專利名稱：：黃芪多糖佐劑及其在i型鴨疫里氏桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種疫苗免疫佐劑和疫苗，具體地說(shuō)是一種黃芪多糖佐劑及其在I型鴨疫里氏桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide,APS)是中藥黃芪中主要的天然活性成分，具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、增加白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量、提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和巨噬細(xì)胞活性、誘生干擾素等作用。黃芪多糖一般制成藥物組合物，作為提高免疫力的藥物使用。但是作為疫苗佐劑使用未見(jiàn)報(bào)道。由于家禽特別是鴨子容易感染疾病，而且傳染速度很快，一旦鴨子感染疾病往往對(duì)養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此對(duì)雛鴨通過(guò)注射疫苗進(jìn)行早期防疫是非常必要的。而目前家禽的疫苗品種非常少，而家禽的傳染病種類又非常多。因此研究開(kāi)發(fā)一些效果良好的家禽疫苗非常有益和必要。公開(kāi)日為2008年6月18日、公開(kāi)號(hào)為CN101200710A的發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種鴨瘟疫疫苗及其專用毒株，它對(duì)鴨病毒性腸炎有很好的免疫效果，但是它對(duì)鴨傳染性漿膜炎卻沒(méi)有免疫效果。因此發(fā)明一種能夠有效地防控鴨傳染性漿膜炎的疫苗，防止該病的發(fā)生非常有意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有家禽疫苗的缺陷，提供一種疫苗佐劑和I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，它能夠提高傳統(tǒng)滅活苗的免疫效果，有效地防控鴨傳染性漿膜炎，也為新型免疫佐劑的研究提供依據(jù)。本發(fā)明疫苗免疫佐劑為黃萬(wàn)多糖溶液，其中黃芪多糖溶液濃度優(yōu)選為30mg/ml。將本發(fā)明黃甚多糖溶液作為疫苗免疫佐劑能夠提高傳統(tǒng)滅活苗的免疫效果。本發(fā)明疫苗的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的它由作為疫苗的鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和作為佐劑的黃芪多糖溶液混合而成。本發(fā)明的鴨疫里氏桿菌RA-1(i/ewwe〃a朋加;pe幼/w，RA-1)于2008年9月10日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO:M208128。其中鴨疫里氏桿菌RA-l滅活菌液濃度為lxlO"CFU/ml，黃芪多糖溶液濃度為20-50mg/ml。其中鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液按1:l的比例混合。本發(fā)明較好的技術(shù)方案是黃芪多糖溶液濃度為30mg/ml;所述的混合液中加入了混合液總體積的O.Ol%的硫柳汞。本發(fā)明的制備方法包括以下步驟(1)、將鴨疫里氏桿菌RA-1菌株用TSA平板復(fù)蘇后接種于TSB中，37。C搖振培養(yǎng)1824h，取培養(yǎng)液接種于TSA和血液瓊脂平板進(jìn)行純度檢查合格后作為種子液，4'C保存；(2)、將種子液按培養(yǎng)液體積的5%接種到TSB中，37'C通氣搖振培養(yǎng)24小時(shí)，純檢合格后采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，同時(shí)按菌液體積的0.4%加入甲醛溶液37"C滅活24h，滅活后調(diào)整菌液濃度至lxl010CFU/mL，接種于血液瓊脂和TSA平板，5%C02、37。C培養(yǎng)48h，無(wú)菌生長(zhǎng)者用于制備疫苗；(3)、將黃芪多糖配成濃度為20-50mg/ml的溶液；(4)、將鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液混合均勻即得到本發(fā)明。本發(fā)明更好的制備方法是在上述混合液中加入了混合液總體積的0.01%的硫柳汞。本發(fā)明提高了傳統(tǒng)滅活苗的免疫效果，有效地防控鴨傳染性漿膜炎，也為新型免疫佐劑的研究提供依據(jù)。