專利名稱：一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥與疾病免疫領域，更具體地講，涉及應用于生化制藥等領域的經皮膚與粘膜免疫的疫苗佐劑，主要應用于人或動物的預防傳染病或腫瘤方面的疫苗， 建立了一種類似于LT突變體及其亞基的多亞基復雜結構的蛋白制備方法。
背景技術：
各種傳染病的不斷發(fā)生，對現(xiàn)有的疫苗提出了新的挑戰(zhàn)。比傳統(tǒng)更加簡便、快捷、 更有利于大規(guī)模的接種的粘膜免疫疫苗，已成為目前國內研究的新方向。安全有效的粘膜免疫佐劑正成為粘膜免疫疫苗的關鍵。大腸桿菌熱敏感毒素(heat-labile toxin, LT)是目前世界上公認的免疫效果最好的之一。因此，采用基因工程技術高效制備減毒且可作為粘膜免疫佐劑的LT突變體(LTm)及其亞基已成為國內外研究普遍追求的目標。但是，由于LT結構的特殊性與復雜性，主要表現(xiàn)在下列方面LT基因可以編碼兩種蛋白亞基，電泳結果顯示一個分子量約為^KD、另一個約為12KD，LT在細胞中為穩(wěn)定的二亞單位蛋白。LT分子量為87KD，國外科學家已經過一系列的交聯(lián)實驗及純化、電泳已確認，LT是由1個約^KD的A亞基(LTA)和5個約12KD的B亞基(LTB)組成的6聚體結構蛋白，國外的有的學者將其形象的比喻成“月球車”。經研究表明，LT操縱子含有兩個基因，即編碼A亞基單位的toxA基因和編碼B亞單位的toxB基因，并轉錄成一條mRNA鏈，二者首尾相接4bp，LT_A的基因編碼區(qū)長76^p， 編碼2M個氨基酸，eltA上游約-76至_43bp處為啟動子序列，其中_76至-7Ibp區(qū)GCATAT 和-49至-4;3bp區(qū)GTTATCT均為啟動子信號序列，核糖體結合位點TAAG位于起始密碼子 ATG上游-13至-IObp區(qū)W3]。而eltB起始于eltA末端，LT-A的C末端的最后的兩個密碼子(TTATGA)與LT-B的N末端的兩個密碼子(ATGAAT)重疊，這表明eltA和eltB由同一啟動子操縱，eltA和eltB可能以共轉錄的方式合成mRNA。B亞基雖然離啟動子比較遠，但是B亞單位比A亞單位表達量高很多，可能與其調控裝置有密切的關系，通常認為是由于toxB在mRNA上可能與核糖體的結合更加的牢固導致。在LT全蛋白中，A、B亞基比例是1 :5，但是這并非是A亞基和B亞基在大腸桿菌真實表達量情況。在利用同位素示蹤法摻入對A、B單位的分泌及全毒素裝配動力學的研究發(fā)現(xiàn)， 在細胞周質中的比例為1. 4-1. 7A/5B，其中絕大部分的B和A結合在一起，只有55%_60%的 A和B結合，而多余的A亞基則被菌體自身降解。B亞單位被合成以后一分鐘內就被分泌到細胞的周質中，約80%會迅速的聚集成寡聚體。X射線晶體結構分析表明，B亞基單位有兩組分別由三個反平行的β片層結構、 一個N末端的α螺旋和一個長的位于中心的α螺旋組成，N末端的α螺旋通過二硫鍵與 β 5片層連接。Β5聚體與A亞單位相鄰面平行，而中心的α螺旋從另一面向外延伸，形成一個由50-60為氨基酸組成的小環(huán)，按這種結構合成的肽段可誘導機體產生抗LT的抗體。 Β5聚體間只有相鄰的單體間有相互作用，5聚體形成后，原表面39%都會包埋起來，有利于維持Β5聚體結構的穩(wěn)定。其中心的α螺旋有25個陽離子和15個陰離子，可以形成一個強的親水區(qū)，雖然B5的離子中心里親水性很強，但是只有幾個特異性結合的相互作用力， 即空洞中心兩頭的兩個疏水鍵和一個離子鍵。電鏡觀察顯示，圍繞這個中心的5個亞基結合成一個非常緊密的環(huán)狀結構。A亞基單位呈三角形結構，由兩個功能不同亞單位組成有酶活性的Al亞單位和一個短的連接B5聚體的Al亞單位的A2 β片層。Α2亞單位由一個結構域，含有較短的9個α螺旋和9個β片層。Α2亞單位起始于第200位氨基酸殘基，是 Al的一個延伸α螺旋，在結構上它起始于三角形的一個角上。因此，利用通常的基因工程技術制備實踐證明有較大的困難。在采用大腸桿菌作為表達宿主制備LT的過程中，LT在大腸桿菌中的表達量非常的低，只有1-5%。有研究表明，在LT基因正常表達形成LT蛋白的過程中，不到50%的LTA亞基與LTB亞基進行了結合裝配成ΑΒ5形式。通過調節(jié)LTA亞基和LTB亞基的表達量上的比例關系來達到提高LT的產量已成為熱點之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術方案一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB，其特征在于，將不同亞基蛋白LTA、LTB或全蛋白質LT分別構建于不同的表達框以調節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達量。利用P⑶FDuet-I和ρ ΒΙΙ兩類載體，在基因水平將LT突變體或其LTA 或LTB亞單位基因或LTA的突變體LTAm的原核表達載體ρ⑶FDuet-1-LTAm-LTB、 pCDFDuet-l-MCSl-LTm、ρCDFDuet-1-LTB-LTm、ρCDFDuet-1-MCS 1-LTB、 pCDFDuet-l-LTB-LTm、pTYB 11-LTB-EGFP, pTYBll-LTB 或 pTYBll-LTm 中的一種或幾種轉化到BL21感受態(tài)細胞中。表達質粒優(yōu)選為pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm 或者 ρ ΒΙI-LTB 中的一種或幾種。工程菌BL21/pITBlI-LTB的誘導表達條件為在2ΧΥΤ培養(yǎng)基之中，在37°C生長到0D600=0. 8后，轉至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進行誘導8h。