弱堿性陰離子交換樹脂色譜柱純化，以濃度70%乙醇進(jìn)行梯度洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)0合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A為近白色粉末。Lieberman-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽性,示含三職阜苷化合物。以齊墩果酸為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀于540 nm比色測(cè)得AJS中總皂苷含量為46.72%。
[0040]制備合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B
藥材桔梗粗粉I kg，以濃度70%乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，浸膏加適量水混懸，用乙醚萃取至醚液近無色。水層以醋酸乙酯萃取，直至萃取液近無色，水層減壓回收、濃縮，經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂色譜柱，依次用水和濃度75%乙醇進(jìn)行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷。合歡皮粗皂苷進(jìn)行大孔吸附樹脂柱色譜，以水、3濃度0%乙醇、濃度50%乙醇和濃度75%依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，減壓回收、濃縮，濃縮液上D941弱堿性陰離子交換樹脂色譜柱純化，以濃度70%乙醇進(jìn)行洗脫，用薄層色譜檢查洗脫液，具有相同斑點(diǎn)的流份合并，減壓回收、濃縮，冷凍干燥，得合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B(AJSB)。合歡皮阜苷佐劑活性有效部位B為淺黃白色粉末。Lieberman-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽性，示含三萜皂苷化合物。以齊墩果酸為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，香草醛濃硫酸顯色，紫外分光光度儀于540 nm比色測(cè)得AJS中總皂苷含量為51.99%。
[0041]實(shí)施例2含皂苷佐劑的乙肝疫苗制劑
稱取合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B 500ii g和重組乙型肝炎病毒表面抗原(rHBsAg) IOOii g，以生理鹽水10 ml溶解，以
0.22 ii m微孔濾膜濾過,無菌分裝,每支I ml。每ml含阜苷50 y g和rHBsAg 10 u go
[0042]實(shí)施例3含鋁膠和皂苷佐劑的乙肝疫苗制劑
稱取合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B適量，以生理鹽水溶解，制成濃度為100 u g/ml的溶液，以0.22 ii m微孔濾膜濾過。將該皂苷溶液與等體積的含鋁佐劑乙型肝炎病毒表面抗原疫苗原液(每ml含HBsAg 20 Ug和氫氧化招500 ii g),混合均勻,無菌分裝,每支lml。每ml含阜苷50 ii g、HBsAg 10 ii g和氫氧化招250 u go
[0043]實(shí)施例4 合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的溶血性
以真空采血管從兔耳靜脈采 集血液，加生理鹽水，混勻，1500 r/m離心10 min，洗滌3次，收集紅細(xì)胞以生理鹽水稀釋制成0.5%紅細(xì)胞懸液，備用。取Quil A、合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B，分別用生理鹽水溶解，并作倍比稀釋制成濃度為1000、500、250、125、62.5,31.25、15.63,7.81 u g/ml的稀釋液。于96孔微量板中，分別加入0.5%兔紅細(xì)胞懸液100 u I及不同濃度的皂苷稀釋液100 u 1，混勻，每個(gè)濃度重復(fù)3孔。另設(shè)生理鹽水及蒸餾水分別作為最小和最大的溶血性對(duì)照。37°C培養(yǎng)箱孵育30 min, 1500 r/m離心lOmin。各孔取上清液100 y I,以酶標(biāo)儀于波長405 nm處測(cè)定OD值。重復(fù)3次，計(jì)算引起50%溶血的濃度(HD5tl)。結(jié)果顯示:合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對(duì)0.5%兔紅細(xì)胞的HD50值分別為 25.66 ±0.97、195.8 ±6.2 和 7.87 ±0.30 y g/ml，而 Quil A 在相同條件下測(cè)得的 HD50值為2.10±0.08 u g/ml。說明合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的溶血性均顯著低于Quil A 0° < 0.001)。
[0044]實(shí)施例5合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對(duì)OVA受免小鼠免疫應(yīng)答反應(yīng)的佐劑作用
實(shí)驗(yàn)方法:清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)分組，每組5只。PBS對(duì)照組:每只注射磷酸緩沖液(PBS) 0.2 ml ;卵清白蛋白(OVA)對(duì)照組:每只注射含OVA 100 y g的PBS 0.2 ml ;氫氧化鋁對(duì)照組:每只注射含200 u g氫氧化鋁和100 u g OVA的PBS 0.2 ml ;合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B試驗(yàn)組:每只注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 u g OVA的PBS 0.2 ml。各組皮下注射免疫2次，第一次免疫和第二次免疫間隔14天。二免后14天，采血，分離血清，檢測(cè)特異性抗體效價(jià)；將小鼠斷頸處死，無菌條件下取脾，制備脾細(xì)胞懸液，進(jìn)行脾細(xì)胞增殖反應(yīng)和NK細(xì)胞活性分析。
