一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑及魚類浸泡免疫方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水生生物疾病免疫防治領(lǐng)域，尤其涉及一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑及魚類浸泡免疫方法。所述佐劑包括以下重量份數(shù)的組分：氮酮、皂草苷、乙醇酸、甘油、葡萄糖苷。本發(fā)明還提供了一種魚類浸泡免疫方法，其包括以下步驟：A)將上述佐劑與水混合得到佐劑溶液；取一部分上述佐劑溶液與疫苗溶液混合均勻，得浸泡免疫溶液；B)將待免疫魚類放入佐劑溶液中浸泡后撈起，用水清洗；C)將處理后的待免疫魚類移入浸泡免疫溶液中，充氣浸泡。本發(fā)明佐劑能有效提高浸泡免疫過程中進入魚體的疫苗量，顯著提高草魚出血病活疫苗(GCHV?892株)的免疫效果，其具有操作方便，成本低，對魚類安全等優(yōu)點。
【專利說明】
一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑及魚類浸泡免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于水生生物疾病免疫防治領(lǐng)域，尤其涉及一種提高漁用浸泡疫苗免疫效 果的佐劑及魚類浸泡免疫方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一，在我國淡水養(yǎng)殖中占重要地位。草魚飼料 來源廣、生長速度快，肉質(zhì)鮮美，深受廣大養(yǎng)殖者和消費者喜愛。但是，草魚病害多、養(yǎng)殖成 活率低，妨礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。草魚出血病是一種嚴重危害草魚魚種的病毒性疾病，其 流行范圍廣、傳播速度快，死亡率高，每年都對草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。長期以來， 草魚出血病的防治技術(shù)研究一直是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治技術(shù)研究的重要內(nèi)容。
[0003] 草魚出血病的主要癥狀是上下頌、口腔、眼眶周圍、鰭條基部、鰓及鰓蓋充血，眼球 突出；剝?nèi)ヴ~的皮膚，可看見肌肉有點狀或塊狀充血、出血，甚至全身肌肉呈鮮紅色;腸壁充 血或出血，腸內(nèi)無食物，腸道周圍脂肪、腸系膜、膽囊、鰓、脾、腎、肝也有出血點或血絲癥狀。 該病的癥狀分為三種類型:紅鰭紅鰓蓋型、紅肌肉型和腸炎型。
[0004] 草魚出血病毒是病毒性草魚出血病的致病病原，是中國分離的第一種魚類病毒， 隸屬呼腸孤病毒科，水生動物呼腸孤病毒屬，直徑70~80nm，二十面體球形顆粒，含有11個 片段的雙鏈RNA。不同地區(qū)存在不同的毒株。目前已報道了 10個分離株，該病毒主要引起中 國淡水養(yǎng)殖主要品種草魚在魚種階段發(fā)生出血病，因其寄生在魚體組織細胞中，具有很強 的抗藥性，所以難用藥物治療。
[0005] 目前，草魚出血病的預防方法已普遍采用疫苗免疫的方法，包括注射用疫苗、浸泡 疫苗及口服疫苗等。國內(nèi)的魚用疫苗產(chǎn)品制劑種類不多，在魚類疫苗研究方面多側(cè)重于注 射用疫苗。注射疫苗對草魚出血病防治效果明顯，但注射免疫工作量大、工作效率低，且會 對魚體造成傷害;而在浸泡免疫過程中，抗原需要克服魚類體表黏液、鱗片及皮膚的障礙， 才能進入機體，免疫效果差。
[0006] 基于上述現(xiàn)狀，提供新型浸泡疫苗佐劑，進一步改善魚類疫苗浸泡方法，提高魚類 疫苗免疫效果，是草魚養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展所必須的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑 及魚類浸泡免疫方法。其能有效提高浸泡免疫過程中進入魚體的疫苗量，從而顯著提高草 魚出血病活疫苗(GCHV-892株)的免疫效果，且其成本低，對魚類安全。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的 佐劑，所述佐劑包括以下重量份數(shù)的組分:氮酮〇. 01-1份、皂草苷2-5份、乙醇酸3.5-6份、甘 油10-20份、葡萄糖苷0.5-3份。
[0009] 優(yōu)選地，所述佐劑包括以下重量份數(shù)的組分:氮酮0.01份、皂草苷2份、乙醇酸3.5 份、甘油1 〇份、葡萄糖苷〇. 5份。
[0010] 優(yōu)選地，所述佐劑包括以下重量份數(shù)的組分:氮酮〇. 05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、 甘油15份、葡萄糖苷2份。
[0011] 優(yōu)選地，所述佐劑包括以下重量份數(shù)的組分:氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘 油20份、葡萄糖苷3份。