本發(fā)明所述大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm是指既能降低蛋白本身毒性，又能保持免疫活性的突變體，主要包括但不限于LTm7，LTm63，LTmll2，LTml92。本發(fā)明所述LTA的突變體LTAm其突變位點的要求與UTm相同，主要包括但不限于LTAm7，LTAm63, LTAml 12, LTAml92。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明主要運用將不同亞基或全蛋白質分別構建于不同的表達框以調節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達量，以克服多亞基復雜蛋白對其整體進行基因表達效能降低的問題，從而促進疫苗黏膜免疫佐劑的有效制備。這種對疫苗黏膜免疫佐劑大腸桿菌熱敏感毒素LT (heat-labile toxin, LT)突變體及其亞基的制備方法，不僅適合于LT及其突變體與亞基本身的有效制備，制作工藝程序簡便、快捷，而且也對類似結構的多亞基蛋白質，包括酶，建立了一種在基因水平分別構建、組合表達，以最終實現(xiàn)在蛋白水平的按比例、有活性的組合制備完整蛋白的技術。通過的疫苗抗原，為黏膜疫苗經皮膚、粘膜產生免疫效應起到轉運和協(xié)助抗原發(fā)揮免疫應答功能的作用。其中所述的黏膜免疫佐劑包括LT本身、LT單點或多點突變體、亞基蛋白LTA與LTB。所涉及的蛋白分子主要應用于生化制藥等領域的經皮膚與粘膜免疫的疫苗，優(yōu)先應用于“旅游者腹瀉”、各類流感粘膜疫苗、手足口病、口蹄疫等易于經過呼吸道、 消化道、生殖道等與環(huán)境相曝露的黏膜與皮膚的傳染病疫苗。本發(fā)明的應用領域不局限于預防傳染病的疫苗，還適用于抗腫瘤方面的疫苗；其應用對象不限于人類，還可用于動物。


圖1為對LTm全基因及其亞基的擴增所用的引物序列。圖2為生產LTm及其亞基的表達載體的構建路線。圖3為質粒pCDFDuet-1-LTAm-LTB構建流程示意圖。圖4為質粒ρ ΒΙ I-LTB-EGFP構建流程示意圖。圖5為8個原核表達載體的具體信息。圖 6 為 BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB, BL21/pCDFDuet-l-MCSl_LTB， BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm, BL21 /pCDFDuet-1 -LTm-LTB, BL21/pCDFDuet-l-LTB_LTm 在 LB 培養(yǎng)基中誘導表達產物電泳圖。圖7為BL21/ρ ΒΙI-LTB在LB和2ΧYT培養(yǎng)基中誘導表達產物電泳圖，其中，1_4 (LB培養(yǎng)基誘導)8Μ尿素溶解物、2Μ尿素溶解物、菌液、裂解上清；5 =Marker ；6-9 (2ΧΥΤ 培養(yǎng)基)裂解上清菌液、2Μ尿素溶解物、8Μ尿素溶解物。圖8為BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達產物分析圖，其中，1:BL21 ；2:菌體；3:全菌體裂解液I ；4:Marker ；5:裂解液I上清；6:2M尿素溶解物；7:2M尿素溶解物上清；8:8M 尿素溶解物。圖 9 為 BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm表達產物分析圖，其中，1 :BL21 ；2:菌體；3 全菌體裂解液I ；4 =Marker ；5 裂解液I上清；6 :2M尿素溶解物；7 :2M尿素溶解物上清；8 :8M 尿素溶解物。圖10為BL21/ρ ΒΙI-LTB-EGFP在2ΧΥΤ培養(yǎng)基中誘導表達產物電泳圖，其中1 Marker ；2:菌液電泳；3 裂解上清菌液；4 陰性對照；5 :2M尿素溶解物；6 :2M尿素溶解物上清；7 :8M尿素溶解物。圖11為溫度對菌體生長的影響，·‘表示37°C ； ■表示30°C ；▲表示20°C。圖12為不同誘導劑濃度對CBD-LTB蛋白表達的影響。圖13為溫度對菌體CBD-LTB總蛋白表達量的影響，··表示37°C 表示30°C ；▲ 表示20 0C ο圖14為溫度對可溶的CBD-LTB表達的影響，“表示37°C ； ■表示30°C ；▲表示 20°C。圖15為溫度對可溶的CBD-LTB占總蛋白比列的影響，”表示37°C ； ■表示30°C ； ▲表示20°C。圖16為BL21/ρ ΒΙI-LTB表達產物分析圖，1 =Marker ；2 全菌體；3 全菌體裂解
液；4:沉淀。
圖17為工程菌表達產物信息表。圖18為6XHis-LTAm融合蛋白純化蛋白電泳圖，其中，1 :2M尿素溶解物；2 :8M尿素溶解物；3 =Marker ；4 :50mM咪唑洗脫液；5 =IOOmM咪唑洗脫液；6 :200mM咪唑洗脫液。圖19為CBD-LTB純化蛋白電泳圖，其中1 =Marker ；2 上樣液；3 洗脫峰I ；4 洗脫峰II。圖20為融合蛋白CBD-LTB的幾丁質親和色譜的洗脫曲線。圖21為CBD-LTB-EGFP純化蛋白電泳圖，其中，1 :Marker ；2 上樣液；3 洗脫峰I ； 4:洗脫峰II。圖22為融合蛋白表達產物的SDS-PAGE電泳和^ferstern Blotting分析，(左為SDS-PAGE電泳圖，右為Wertern Blotting圖)其中， Line 1Marker, Line2BL21/PTB11-LTB, Line3BL21/pCDFDuet-l-LTAm_LTB，Line4BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm,Line5BL21/pCDFDuet-1-MCS1-LTB, Line6:BL21/ pCDFDuet-l-LTB-LTm, Line7:BL21/pCDFDuet-l-LTm_LTB。