本發(fā)明疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能有效預(yù)防鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。圖1I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗免疫后血清抗體水平圖中折線上字母不同者，表示差異極顯著(PO.Ol)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1(1)、將鴨疫里氏桿菌RA-1菌株用TSA平板復(fù)蘇后接種于TSB中，37r搖振培養(yǎng)1824h，取培養(yǎng)液接種于TSA和血液瓊脂平板進(jìn)行純度檢查合格后作為種子液，4t:保存；(2)、將種子液按培養(yǎng)液體積的5。/。接種到TSB中，37"C通氣搖振培養(yǎng)24小時(shí)，純檢合格后采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，同時(shí)按菌液體積的0.4%加入甲醛溶液37^滅活24小時(shí)，滅活后調(diào)整菌液濃度至lxlOIQCFU/mL，接種于血液瓊脂和TSA平板，5%C02、37°C培養(yǎng)48h，無(wú)菌生長(zhǎng)者用于制備疫苗；(3)、將黃芪多糖配成濃度為30mg/ml的溶液；(4)、將鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液按1:l的比例混合均勻即得到本發(fā)明。實(shí)施例2步驟(1)、(2)與實(shí)施例l相同；(3)、將黃芪多糖配成濃度為20mg/ml的溶液；(4)、將鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液按1:l的比例混合均勻；(5)、在上述混合液中加入混合液總體積的0.01%的硫柳汞。下面對(duì)本發(fā)明所用材料和方法以及免疫效果實(shí)驗(yàn)作進(jìn)一步說(shuō)明1材料與方法1.1材料1.1.1菌種I型RA菌株分離自武漢郊區(qū)某肉鴨場(chǎng)，鑒定后凍干保存。1.1.2培養(yǎng)基胰酶大豆瓊脂(TrypticSoyAgar，TSA)和胰酶大豆肉湯(TrypticSoyBroth,TSB)分別為Difco、Bacto產(chǎn)品，使用時(shí)力口10%小牛血清。1.1.3佐劑原料黃芪多糖提取物購(gòu)自安徽致和堂藥業(yè)有限公司，純度為75%。l丄4試驗(yàn)動(dòng)物1日齡櫻桃谷鴨，購(gòu)自武漢天綠農(nóng)業(yè)科技有限公司，自由采食。1.2疫苗制備1.2.1種子液制備I型RA菌株用TSA平板復(fù)蘇后接種于TSB中，37"C搖振培養(yǎng)1824h，取培養(yǎng)液接種于TSA和血液瓊脂平板進(jìn)行純度檢查合格后作為種子液，(C保存，使用期不超過(guò)5d。1.2.2菌液制備將種子液按培養(yǎng)液體積的5%接種到TSB中，37。C通氣搖振培養(yǎng)24h。純檢合格后采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，同時(shí)按菌液體積的0.40/。加入甲醛溶液37。C滅活24h。滅活后調(diào)整菌液濃度至lx1010CFU/mL，接種于血液瓊脂和TSA平板，5%C02、37。C培養(yǎng)48h，無(wú)菌生長(zhǎng)者用于制備疫苗。1.2.3APS佐劑制備及配苗取APS配制成所需濃度溶液，115。C滅菌15min后置4'C保存?zhèn)溆谩缁罹号c佐劑按等體積混合，同時(shí)按總體積的0.01%加入硫柳汞，制成棕色混懸液，即為鴨傳染性漿膜炎黃芪多糖滅活疫苗。1.2.4疫苗的無(wú)菌及安全檢查疫苗分別接種于TSA、TSB、血液瓊脂及厭氧肉肝湯，37。C培養(yǎng)57d，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。30只5日齡健康未免疫櫻桃谷鴨，隨機(jī)分為3組，n=10，分別于頸部皮下注射疫苗0.5、1.0、2.0mL/只，觀察7d。2疫苗的免疫效果檢驗(yàn)2.1攻毒菌量的測(cè)定I型RA強(qiáng)毒株經(jīng)復(fù)蘇、增菌后分別調(diào)整濃度至2xl(T、2xl09、2xl08、2xl07、2xl0l2xl05CFU/mL;取70只15日齡健康未免疫鴨隨機(jī)分為7組(n=10)，分別對(duì)應(yīng)上述6個(gè)攻毒劑量和1個(gè)對(duì)照組(生理鹽水)進(jìn)行攻毒，0.5mL/只，腿部肌肉注射，觀察7d，將導(dǎo)致全組試驗(yàn)鴨死亡的最小攻毒劑量定為攻毒劑量。