[0012] 優(yōu)選地，所述佐劑還包括乳木果油，所述佐劑中乳木果油和氮酮的重量比為1: 0·1_0·6 〇
[0013]優(yōu)選地，所述佐劑中乳木果油和氮酮的重量比為1:0.3。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種魚類浸泡免疫方法，包括以下步驟：
[0015] A)將上述佐劑與去離子水按1:40-60的體積比混合得到佐劑溶液，備用；
[0016] B)取一部分步驟A)所得佐劑溶液與疫苗溶液按照1:120-200的體積比混合均勻， 得浸泡免疫溶液，備用；
[0017] C)先將待免疫魚類放入步驟A)所得的佐劑溶液中浸泡10-30min后撈起，用水清洗 l_2min;
[0018] D)將經(jīng)上述步驟C)處理后的待免疫魚類移入步驟B)所得的浸泡免疫溶液中，充氣 浸泡30-60min，即完成免疫。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟A)中佐劑與去離子水的體積比為1:45-55。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟B)中所述佐劑溶液與疫苗溶液的體積比為1:150-200。
[0021 ]優(yōu)選地，所述步驟B)中所述佐劑溶液與疫苗溶液的體積比為1:160。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下技術(shù)優(yōu)勢：
[0023] 本發(fā)明漁用浸泡疫苗佐劑能有效提高浸泡免疫過程中進入魚體的疫苗量，從而顯 著提高草魚出血病活疫苗(GCHV-892株)對草魚的免疫保護，其免疫方法簡單，成本低，對魚 類安全，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。
【具體實施方式】
[0024] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應理解，以下實施例中所公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā) 明的實踐中發(fā)揮良好作用的技術(shù)。然而，在所公開的具體實施方案中可以做出許多改變，并 仍然獲得相同或相似的結(jié)果，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。
[0025] 實施例1: 一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑
[0026]所述佐劑由以下重量份數(shù)的組分組成:氮酮0.01份、皂草苷2份、乙醇酸3.5份、甘 油10份、葡萄糖苷0.5份。
[0027]實施例2: -種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑
[0028]所述佐劑由以下重量份數(shù)的組分組成：氮酮0.05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、甘油 15份、葡萄糖苷2份。
[0029] 實施例3: -種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑
[0030] 所述佐劑由以下重量份數(shù)的組分組成：氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘油20 份、葡萄糖苷3份以及乳木果油0.3份。
[0031 ]實施例4: 一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑
[0032]所述佐劑由以下重量份數(shù)的組分組成:氮酮0.08份、皂草苷4份、乙醇酸4.5份、甘 油12份、葡萄糖苷1.5份以及乳木果油0.0048份。
[0033]魚類浸泡免疫方法
[0034] A)將上述佐劑與去離子水按1:50的體積比混合得到佐劑溶液，備用；
[0035] B)取一部分步驟A)所得佐劑溶液與疫苗溶液按照1:160的體積比混合均勻，得浸 泡免疫溶液，備用；
[0036] C)將待免疫魚類放入步驟A)所得的佐劑溶液中浸泡60min后撈起，用水清洗lmin;
[0037] D)將經(jīng)上述步驟C)處理后的待免疫魚類移入步驟B)所得的浸泡免疫溶液中，充氣 浸泡20min，即完成免疫。
[0038] 對比例1: 一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑 [0039]乙醇酸增至6.5份，其他成分及其重量份數(shù)如實施例3。
[0040] 對比例2: -種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑
[0041 ]乳木果油的重量份數(shù)增至1份，其他組分及重量份數(shù)與實施例3相同。
[0042]對比例3:魚類浸泡免疫方法
[0043] S1:取佐劑與去離子水按1:50的體積比混合均勻得佐劑溶液，備用；