圖23為融合蛋白LTB-EGFP跨膜實驗，其中，A，C為LTB-EGFP實驗組；B，D陰性對照組。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明做詳細說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實施例一生產LTm及其亞基的表達載體的構建。在華東理工大學生物工程學院基因與蛋白質實驗室保存的LTml92基因序列的基礎上，根據(jù)實驗需要和表達載體的不同，設計了如下的引物，用于對LTm全基因及其亞基的擴增，其序列見圖1。所有引物由上海捷銳生物技術有限公司合成。利用分子生物學常規(guī)實驗技術，具體按照《分子克隆》進行。按照下列技術路線及方法進行構建。以載體pCDFDuet-Ι系列原核表達載體構建流程示意圖如圖3所示，質粒 pTYBlI-LTB-EGFP構建流程示意圖如圖4所示。通過PCR和酶切鑒定，正確的構建克隆了 UTm、LTB、LTA, EGFP基因的基礎上，利用常規(guī)的分子生物學技術構建和鑒定出了 8個正確構建的原核表達載體，分別是 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-LTB-LTm、pCDFDuet-1-LTm-LTB、 pCDFDuet-1-MCS1-LTB、pCDFDuet_1-MCS1-LTm,pTYBll-LTB、pTYB11-LTB-EGFP、pTYB11-LTm 表達載體的具體信息如圖5所示。實施例二轉化LTm及其亞基蛋白的工程菌的誘導表達與檢測。1)大腸桿菌DH5a (Novagen，USA，實驗室保存)用于質粒擴增，大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen, USA，實驗室保存)作為質粒表達的宿主菌。pCDFDuet-1-LTB-LTm、 pCDFDuet-l-LTm-LTB、ρCDFDuet-1-LTAm-LTB、ρCDFDuet-1-MCS1-LTB、 pCDFDuet-l-MCSl-LTm、p!TBll-LTB、pITBlI-LTm均為華東理工大學生物工程學院基因與蛋白質實驗室構建。2)生化試劑與培養(yǎng)基包括一抗羊CTB多克隆抗體和二抗兔抗羊HRP-IgGFc購自 Santa Cruz Biotechnology 公司、考馬斯亮藍購自 Amreco 公司、chitin beads 購自 NEB 公司。
3) IPTG 將2g IPTG溶于8ml水中，用純水調節(jié)體積到10ml，用0. 22um 一次性濾皿過濾除菌。分裝成1 ml小份，貯存于-20°C。4)蛋白電泳緩沖液參照《分子克隆》(第2版相關章節(jié))。蛋白電泳系統(tǒng)30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，N，N’ -亞甲雙丙烯酰胺lg，溶解于水中，定容至100ml，置于棕色瓶中 4 °C 保存；IXSDS 凝膠加樣緩沖液:50mmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8)，1 OOmmo 1/LDTT, 2%SDS, 0. 1%溴酚藍，10%甘油；TriS-HCl-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸， 0.l%SDSo5)目的蛋白在大腸桿菌中的誘導表達將鑒定正確的質粒轉化到BL21中，挑取轉化子接入5ml含有相應抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。將過夜新鮮菌液以1 :50接入 LB和2XYT培養(yǎng)基中，當0D600達到0. 8時，加入誘導劑至終濃度0. 5mM，誘導6小時時分別取樣，菌液經12000rpm、lmin離心，去培養(yǎng)基上清，沉淀加入IX上樣緩沖液10(TC水浴 5min,離心后進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠5%，分離膠12%)，染色、脫色。6)表達產物SDS-PAGE電泳和^festern Blotting檢測蛋白質上樣前的處理及 SDS-PAGE電泳。將上述菌體裂解物IOOOOrpm離心，盡量棄凈上清。向菌體裂解物沉淀中加 Λ ρΗ8· 0的TE 100 μ 1和2倍上樣液100 μ 1 ；煮沸2_5min，IOOOOrpm離心5min。每孔上樣 15 μ 1進行不連續(xù)垂直電泳。當染料處于積層膠中時電泳電壓為60V ；當染料電泳出積層膠后電泳電壓升到160V，直到染料電泳出分離膠為止。Western blotting 檢llj。(1)電轉移蛋白質SDS-PAGE電泳后，切出含待轉移蛋白的凝膠，剪6張同樣大小的濾紙和1張硝酸纖維素膜，將它們浸泡于轉移緩沖液中(48mmol/l的Tris堿，39mmol/l 的甘氨酸，0. 037%SDS, 20%甲醇)中，使其對齊，無氣泡存在，將支架夾緊插入電泳槽中，硝酸纖維膜一側接陽極，凝膠一側接陰極，加轉移緩沖液沒過凝膠，以30V電壓4°C轉移14-18h。(2)封閉電轉移結束后，加封閉液(10mmol/l Tris-HCL，Ph7. 5，150mmol/l NaCl, l%Tween20, 3%BSA)浸泡硝酸纖維素膜，室溫封閉池。封閉后用洗滌緩沖液(IOmmol/ 1 Tris-HCL, Ph7. 5，150mmol/l NaCl,0. 05%Tween20)，漂洗硝酸纖維素膜，每次 5min。(3)與第一抗體反應一抗為羊抗CTB多克隆抗體，用含有1%BSA的洗滌緩沖液 1 :1000稀釋抗體，按濾膜面積0. lml/ cm 2加入稀釋后的抗體(將轉移面與抗體接觸)室溫反應池，用洗滌緩沖液洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。