2.2最佳免疫劑量的篩選50只5日齡健康未免疫鴨，隨機(jī)分為5組(n=10)，對(duì)應(yīng)4個(gè)免疫劑量(0.2、0.3、0.5、l.OmL/只)和1個(gè)對(duì)照組(生理鹽水)，頸部皮下注射。免疫后15d按照1.3.1測(cè)定結(jié)果進(jìn)行攻毒，觀察10d。2.3免疫接種及攻毒保護(hù)試驗(yàn)100只5日齡健康未免疫鴨，隨機(jī)分為兩大組，免疫組和對(duì)照組，每組又分為5小組(n=10)，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)攻毒時(shí)間點(diǎn)免疫后3、7、10、14和21d。疫苗組按1.3.2篩選的最佳免疫劑量注射疫苗，對(duì)照組注射生理鹽水，然后在相應(yīng)的時(shí)間按照1.3.1測(cè)定結(jié)果進(jìn)行攻毒，腿部肌肉注射，觀察7d。2.4免疫后血清抗體效價(jià)檢測(cè)50只健康未免疫雛鴨，隨機(jī)分為5組(n=10)，分別對(duì)應(yīng)5個(gè)采樣時(shí)間(免疫后3、7、10、14和21d)，全部于5日齡注射疫苗，然后在相應(yīng)的時(shí)間頸靜脈采血，采用瓊脂擴(kuò)散方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，結(jié)果用log2表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.5進(jìn)行分析。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1疫苗的無(wú)菌及安全檢査制備的疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢查，無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)；5日齡雛鴨頸部皮下接種0.5、1.0、2.0mL疫苗(n=10)，均未見(jiàn)異常反應(yīng)。3.2攻毒菌量測(cè)定表1顯示，導(dǎo)致整組全部死亡的最小攻毒劑量為2xl08CFU/mL、0.5mL/只，該劑量即為1型RA強(qiáng)毒的攻毒劑量。表l1型RA強(qiáng)毒攻毒劑量測(cè)定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.3最佳免疫劑量篩選試驗(yàn)鴨按0.2、0.3、0.5、1.0mL/只劑量免疫后攻毒保護(hù)率分別為90%、100%、100%和100%，對(duì)照組無(wú)一存活，表明該疫苗的最佳免疫劑量為0.3mL/只，見(jiàn)表2。表2I型RA黃芪多糖滅活疫苗最佳免疫劑量篩選結(jié)果組別免疫劑量試驗(yàn)鴨數(shù)存活鴨數(shù)保護(hù)率(mL/只)(只)(只)(%)10.21088020.3io1010030.5101010041.01010100對(duì)照0.510003.4免疫接種及攻毒保護(hù)試驗(yàn)由表3可見(jiàn)，試驗(yàn)鴨接種I型RA黃芪多糖滅活疫苗后3、7、10、14和21d的攻毒保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%和90%，平均保護(hù)率達(dá)96%。對(duì)照組注射生理鹽水后同樣進(jìn)行攻毒，3、7、IO和14d后攻毒死亡率為100%,21d的死亡率為80。/。，余下的2只處殺后剖檢可見(jiàn)明顯的纖維素性肝周炎和心包炎。表3I型RA黃芪多糖滅活疫苗接種后的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果免疫后天數(shù)平均保3d7d10d14d21d護(hù)率(％)疫苗組(存活鴨數(shù)/試10/109/1010/1010/109/1096驗(yàn)鴨數(shù))對(duì)照組(存活鴨數(shù)/試0/100/100/100/102/104驗(yàn)鴨數(shù))3.5血清抗體水平檢測(cè)見(jiàn)圖l，免疫后3d即能在試驗(yàn)鴨血清中測(cè)出1型RA的特異性抗體，隨后抗體效價(jià)逐步升高，至免疫后10d達(dá)高峰(PO.01)。本發(fā)明將APS作為免疫佐劑進(jìn)行配苗，成功研制出I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活苗，最佳免疫注射劑量為0.3mL/只，5日齡雛鴨接種后3、7、10、14和21d的攻毒保護(hù)率分別為100%、90%、100%、100%和90%，平均保護(hù)率高達(dá)96%，且安全性高，近7倍劑量免疫未見(jiàn)異常反應(yīng)。