[0045]結(jié)果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著促進(jìn)Con A、LPS和OVA誘導(dǎo)的OVA受免小鼠脾細(xì)胞增殖反應(yīng)(圖1~3);提高免疫小鼠血清中OVA特異性IgG, IgGU IgG2a和IgG2b抗體效價(jià)(圖4~7);增強(qiáng)免疫小鼠NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性(圖8)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)不僅能促進(jìn)免疫小鼠對(duì)OVA的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，而且可誘導(dǎo)平衡的Thl/Th2免疫應(yīng)答，對(duì)模式抗原OVA具有顯著的佐劑作用。
[0046]實(shí)施例6 合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗的佐劑作用
實(shí)驗(yàn)方法:將合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)以PBS溶解制成濃度分別為0.5、1.0和2.0 mg/ml的稀釋液，以0.22 微孔濾膜濾過，備用。將商品鋁膠(Alum)以生理鹽水稀釋制成2 mg/ml的混懸液。將商品禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)加入PBS 50 ml，混勻，制成疫苗稀釋液。取疫苗稀釋液與等量的PBS、鋁膠稀釋液、合歡皮總皂苷(AJS)稀釋液、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)稀釋液或合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)稀釋液混勻，分別于第I和15天皮下注射免疫小鼠。二免后14天，采血，分離血清，進(jìn)行H5抗原特異性抗體效價(jià)檢測(cè)。
[0047]結(jié)果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著提高禽流感雞痘病毒載體活疫苗(rFPV)免疫小鼠血清中H5抗原特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體滴度，且免疫小鼠血清中H5抗原特異性IgG、IgGU IgG2a和IgG2b抗體滴度顯著高于Alum免疫組(圖9~12)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)三者都能同時(shí)誘導(dǎo)免疫小鼠對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗的Thl型和Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)禽流感雞痘病毒載體活疫苗具有顯著的佐劑作用，且佐劑活性顯著優(yōu)于鋁膠佐劑。
[0048]實(shí)施例7合歡皮總`皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B對(duì)OVA受免小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響
實(shí)驗(yàn)方法:清潔級(jí)ICR小鼠隨機(jī)分組，每組5只。PBS對(duì)照組:每只注射磷酸緩沖液(PBS) 0.2 ml ;卵清白蛋白(OVA)對(duì)照組:每只注射含OVA 100 y g的PBS 0.2 ml ;氫氧化鋁對(duì)照組:每只注射含200 u g氫氧化鋁和100 u g OVA的PBS 0.2 ml ;合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B試驗(yàn)組:每只注射含皂苷(50,100,200 u g)和100 iigOVA的PBS 0.2 ml。皮下注射致敏5天后小鼠左后足墊皮下注射含OVA 100 iig的PBS 0.05 ml進(jìn)行激發(fā)，右后足墊皮下注射PBS 0.05 ml作為對(duì)照。24小時(shí)后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量后足墊厚度(精確到0.01 mm)，以左右后足墊厚度差作為腫脹度，評(píng)定遲發(fā)性超敏反應(yīng)強(qiáng)弱。
[0049]結(jié)果表明:合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)能顯著促進(jìn)OVA受免小鼠對(duì)OVA誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)，而鋁膠佐劑對(duì)OVA受免小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)無顯著影響(圖13)。說明合歡皮總皂苷(AJS)、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A (AJSA)和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)三者均能顯著誘導(dǎo)OVA首免小鼠細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)三者對(duì)OVA受免小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答具有顯著的佐劑作用，而鋁膠佐劑對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)沒有佐劑作用。
[0050]實(shí)施例8合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B肌內(nèi)注射對(duì)小鼠局部組織細(xì)胞因子和趨化因子蛋白表達(dá)水平的影響
實(shí)驗(yàn)方法:清潔級(jí)Balb/C小鼠隨機(jī)分組，每組3只。PBS對(duì)照組:每只小鼠右肢肱四頭肌注射PBS緩沖液0.05 ml ;合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)試驗(yàn)組:每只小鼠右肢肱四頭肌注射含合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)IOOiig的PBS緩沖液0.05 ml。注射后4小時(shí)，斷頸處死小鼠，75%酒精消毒后，剪開皮膚，收集肱四頭肌，采用小鼠炎癥因子抗體芯片檢測(cè)其中40種細(xì)胞因子和趨化因子蛋白表達(dá)水平。