(4)與第二抗體反應以辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG(HRP-IgGFc)為第二抗體。用含有1%BSA的洗滌緩沖液1 :2000稀釋抗體，按濾膜面積0. lml/ cm 2加入稀釋后的抗體室溫反應池，用洗滌緩沖液洗硝酸纖維素膜3次，每次5min。(5)顯色:A.在 9ml 的 0. 01mol/l 的 Tris-HCL (Ph7. 6)的溶液中溶解 6mg 的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)JnA Iml的0. 3% (w/v)的NiCl2，用Whatmanl號濾紙過濾底物溶液以除去可能形成的沉淀物；B.加入10μ 1的30%的H2O2，混勻后立即使用，把經漂洗的硝酸纖維素膜移至一淺托盤上，按濾膜面積加入0. lml/cm 2的底物溶液，于室溫輕輕搖動溫育之(避光)；C.細心觀察反應過程，一旦蛋白帶顏色深度達到要求(約5分鐘)，即用水略為漂洗，然后把內膜轉移到內裝250ml的磷酸鹽緩沖液的另一淺托盤中；D.拍攝濾膜照片，留作永久的實驗記錄。將轉化好的工程菌接種于LB培養(yǎng)基之中，當0D600為0. 8時加入誘導劑IPTG使終濃度為0. 5mM，37°C誘導6小時，取樣進行SDS-PAGE電泳，結果如圖6所示。BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm工程菌接種到在2 X YT培養(yǎng)基中，接種量5%，在 37°C度誘導至0D600值為0. 8時加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導6小時后，誘導表達產物 SDS-PAGE電泳結果如圖7所示。從圖7中明顯可以看出在37°C、IPTG終濃度為0. 5mM，誘導時間為6小時的時候在66KD處明顯的出現(xiàn)特異性的蛋白目的條帶。運用蛋白層析掃描軟件對目的蛋白區(qū)域進行積分66KD處條帶分別占總蛋白的20%和30%左右。結果顯示BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB、BL21 /pCDFDuet-1-MCS1-LTB, BL21/ pCDFDuet-l-MCSl-LTm、BL21/pTYBIl-LTB宿主菌在2XYT培養(yǎng)基中的表達量高于LB。這可能是2 X YT培養(yǎng)基營養(yǎng)較為豐富，誘導時相同時刻的菌體的生長密度高于在LB表達時造成。故本實驗后續(xù)誘導表達培養(yǎng)基均以2XYT進行。本實驗對表達量相對較高的基因工程菌BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB、BL21/ pCDFDuet-1-MCS1 -LTm,BL21 /pTYB 11-LTB-EGFP,BL21 /pTYB 11-LTB 的表達情況進行了分析， 結果如圖8、圖9、圖10所示。將新鮮的BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB工程菌菌液接種到2 X YT培養(yǎng)基中，接種量 5%，在37°C度誘導至0D600值為0. 8時加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導6小時后，誘導表達產物SDS-PAGE電泳圖。由圖8可以看出在^KD和12KD處均有目的條帶產生，運用蛋白層析掃描軟件對目的蛋白區(qū)域進行積分^KD占總蛋白的35%左右，12KD處蛋白占總蛋白含量的10%左右。由圖中還可以看出分子量為^KD的蛋白以包涵體形式表達，而分子量為12KD 的蛋白以可溶性形式表達。將新鮮的BL21/pCDFDuet-l-MCSl-LTm工程菌菌液接種到2 X YT培養(yǎng)基中，接種量 5%，在37°C度誘導至0D600值為0. 8時加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導6小時后，誘導表達產物SDS-PAGE電泳結果如圖9所示。由圖9可以看出在^KD和12KD處均有目的條帶產生，運用蛋白層析掃描軟件對目的蛋白區(qū)域進行積分^KD占總蛋白的30%左右，12KD處蛋白占總蛋白含量的8%左右。由圖中還可以看出分子量為^KD的蛋白以包涵體形式表達， 而分子量為12KD的蛋白以可溶性形式表達。BL21/pTYBlI-LTB-EGFP工程菌接種到在2X YT培養(yǎng)基中，接種量5%，在37°C度誘導至0D600值為0. 8時加入IPTG至終濃度0. 5mM，誘導6小時后，誘導表達產物SDS-PAGE 電泳結果如圖10所示。由圖10可以看出在92KD處有目的條帶產生，運用蛋白層析掃描軟件對目的蛋白區(qū)域進行積分^KD占總蛋白的20%左右，由圖中還可以看出分子量為92KD 的蛋白以包涵體形式表達。實施例三轉化LTm及其亞基蛋白的工程菌的誘導表達優(yōu)化。1) BL21/pITBll-LTB工程菌表達條件優(yōu)化。將質粒轉化到BL21感受態(tài)細胞中， 經IPTG誘導對外源基因在大腸桿菌中進行了只表達與A、B亞基的共表達情況，經初步表達產物SDS-PAGE電泳、Western Blotting實驗結果檢測圖觀察，表達情況較好的質粒有 pCDFDuet-l-LTAm-LTB、pCDFDuet-l-MCSl-LTm、pTYBll-LTB。其中 pTYBll-LTB 表達載體，可以與保護性抗原基因在基因水平上進行融合表達粘膜免疫疫苗的通用載體，本實驗對其表達條件進行了優(yōu)化，并以EGFP指示作為指示蛋白，特構建了 ρ ΒΙI-LTB-EGFP表達質粒，作為LTB穿膜的指示標志。