該疫苗產(chǎn)生保護(hù)力較早，在免疫后3天保護(hù)率即高達(dá)100%，血清抗體檢測(cè)的結(jié)果卻顯示此時(shí)抗體效價(jià)相當(dāng)?shù)停@可能與免疫后時(shí)間間隔太短，以至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)未能產(chǎn)生足夠的特異性抗體；APS是一種天然的免疫增強(qiáng)劑，能在疫苗本身產(chǎn)生足夠保護(hù)以前，提升整體的免疫水平，尤其是非特異性免疫水平，使機(jī)體不受強(qiáng)毒進(jìn)攻的影響。權(quán)利要求1、一種I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，它由作為疫苗的鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和作為佐劑的黃芪多糖溶液混合而成。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，其中鴨疫里氏桿菌RA-l滅活菌液濃度為lxl(^CFU/ml，黃芪多糖溶液濃度為20-50mg/ml。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，其中鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液按1:l的比例混合。4、根據(jù)權(quán)利要求1至3的任意一種所述的I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，其中黃芪多糖溶液濃度為30mg/ml。5、根據(jù)權(quán)利要求1至3的任意一種所述的I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，其中所述的混合液中加入了混合液總體積的O.Ol%的硫柳汞。6、一種I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗的制備方法，它包括以下步驟(1)、將鴨疫里氏桿菌RA-1菌株用TSA平板復(fù)蘇后接種于TSB中，37。C搖振培養(yǎng)1824h，取培養(yǎng)液接種于TSA和血液瓊脂平板進(jìn)行純度檢查合格后作為種子液，4"C保存；(2)、將種子液按培養(yǎng)液體積的5n/。接種到TSB中，37"C通氣搖振培養(yǎng)24小時(shí)，純檢合格后采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，同時(shí)按菌液體積的0.4。/。加入甲醛溶液37'C滅活24小時(shí)，滅活后調(diào)整菌液濃度至lxl01QCFU/mL，接種于血液瓊脂和TSA平板，5%C02、37°C培養(yǎng)48h，無(wú)菌生長(zhǎng)者用于制備疫苗；(3)、將黃芪多糖配成濃度為20-50mg/ml的溶液；(4)、將鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液混合均勻即得到本發(fā)明。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗的制備方法，其中鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和黃芪多糖溶液混合液中加入了混合液總體積的0.01%的硫柳汞。8、一種疫苗佐劑，該疫苗佐劑為黃芪多糖溶液。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗佐劑，其中黃芪多糖溶液濃度為30mg/ml。全文摘要本發(fā)明涉及一種疫苗免疫佐劑和疫苗，具體地說(shuō)是一種黃芪多糖佐劑及其在I型鴨疫里氏桿菌滅活疫苗中的應(yīng)用。該疫苗佐劑為黃芪多糖溶液，黃芪多糖溶液濃度為30mg/ml。本發(fā)明I型鴨疫里氏桿菌黃芪多糖滅活疫苗，它由作為疫苗的鴨疫里氏桿菌RA-1滅活菌液和作為佐劑的黃芪多糖溶液混合而成。本發(fā)明提高了傳統(tǒng)滅活苗的免疫效果，有效地防控鴨傳染性漿膜炎，也為新型免疫佐劑的研究提供依據(jù)。本發(fā)明疫苗具有良好的安全性和免疫原性，能有效預(yù)防鴨傳染性漿膜炎的發(fā)生。文檔編號(hào)A61K39/39GK101401935SQ20081019763公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月13日優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日發(fā)明者娟華,吳建英,周木清,宮時(shí)玉,童偉文,金爾光,錢運(yùn)國(guó),橙陳,潔陳申請(qǐng)人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所