[0051]結(jié)果表明:合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)注射后可誘導(dǎo)或上調(diào)IFN- y、IL-1 ^、IL-3、IL-6、IL-9、IL-10、IL_12p40/p70、IL_12p70、IL-13、TNF-a、可溶性腫瘤壞死因子I型(sTNFRI)、III型(sTNFR III)等12種細(xì)胞因子(圖14)，以及嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白(Eotaxin)、巨噬細(xì)胞炎癥因子la (MIP-1a ), 0 -趨化性細(xì)胞因子(RANTES)、人胸腺表達(dá)趨化因子(TECK)、CX3C類趨化因子(Fractalkine)、干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞a型趨化因子(1-TAC)、血漿炎性趨化因子(MIG)、FasL、M-CSF和GM-CSF等10個(gè)趨化因子(圖15)蛋白表達(dá)。
[0052]實(shí)施例9合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B肌內(nèi)注射對(duì)小鼠局部組織免疫細(xì)胞募集的影響
實(shí)驗(yàn)方法:清潔級(jí)Balb/C小鼠隨機(jī)分組，每組4只。PBS水對(duì)照組:每只小鼠肱四頭肌各注射PBS緩沖液0.05 ml ;卵清白蛋白(OVA)對(duì)照組:每只小鼠肱四頭肌各注射含OVA25 Ug的PBS 0.05 ml ;合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)試驗(yàn)組:每只小鼠肱四頭肌各注射含合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB) 50 ii g的PBS緩沖液0.05 ml ;卵清白蛋白與合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)聯(lián)合組:每只小鼠肱四頭肌各注射含OVA 25 U g和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB) 50 iig的PBS緩沖液0.05 ml。注射后24小時(shí)，斷頸處死 小鼠，75%酒精消毒后，剪開皮膚，收集肱四頭肌，以0.05% II型膠原酶溶液消化制備單細(xì)胞懸液，經(jīng)抗小鼠⑶16/⑶32抗體封閉，以抗小鼠⑶lie -PE、CDllb - FITC、Ly-6G - PE_Cy5、Ly-6C - APC, F4/80 antigen - PE_Cy5、FcERl - APC 和、Siglec-F - PE等抗體組合染色，流式細(xì)胞儀分析樹突狀細(xì)胞(⑶IIb+⑶Ilc+)、中性粒細(xì)胞(CDllc Ly-6C+Ly6Ghigh)、炎性單核細(xì)胞(CDllb+Ly6G_Ly6C+)、巨噬細(xì)胞(CDllb+F4/80high)、嗜酸性粒細(xì)胞(CDllb+Sigilec F+)和肥大細(xì)胞(FcERl+)等6類細(xì)胞的數(shù)量。
[0053]結(jié)果表明:合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B (AJSB)注射后可顯著募集樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞進(jìn)入注射部位(圖16)。
[0054]綜上所述，本發(fā)明的合歡皮皂苷具有顯著的免疫佐劑作用，可誘導(dǎo)局部組織產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，募集免疫細(xì)胞到注射部位，誘生機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生Thl型和Th2型免疫應(yīng)答，且顯示出比現(xiàn)有技術(shù)中已知的鋁膠佐劑能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)疫苗產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。同時(shí)，以該類皂苷為佐劑的疫苗制備工藝簡(jiǎn)單、方法簡(jiǎn)便、質(zhì)量容易控制、使用方便、可冰凍保存。該類皂苷成分的溶血性小和安全性好。所以，本發(fā)明的合歡皮皂苷有望開發(fā)成疫苗佐劑。
【權(quán)利要求】
1.合歡皮皂苷佐劑，其特征是從中藥合歡皮中提取分離的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
2.制備權(quán)利要求1中所述的合歡皮皂苷佐劑的方法，該方法包括以下步驟， 以下所說濃度均為質(zhì)量濃度: a.將合歡皮藥材粉碎后，以乙醇提取； b.濃縮乙醇提取液，以水混懸，用乙醚或醋酸乙酯萃取至有機(jī)溶劑層近無色，得到水層溶液； c.取水層以水飽和的正丁醇或戊醇萃取，合并萃取液，減壓回收、濃縮，得到醇萃取物； d.取步驟b中的水層溶液或步驟C中的醇萃取物在大孔吸附樹脂柱中進(jìn)行色譜純化，以水和濃度75%乙醇依次洗脫，收集濃度75%乙醇洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得合歡皮粗皂苷; e.合歡皮粗皂苷經(jīng)大孔吸附樹脂柱分離，以濃度30%、50%、75%乙醇依次洗脫，分別收集濃度50%乙醇和濃度75%乙醇的洗脫液，濃縮，冷凍干燥，得到2個(gè)流份； f.取步驟d中合歡皮粗皂苷和步驟e中2個(gè)流份再分別經(jīng)離子交換樹脂色譜柱精制，以濃度70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集濃度70%乙醇吸收液，濃縮，冷凍干燥，得到合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有 效部位A和合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是步驟d和步驟e的中所說的大孔吸附樹脂為DlOl大孔吸附樹脂；步驟f中所說的離子交換樹脂為D941弱堿性陰離子交換樹脂。
4.含合歡皮皂苷佐劑的疫苗制劑，其特征在于包含有免疫有效量的權(quán)利要求1所述的合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B和藥物學(xué)上可接受的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗制劑，其特征在于合歡皮總皂苷、合歡皮皂苷佐劑活性有效部位A或者合歡皮皂苷佐劑活性有效部位B的量為0.01 μ g~Ig /單劑量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合歡皮皂苷佐劑在制備疫苗制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/48GK103768593SQ201410005853
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】孫紅祥 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)