2)搖瓶培養(yǎng)。挑取轉化子接入25ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，于 370C，200 rpm搖床培養(yǎng)。待細胞生長到0D600約為0. 6-0. 8時，開始加入誘導劑IPTG (終濃度為0.4 mmol/L)進行誘導表達。所有的搖瓶實驗結果均為三次實驗的平均值。3)培養(yǎng)基pH對表達量的影響。以2XYT培養(yǎng)基，分別調整三角瓶中pH為6、6. 5、 7、7. 5、8、8. 5。取Iml新鮮菌液按1%接種量接種于上述培養(yǎng)基中(含有Amp終濃度100 μ g/ ml), 37°C振蕩培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8時，加入IPTG至終濃度0. 5mM,培養(yǎng)6h以后取出Iml 菌液至1.5ml印管內，離心收集菌體。4)宿主對CBD-LTB可溶性表達的影響。挑取轉化子BL21(DE3)/pITBll-LTB-EGFP 和 Origami (DE3)/pITBll-LTB-EGFP 接入 25ml LB 培養(yǎng)基中，于 37 °C，200 rpm 搖床培養(yǎng) IOh0將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml 2 X YT培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)。 待細胞生長到0D600約為0. 6-0. 8時，加入誘導劑IPTG (終濃度為0. 5mmol /L)進行誘導表達，同時將培養(yǎng)溫度設定為37°C和20°C，誘導他取樣。5)溫度對CBD-LTB可溶性表達的影響。挑取轉化子BL21 (DE3) /pTYBl I-LTB-EGFP 接入25ml LB種子培養(yǎng)基中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)10h。將培養(yǎng)物按照3%的接種量接入到50ml 2XYT中，于37°C，200 rpm搖床培養(yǎng)，待細胞生長到0D600約為0. 6-0. 8時，加入誘導劑IPTG至終濃度0. 5mmol進行誘導表達，同時將培養(yǎng)溫度設定為37°C，30°C，20°C， 每隔池取樣。6)工程菌BL21(DE3)/pITBll-LTB可溶性表達條件優(yōu)化。由于本實驗所有篩選的表達載體中，BL21(DE3)/pITBll-LTB是融合蛋白中表達量最高，所以有必要對其表達條件進一步優(yōu)化，以期待能獲得更加高產的誘導表達體系，本實驗以2XYT培養(yǎng)基為基礎，從誘導溫度、IPTG誘導物的濃度、誘導時間等外在條件經行了初步的實驗優(yōu)化，以優(yōu)選最佳的表達條件。7)溫度對菌體生長的影響。溫度是菌體生長的重要影響因素，不同的溫度直接影響最終的菌體密度，進而影響總的蛋白表達量。研究溫度對菌體生長的影響結果如圖11所示。由圖11可知，30°C至37°C間，溫度對于菌體的生長影響較小，但是在20°C時，菌體生長速度和終密度均有明顯降低。8)誘導劑濃度對pITBll-LTB表達量的影響。由圖12可知，在溫度一定的情況下， 隨著在IPTG濃度的升高，CBD-LTB的表達量隨著增加。在誘導劑IPTG濃度一定的情況下， CBD-LTB量隨著溫度的升高而增加。然而在0. 6mM時，誘導8小時以后，CBD-LTB表達產物多以包涵體形式存在，而在0. 2mM時，誘導8小時以后，在37°C時CBD-LTB的表達量到達了沈％，但是多以包涵體形式存在。在0. 4mM時，溫度為20°C，誘導時間為8小時的情況下，獲得了可溶性比例較高CBD-LTB表達產物。本實驗在后續(xù)的實驗中均采用誘導劑IPTG濃度 0. 4mM，進行后續(xù)試驗條件的優(yōu)化。9)溫度對ρ ΒΙI-LTB表達量及可溶性比率的影響。溫度對CBD-LTB總蛋白表達量的影響如圖13，對可溶性CBD-LTB表達量的影響如圖14所示，可溶性比率如圖15所示。37°C誘導條件下，細胞生長密度以及重組蛋白的表達水平都是最高的；與37°C 相比，30°C誘導條件下，細胞生長沒有受到很大影響，而重組蛋白的表達水平也只有少量的下降；30°C與20°C相比，細胞生長和重組蛋白表達水平均有顯著差異，而可溶目標蛋白的表達量及比例也相差較多，主要原因可能是降低溫度增加折疊中間體的穩(wěn)定性或減少折疊中間體之間錯誤的相互作用，特別是疏水相互作用，或者是在溫度較低時，折疊中間體能處于一種熱動力學上更利于折疊的構象。當誘導溫度繼續(xù)降低到20°C時，細胞密度和目標蛋白表達量分別比37 °C降低了 43%和45%，可溶目標蛋白表達水平比30 V也降低了 10%左右， 然而，在誘導溫度20°C，誘導8小時條件下，37°C誘導時可溶性比率僅21%，30V誘導比率也只有70%，但是在20°C時卻獲得了 90%的高可溶比例。綜合考慮選用20°C作為可溶表達的誘導溫度。通常情況下，低溫培養(yǎng)條件下表達外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例，因此本實驗通過降低誘導溫度，考察了溫度對CBD-LTB (可溶性)表達的影響，可見，隨著誘導溫度的降低，細胞密度逐漸下降，總的目標蛋白表達水平降低，目標蛋白可溶比例隨之升高。經過一系列表達條件的篩選和優(yōu)化后，工程菌BL21 (DE3) /pTYBl I-LTB在2 X YT培養(yǎng)基之中，在37°C生長到0D600=0. 8后，轉至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進行誘導他，如圖16所示。經凝膠薄層掃描后分析，可溶性融合蛋白CBD-LTB的表達水平可達菌體總蛋白的27%。這對于具有粘膜免疫作用而又不穩(wěn)定的LTB的生產具有重要的前景。實施例四LTm及其亞基蛋白的純化技術。1)幾丁質純化試劑。Cell Lysis Buffer :20 mM Tris-HCl, pH 8.5,500 mM NaCl, 1 mM EDTA,0. 1% Triton X-100 ；