[0044] S2:取步驟S1所得佐劑溶液與疫苗溶液按1:160的體積比混合得浸泡免疫溶液，備 用；
[0045] S3:將待免疫魚類放入步驟S2所得的浸泡免疫溶液中充氣浸泡60min，即完成免 疫。
[0046] 對比例4:魚類浸泡免疫方法
[0047] S1:取佐劑與去離子水按1:50的體積比混合均勻得佐劑溶液，備用；
[0048] S2:將待免疫魚類放入步驟S1所得的佐劑溶液中浸泡20min后撈起，用水清洗 lmin；
[0049] S4:將經(jīng)上述步驟S2處理后的待免疫魚類移入疫苗溶液中，充氣浸泡60min，即完 成免疫。
[0050] 毒性試驗
[0051 ]( - )試驗魚:8-10g草魚苗40尾/組，共6組。
[0052](二)試驗分組：
[0053]將本發(fā)明實施例1-4以及對比例1-2組所得佐劑與水按照1:50的體積比混合均勻 得佐劑溶液，分別命名為實施例1組、實施例2組、實施例3組、實施例4組、對比例1組以及對 比例2組佐劑溶液。
[0054](三)處理方法:取6組草魚苗分別移入實施例1-4組以及對比例1-2組佐劑溶液中 浸泡半小時，觀察記錄各組草魚苗在浸泡7天后的狀態(tài)及死亡情況。
[0055](四）試驗結(jié)果。
[0056]試驗結(jié)果:各組草魚苗在浸泡后7天未出現(xiàn)不正常狀態(tài)，也未出現(xiàn)死亡的情況。
[0057] 不同浸泡免疫方法對草魚出血病疫苗免疫保護效果的影響試驗
[0058] 1.材料：
[0059] 1.1試驗魚：8-10g草魚苗450尾，試驗前暫養(yǎng)2周，觀察攝食活動狀態(tài)，確認健康后 用于試驗，試驗期間水溫(26 ± 1) °C。
[0060] 1.2疫苗溶液與強毒的制備:草魚出血病病毒GCHV接種草魚腎細胞(CIK)，28°C培 養(yǎng)6-8天，收集細胞與上清液即得疫苗溶液。強毒使用健康草魚制備，健康草魚注射感染含 有草魚出血病病毒的組織液，4-7天后魚體出現(xiàn)癥狀，收集患典型草魚出血病的病魚組織， 取病魚脾、腎等內(nèi)臟組織研磨，組織液經(jīng)離心、過濾除菌后得強毒，用于免疫攻毒試驗。
[0061 ] 2試驗分組
[0062] 空白對照組:試驗魚不經(jīng)任何表面處理直接攻毒；
[0063] 試驗①組:取實施例3所述佐劑按照對比例3所述浸泡免疫方法對試驗魚進行浸泡 免疫；
[0064] 試驗②組:取實施例3所述佐劑按照對比例4所述浸泡免疫方法對試驗魚進行浸泡 免疫；
[0065] 試驗③組:取實施例3佐劑按照本發(fā)明提供的浸泡免疫方法對試驗魚進行浸泡免 疫。
[0066] 試驗④組:試驗魚不經(jīng)任何表面處理，直接用1.2制備的疫苗溶液浸泡20min免疫。 [0067] 以上每組設(shè)3個平行組，每個平行組30尾草魚苗。
[0068] 2.1免疫后攻毒:免疫后15天各組用1.2制備的草魚出血病病毒強毒液攻毒，攻毒 采用注射感染方式。
[0069] 2.2試驗結(jié)果:攻毒15天后，統(tǒng)計各組存活率，結(jié)果見表1。
[0070] 表1免疫相對保護率
[0073] 注:相對免疫保護率計算方法:RPS= (1-試驗組死亡率/對照組死亡率）X 100%
[0074] 由上表可知，各組平均相對保護率從高到低排序為：試驗③組>試驗①組>試驗 ②組>試驗④組，其中，試驗③組的平均相對保護率為64.8%，高于試驗①組的50.0%以及 試驗②組的46.5%。試驗結(jié)果表明，利用本實施例3的佐劑對魚體進行預處理后，再經(jīng)由佐 劑與疫苗溶液混合而成的浸泡免疫溶液浸泡，能顯著提高浸泡疫苗對魚體的免疫保護作 用。
[0075] 本發(fā)明佐劑對疫苗免疫效果的影響
[0076] 1.材料
[0077] 1.1試驗魚：8-10g草魚苗210尾，試驗前暫養(yǎng)2周，觀察攝食活動狀態(tài)，確認健康后 用于試驗，試驗期間水溫(26 ± 1) °C。
[0078] 1.2病毒株:草魚出血病病毒GCHV-892株，購自肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司。
[0079] 1.3佐劑:本發(fā)明實施例1-4以及對比例1-2所得佐劑。
[0080] 1.4疫苗溶液的制備:草魚吻端成纖維細胞(PSF)按常規(guī)方法傳代，傳代后細胞匯 合度達到80 % -90 %時接種GCHV-892病毒株，28 °C培養(yǎng)5-6天，待轉(zhuǎn)瓶內(nèi)細胞病變完全，收集 細胞液進行無菌檢驗和支原體檢驗，并取樣檢測其病毒含量(TCID5Q)，病毒含量(TCID 5q)等 于或大于1X108時，留樣備用。
[0081 ] 2試驗方法
[0082] 將上述210尾草魚苗平均分為7組，每組30尾。取本發(fā)明實施例1-4以及對比例1-2 所得佐劑分別先與水按1:50的體積比混合得實施例1-4以及對比例1-2組佐劑溶液，取上述 一部分各組佐劑溶液分別與疫苗溶液按照1:160的體積比混合均勻得實施例1-4以及對比 例1-2組浸泡免疫溶液，標記好，備用。取其中6組草魚苗先分別放入本發(fā)明實施例1-4以及 對比例1-2組佐劑溶液中浸泡20min后撈起，用水清洗lmin，然后將經(jīng)上述處理后的6組草魚 苗分別對應放入上述各組浸泡免疫溶液中充氣浸泡;取剩下1組草魚苗先放入養(yǎng)殖用水中 浸泡20min，后移入疫苗溶液中浸泡作為對照組。