Column Buffer :20 mM Tris-HCl, pH 8.5,500 mM NaCl，1 mM EDTA ；
Cleavage Buffer 20 mM Tris-HCl,pH 8.5,500 mM NaCl，50 mM DTT，1 mM EDTA ；
Stripping Solution :0.3 M NaOH ；
1，4-Dithiothreitol (DTT) (1.0 M DTT)新鮮配制放于-20°C保存；3X SDS Sample Buffer :20mM Tris-HCl (pH 6.8),6% (w/v) SDS，30% 甘氨酸，0. 03% (w/v)溴酚藍，加入 DTT 至 40 mM，存放于-20°C。2)目的蛋白純化。分離純化基因工程蛋白一直是其規(guī)?；a中的關鍵問題，工程菌的構建策略在很大的程度上決定了下游目標多肽純化的難以程度也成本。采用融合蛋白技術是現(xiàn)階段制備工程蛋白的主要的采用的技術之一，該技術的主要的特點是在表達目的多肽片段時，使目的多肽具有純化標簽(Purification tag)，在其純化過程中，只需通過融合標簽一步親和層析即可獲得高純的的融合蛋白，在本實驗中LTAm的純化采用His標簽融合，而LTB則采用CBD方式融合。3 ) 6 X Hi s-LTAm 蛋白純化。組氨酸標簽純化原理多聚組氨酸親和標簽(6XHis)層析的原理是組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個組氨基酸含有一個咪唑基團，這個化學結構帶有很多額外電子，對于帶正電的化學物質有靜電引力，能夠與多種過渡金屬離子如Cu2+，Zn2+, Ni2+, Co2+，！^3+發(fā)生相互作用，有很高的親和力，然后利用咪唑進行洗脫，利用這個原理對蛋白質加以分離。4) 6XHis-LTAm 包涵體的制備。(1)接種表達菌液于500ml含100 μ g/ml Amp的2 X YT培養(yǎng)基中，經IPTG總濃度 0. 5mM，誘導6小時。
(2) 4°C，8000rpm離心15min，收集菌體。用TE (PH8. 0)洗滌菌體兩次。(3)將菌體重懸于IOmlTE (PH8. 0)中，凍溶數(shù)次，超聲破碎(400W，每次4s，間隔 5s)至菌液清亮。4°C，12000rpm離心20min，收集沉淀。(4)沉淀重懸于:3ml的2mol/l尿素中，4°C放置lh，離心收集沉淀，上清保留。(5)沉淀重懸于5ml的8mol/l尿素中，于4°C放置過夜，4°C，12000rpm離心 lOmin，取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。5) 6XHis-LTAm融合蛋白的純化。將細胞破碎后的用NaOH調至pH7. 5，上樣于親和層析柱，刻柱事先用NTA-O緩沖液平衡，上樣后通過緩沖液NTA-O與緩沖液NTA-IOOO (20mM Tris-HCl，0. 5M NaCl, IOOOmM 咪唑，pH7. 5)混合，以不同濃度咪唑步進式梯度洗脫目標蛋白，隨后將收集的目標峰上樣于 Sephadex G25凝膠柱進行脫鹽，將其緩沖體系更換為IOmM的磷酸鈉緩沖液(pH=7. 4)。6) CBD標簽融合表達蛋白的少量純化。CBD融合蛋白純化原理本實驗中采用的ρ Β 11原核表達質粒是NEB公司 IMPACTTM新型的蛋白融合表達及純化系統(tǒng)中的一種。表達的LTB蛋白與一種蛋白自剪接元件(稱為“內含肽”，intein)其中含有幾丁質結合蛋白結構域形成融合蛋白。通過利用內含肽的可誘導自我剪接活性，在幾丁質層析柱上將目標蛋白釋放出來，達到采用一個層析柱進行蛋白分離純化的方法。該系統(tǒng)無需蛋白酶參與，因而是一種快速而經濟的蛋白純化方法。7) CBD標簽融合表達蛋白樣品的制備。(1)細菌培養(yǎng)取一個單菌落先接種于IOml LB培養(yǎng)基含氨芐100 μ g/ml，37°C振蕩培養(yǎng)3-4h，后接種于200mL2XYT含氨芐100 μ g/ml液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600達 0. 5后，20°C誘導。(2)誘導蛋白表達加入IPTG至終濃度為0. 4mM，誘導8小時。設立陰性對照，陰性對照不加IPTG。(3)細胞收集5000Xg，4°C離心10分鐘，棄上清。將細胞貯存于_20°C。(4)細胞粗提物的制備用50ml冰冷的細胞裂解緩沖液(Cell Lysis Buffer)將菌體重懸，冰浴，超聲破碎細胞，使蛋白釋放。20，000Xg，離心10分鐘，上清即為澄清的細胞粗提物。8) CBD標簽融合表達蛋白樣品的純化。(1) Chitin 柱的平衡將 24ml chitin beads 15ml 柱床體積倒入 2. 5X IOcm 柱中，用10個柱床體積的Column Buffer在4°C進行柱平衡。Chitin的用量由融合蛋白的總量來決定，每毫升柱床體積大約能夠結合:3mg蛋白。(2)上樣將澄清的細胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速約為0. 5-1. Oml/min。上柱前將細胞粗提物與Column Buffer按比例1 :2_1 5混合稀釋，以提高蛋白結合效率。(3)洗柱由于CBD和Chitin beads的結合力很強，洗柱時可以用較高的流速 2-3ml/min IM NaCl，20倍柱床體積的緩沖液徹底洗柱。(4) Intein的自我裂解活性的誘導用3倍柱床體積的含有50mM DTT (或β -巰基乙醇或半胱氨酸)的誘裂解緩沖液(Cleavage Buffer)過柱，使巰基化合物均勻分布于整個Chitin柱。誘裂解緩沖液過柱后，將Chitin柱的出水口用柱帽堵上，20°C放置16小時，誘導htein的自我裂解活性。(5)目標蛋白的洗脫釋放裂解反應誘導后，目的蛋白與融合的intein尾分離， 可進一步用Column Buffer或特定的蛋白貯存液洗脫。(6) Chitin樹脂的再生=Chitin樹脂可通過以下步驟重復再生使用4_5次。用3 倍柱床體積的0. 3M NaOH(即蛋白剝脫溶劑化物Gripping Solution)漂洗Chitin柱，使樹脂在該液中浸泡30分鐘后，再用7倍柱床體積的0. 3M NaOH進一步洗脫，最后用20倍柱床體積的水和5倍柱床體積的Column Buffer漂洗。Chitin樹脂貯存于4°C。9)表達產物的純化結果。本實驗中所構建的BL21 (DE;3)/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達的融合蛋白LTAm含有多聚組氨酸，LTAm表達量也較高，占總蛋白量的35%，可以通過一步鎳離子金屬螯合層析得以純化。有文獻報到，雖然單獨的LTAm沒有活性，但是其可以增加LTB的活性，為了后續(xù)的 LTB跨膜活性檢測實驗，本實驗也對LTAm進行了初步的純化。10) 6XHis-LTAm融合蛋白的純化。BL21/pCDFDuet-l-LTAm-LTB表達產物分析圖如圖8所示。重組表達質粒在37°C 條件下，IPTG終濃度0. 5mM,誘導6小時以后，收集菌體后重懸超聲破碎，離心取沉淀。利用 Tris-HCl pH8. 5的8M尿素溶解包含體，4°C攪拌過夜，確保包涵體完全變性。將已變性的包含體與Ni柱介質進行結合，約3小時后洗滌、洗脫。取溶解液5mL上樣，先用pH為8. 5 的Tris-HCl緩沖液平衡鎳柱介質，讓介質處于適合的緩沖體系中，上樣，結合3小時效果更好，用不同濃度階段的咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，分別收集洗脫液進行SDS-PAGE鑒定分析純化結果見圖18所示。在50mM、100mM、200mM咪唑洗脫濃度下均有目標蛋白出現(xiàn)，可知 200mM咪唑洗效果更好。經蛋白掃描層析軟件掃描，在咪唑濃度200-250mM洗脫下來目標蛋白，純度可達85%。由電泳圖18可知，6XHis-LTAm包含體溶解物在咪唑濃度為200mM就被洗脫下來。 可能是由于洗脫液的PH值會隨咪唑梯度而改變，一般咪唑的濃度越高，緩沖液的PH值越低。融合蛋白與Ni柱的結合主要是依賴His與Ni2+之間的靜電相互作用，pH值變化，His 殘基帶靜電荷的性質發(fā)生變化，與M2+作用改變，且咪唑能競爭結合M2+柱，將目標蛋白在較低濃度咪唑濃度下洗脫下來。11) CBD-LTB融合表達蛋白純化。在本實驗中BL21/pITBll-LTB表達產物分析圖如圖16所示。重組表達質粒在 20°C條件下，IPTG終濃度0.4mM，誘導8小時以后，收集菌體后重懸超聲破碎，15000rpm離心IOmin后取上清。用10個柱床體積的Column Buffer在4°C進行柱平衡后，將澄清的細胞粗提物緩慢加入Chitin柱，流速約為0. 5-1. Oml/min。上柱前將細胞粗提物與Column Buffer按比例1 :2混合稀釋，以提高蛋白結合效率。用3倍柱床體積的含有50mM DTT的誘裂解緩沖液(Cleavage Buffer)過柱，使巰基化合物均勻分布于整個Chitin柱。誘裂解緩沖液過柱后，將Chitin柱的出水口用柱帽堵上，20°C放置16小時以誘導htein的自我裂解活性，用3倍體積Column Buffe洗脫，在用3倍柱床體積的Gripping Solution漂洗柱上的CBD蛋白。通過50mMDTT (1，4-dithiothreitol)20°C條件下，誘導的內含肽的裂解作用16小時后，可以在幾丁質介質上將目標蛋白釋放出來，而內含肽與幾丁質結合蛋白仍然結合在幾丁質介質上，達到單柱分離和純化蛋白的目的。結果如圖19所示。
在使用采用的ρ ΒΙΙ原核表達質粒純化蛋白融合時，與蛋白純化的結果與下列因素有關1)結合的第一個氨基酸與切割效率有關，切割位點最佳處的氨基酸為M、G、L時切割效率較高，而為P、S、C、T、R時效率較低；2)裂解溫度和裂解時間也是其中的一個關鍵的因素，裂解溫度越低則裂解效率低，需要的裂解時間越長，使用Ρ Β11表達系統(tǒng)純化時一般采用4°C，誘導裂解48小時，但是本實驗采用23°C，誘導16小時即可達到95%的裂解量；3) DTT濃度根據(jù)具體的情況來定。融合蛋白CBD-LTB的幾丁質親和色譜的洗脫曲線如圖20所示。由圖19和圖21可以看出在12KD和43KD處均有特異性裂解條帶出現(xiàn)，符合LTB分子量12KD與LTB-EGFP分子量43KD的預測。實施例五純化后LTm及其亞基蛋白的檢測與初步應用。1)細胞培養(yǎng)。細胞株人乳腺癌細胞株Bcap-37，由華東理工大學生物工程學院基因與蛋白質實驗室所保存。細胞的復蘇、細胞的傳代、細胞的凍存(參考細胞培養(yǎng)手冊)。2)細胞的計數(shù)。細胞計數(shù)的原理和方法與血細胞計數(shù)相同。具體方法如下用PBS緩沖液洗滌兩次后，用消化液分散單層培養(yǎng)細胞，制成單個細胞懸液。將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋玻片邊緣，使懸液充滿蓋玻片和計數(shù)板之間，靜置:3min后，鏡下觀察，用IOX物鏡觀察計數(shù)板四角和中間大方格中的細胞數(shù)，細胞壓中線時，只計左側和上方，不計右側和下方的細胞。3) LTB-EGFP融合蛋白的體外穿膜活性檢測。