[0083] 2.3采樣
[0084] 于浸泡1〇111丨11、2〇111丨11、4〇111丨11、5〇111丨11、6〇111丨11、1.511、211、311時分別對各組浸泡魚苗取 樣，每個取樣點取3-5尾魚的腎臟混為一個樣品，樣品收集在RNA保存液中，待樣品全部取完 后測定魚體內(nèi)疫苗的相對含量，記錄并分析。
[0085] 2.4試驗結(jié)果如表2。
[0086]表2不同條件處理后魚體內(nèi)草魚出血病活疫苗的相對含量
[0087]
[0088]
[0089] 注:疫苗相對含量的計算方法：以GCHV的特異性基因 VP6在魚體腎臟中的表達量為 測定指標，采用Roche Light cycler480 PCR儀測定各樣品中VP6基因的表達量。具體步驟 如下：將采集好的樣品分別提取RNA，隨即用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計VP6基因和草魚18S 基因的實時定量PCR引物，18S作為內(nèi)參基因。使用Τ0Υ0Β0公司實時定量PCR試劑盒進行分 析，每孔PCR體系如下:Mix 5yL、上游引物0.4yL、下游引物0.4yL，模板cDNA lyL，加滅菌水 至10此，每個樣品做四個重復。
[0090] 試驗結(jié)果表明：實施例1-4組魚體內(nèi)疫苗的相對含量在不同的時間點的檢測結(jié)果 都明顯高于對比例1-2組，其中尤以實施例3組效果最優(yōu)，故實施例3組為本發(fā)明最佳實施 例。
[0091] 由于已經(jīng)通過以上較佳實施例描述了本發(fā)明，在本發(fā)明的精神和/或范圍內(nèi)，任何 針對本發(fā)明的替換/或組合來實施本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說都是顯而易見的，且 包含在本發(fā)明之中。
【主權(quán)項】
1. 一種提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑包括以下重量份數(shù) 的組分:氮酮0.01-1份、皂草苷2-5份、乙醇酸3.5-6份、甘油10-20份、葡萄糖苷0.5-3份。2. 如權(quán)利要求1所述的提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑包括 以下重量份數(shù)的組分:氮酮0.01份、阜草苷2份、乙醇酸3.5份、甘油10份、葡萄糖苷0.5份。3. 如權(quán)利要求1所述的提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑包括 以下重量份數(shù)的組分:氮酮0.05份、皂草苷3份、乙醇酸5份、甘油15份、葡萄糖苷2份。4. 如權(quán)利要求1所述的提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑包括 以下重量份數(shù)的組分:氮酮1份、皂草苷5份、乙醇酸6份、甘油20份、葡萄糖苷3份。5. 如權(quán)利要求1所述的提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑還包 括乳木果油，所述佐劑中乳木果油和氮酮的重量比為1: 〇. 1-0.6。6. 如權(quán)利要求5所述的提高漁用浸泡疫苗免疫效果的佐劑，其特征在于，所述佐劑中乳 木果油和氮酮的重量比為1:0.3。7. -種魚類浸泡免疫方法，其特征在于，包括以下步驟： A) 取權(quán)利要求1-6任一項所述佐劑與水按1:40-60的體積比混合得到佐劑溶液，備用； B) 取一部分步驟A)所得佐劑溶液與疫苗溶液按照1:120-200的體積比混合均勻，得浸 泡免疫溶液，備用； C) 先將待免疫魚類放入步驟A)所得的佐劑溶液中浸泡10-30min后撈起，用水清洗1-2min； D) 將經(jīng)上述步驟C)處理后的待免疫魚類移入步驟B)所得的浸泡免疫溶液中，充氣浸泡 30-60min，即完成免疫。8. 如權(quán)利要求7所述的魚類浸泡免疫方法，其特征在于，所述步驟A)中佐劑與水的體積 比為 1:45-55。9. 如權(quán)利要求7所述的魚類浸泡免疫方法，其特征在于，所述步驟B)中所述佐劑溶液與 疫苗溶液的體積比為1:150-200。10. 如權(quán)利要求9所述的魚類浸泡免疫方法，其特征在于，所述步驟B)中所述佐劑溶液 與疫苗溶液的體積比為1:160。
【文檔編號】A61K39/39GK105833266SQ201610263394
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】吉華松, 歐陽征亮, 陳瑞愛, 王阿明, 高任
【申請人】肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司