取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞株Bcap-37，制成細胞懸液，調整細胞濃度為5' IO4/ ml并接種于96孔板中，每孔加入100 μ 1，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞充分貼壁后，小心吸掉上清，加入含融合蛋白LTB-EGFP 50mg/L的培養(yǎng)基，每孔100μ 1，設5個復孔，陰性對照組為稀釋同樣倍數(shù)的ΡΗ8. 5 PBS。經過9小時后取出培養(yǎng)板吸掉培養(yǎng)液，剩下的貼壁細胞繼續(xù)用PBS洗滌3遍，徹底洗凈沒有結合在細胞膜蛋白。在紫外熒光顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)。4)工程菌表達產物Wfestern Blotting免疫活性檢測。由于目前尚無只針對單一 A亞基檢測的試劑，故只能采用針對表達產物LTB做檢測，進而判斷表達產物的免疫原性。在LTB的檢測過程中，通常采用CTB多克隆抗體對LTB 進行檢測。本實驗以一抗羊CTB多克隆抗體對表達產物的LTB進行檢測來達到檢測目的。 由圖22可知在第2孔道中52-72KD之間出現(xiàn)特異性的結合條帶，這與CBD-LTB分子量67KD 預期相符，在3、4、5、6、7孔道中11-17KD之間均出現(xiàn)特異性條帶，這也與LTB分子量12KD 的預期相符。結合空白的BL21菌株相比，其他孔道中在^KD處明顯有蛋白的增加，可以推測出成功的表達出具有免疫原性的LTB蛋白和CBD-LTB蛋白。5)重組蛋白LTB-EGFP細胞跨膜作用檢測結果。取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞株Bcap-37，制成細胞懸液，調整細胞濃度為5' IO4/ ml并接種于96孔板中，每孔加入100 μ 1，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞充分貼壁后，小心吸掉上清，加入含融合蛋白LTB-EGFP 50mg/L的培養(yǎng)基，每孔100μ 1，設5個復孔，陰性對照組為稀釋同樣倍數(shù)的ΡΗ8. 5 PBS。經過9小時后取出培養(yǎng)板吸掉培養(yǎng)液，剩下的貼壁細胞繼續(xù)用PBS洗滌3遍，徹底洗凈沒有結合在細胞膜蛋白。在紫外熒光顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)，如圖23所示。接有LTB-EGFP與陰性對照相比，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光。單獨的 EGFP是不能獨立的穿透正常生長的細胞，表明LTB-EGFP具有跨膜活性。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
1.一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，所述黏膜免疫佐劑為大腸桿菌熱敏感毒素 LT、大腸桿菌熱敏感毒素突變體LTm以及大腸桿菌熱敏感毒素亞基蛋白LTA與LTB，其特征在于，將不同亞基蛋白LTA、LTB或全蛋白質LT分別構建于不同的表達框以調節(jié)多亞基蛋白 LT、突變體及其亞基的表達量。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，利用 ρ⑶FDuet-I和ρ ΒΙΙ兩類載體，在基因水平將LT突變體LTm或其LTA或LTB亞單位基因或 LTA 的突變體 LTAm 的原核表達載體 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm、 pCDFDuet-l-LTB-LTm、pCDFDuet-l-MCSl-LTB、pCDFDuet-l-LTB-LTm、pTYBl 1-LTB-EGFP、 pTYBIl-LTB或ρ ΒΙI-LTm中的一種或幾種轉化到BL21感受態(tài)細胞中。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，表達質粒為 pCDFDuet-1-LTAm-LTB、pCDFDuet-1-MCSl-LTm 或者 pTYBl I-LTB 中的一種或幾種。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，工程菌BL21/ρ ΒΙI-LTB的誘導表達條件為在2XYT培養(yǎng)基之中，在37°C生長到0D600=0. 8 后，轉至20°C下培養(yǎng)，以IPTG終濃度0. 4mM進行誘導他。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，其特征在于，所述 LTm 包括 LTm7，LTm63, LTml 12 和 LTml92。
全文摘要
本發(fā)明公開一種疫苗黏膜免疫佐劑分子的制備方法，主要運用將不同亞基或全蛋白質分別構建于不同的表達框以調節(jié)多亞基蛋白LT、突變體及其亞基的表達量，以克服多亞基復雜蛋白對其整體進行基因表達效能降低的問題，從而促進疫苗黏膜免疫佐劑的有效制備。這種對疫苗黏膜免疫佐劑大腸桿菌熱敏感毒素LT(heat-labiletoxin,LT)突變體及其亞基的制備方法，不僅適合于LT及其突變體與亞基本身的有效制備，制作工藝程序簡便、快捷，而且也對類似結構的多亞基蛋白質，包括酶，建立了一種在基因水平分別構建、組合表達，以最終實現(xiàn)在蛋白水平的按比例、有活性的組合制備完整蛋白的技術。
文檔編號C07K14/245GK102382853SQ20111003896
公開日2012年3月21日 申請日期2011年2月16日 優(yōu)先權日2011年2月16日
發(fā)明者劉琨, 姚碧, 鄭文云, 馬興元 申請人:華東理工大學