專利名稱：：一種新型安全的jy免疫佐劑系統(tǒng)的組方及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新型安全的JY免疫佐劑系統(tǒng)的組方及其應(yīng)用，屬于具有針對(duì)性預(yù)防性和治療性疫苗制劑領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：l.全球疫苗的研究開(kāi)發(fā)情況經(jīng)典疫苗的定義是"針對(duì)傳染病疾病產(chǎn)生免疫力的滅活或減毒病原體"，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，現(xiàn)代新型疫苗的定義遠(yuǎn)遠(yuǎn)擴(kuò)充"采用病原體或與病原體相關(guān)的，或與疾病(如癌癥)相關(guān)的靶蛋白(多肽、肽)、多糖或核酸，以一種或多種成份，直接或通過(guò)一定的載體，進(jìn)入機(jī)體后能產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的"。所以，疫苗不僅是預(yù)防和控制傳染病的主要手段，還是治療癌癥，代謝病等多種疾病的生物制劑。疫苗的用途愈來(lái)愈擴(kuò)展到多個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域(表1-3)。表1對(duì)人類健康能造成嚴(yán)重危害的傳染病病原體與疫苗預(yù)防情況_性傳播性病原:是否已經(jīng)有批準(zhǔn)的疫苗艾滋病病毒人乳頭瘤病毒單純皰疹病毒沙眼衣原體淋球菌密螺旋體(梅毒)呼吸道病原流感病毒呼吸道合胞病毒副流感病毒人偏肺炎病毒結(jié)核桿菌嗜血性流感桿菌B型肺炎鏈球菌A屬鏈球菌肺炎衣原體腦膜炎球菌A,C,Y，W-135腦膜炎球菌BHUMAN麗腦DEFICIENCYVIRUS(HIV)HUMANPAPILLOMAVIRUS(HPV)HERPESSIMPLEXVIRUS(HSV)服滯湖蘊(yùn)￡/麗INFLUENZAVIRUS.RESPIRATORYSYNCYTIALVIRUS(RSV)PARAINFLUENZAVIRUSHUMANMETAPNE腦VI駆(HMPV)ST^/womff層〃廢謹(jǐn)G麗PASTREPTOCOCCI涯盧鵬/W層flViMMENINGOCOCCUSA,C，YW-135MENINGOCOCCUSB否有否否否否有否否否有有有否否有否B屬鏈球菌_GROUPB5T肥/WOmg_^_注主要根據(jù)KAPERJ，~~證P亂IRANDBUCKLEYM:VACCINEDEVELOPMENT:CENTSTATUSANDFUTURENEEDS,美國(guó)微生物協(xié)會(huì)資料(2005)WWW.PENSAREDESIGN.COM;作者有所刪加.表2由于非人為的("自然界威脅")對(duì)人類健康有嚴(yán)重威脅的傳染病病原體人畜共患病原體—禽流感H5N1病毒INFLUENZAVIRUSH5N1SARS冠狀病毒SEVEREACUTERESPIRATORYSYNDROME(SARS)HENDRA病毒HE證AVIRUSNIPAH病毒NIPAHVIRUS猴出血熱病毒SIMIANHEMORRHAGICFEVERVIRUSEB0LA病毒EBOLAVIRUS4腸道病原體沙門(mén)氏菌傷寒桿菌志賀氏菌病霍亂弧菌大腸桿菌(ETEC,EPEC)幽門(mén)螺桿菌輪狀病毒NORO病毒媒介病原體瘧原蟲(chóng)登革熱病毒曰本乙型腦炎病毒黃熱病病毒.漢坦病毒疏螺旋體血吸蟲(chóng)利什曼原蟲(chóng)鉤蟲(chóng)(多種屬)醫(yī)源性病原(NOSOCOMIALAGENTS):金黃色葡萄狀球菌5T/f/%TI(ar(CZff假單胞菌腸球菌格蘭氏陰性腸道菌SPECIESiWZ啦"SPECIESEHEC,C釘(ETEC,EHEC,EPEC)ROTAVIRUSNO蘭RUSESDENGUEFEVERVIRUSJAPANESEENCEPHALITIS(JE)VIRUSYELLOWFEVER(YF)VIRUSHANTAVIRUSES微艦"5艦微尸冊(cè)冊(cè)ZSTOS鵬SPECIESZ肌細(xì)柳SPECIESHOOKWORM(MULTIPLEGENERA)假絲酵母其它甲，乙型肝炎病毒水痘/帶狀皰疹病毒丙，戊型肝炎病毒巨細(xì)胞病毒狂犬病毒艦卿層必SPECIES柳TEWOmfi"SPECIESGRAMNEGATIVEENTERICBACTERIAC細(xì)/瀏SPECIESHEPATITISA,BZOSTERVIRUSESHEPATITISVIRUSESCYTOMEGALOVIRUSRABIESVIRUSC,E否有否有否否有否否否有有有否否否否否否否否否有有否否有新流行的病原體(EMERGINGAGENTS)志賀氏痢疾桿菌I多抗性傷寒菌多抗性結(jié)核菌朊病毒帶狀皰疹病毒西尼羅河腦炎病毒RIFT山谷熱病毒H3N2和H1N1變異的流感病毒鼠疫桿菌做做""KSSV7E德/MULTI-ANTIBIOTICRESISTANT組麼漢"MULTIPLE-ANTIBIOTICRESISTANTPRIONSHERPESZOSTERVIRUSWESTNILEVIRUSRIFTVALLEYFEVERVIRUSH3N2ANDH1N1VARIANTFLUVIRUSESYERSINIAPESTIS易于發(fā)生意外事故釋放的病源體(AGENTSSUSCEPTIBLETOACCIDENTALRELEASE):H2N2流感病毒INFLUENZAVIRUSH2N2SARS病毒SARS其它病原體抗性的病原體ANTIBIOTICRESISTANTORGANISMS新腸道病毒_NEWENTEROVIRUSES_新反轉(zhuǎn)錄病毒NEWRETROVIRUSES注主要根據(jù)KAPERJ，~~RAPPUOLIRANDBUCKLEYM:VACCINEDEVELOPMENT:CURRENTSTATUSANDFUTURENEEDS,美國(guó)微生物協(xié)會(huì)資料(2005)WWW.PENSAREDESIGN.COM;作者有所刪加.表3生物恐怖者易于釋放的對(duì)人類健康有嚴(yán)重危害的傳染病病原體(重組)天花病毒SMALLPOXVIRUS炭疽桿菌肉毒桿菌毒素BOTULINUMTOXIN(FROMaflS77/層i/餅釘贈(zèng)志賀氏痢疾桿菌l厠做"愿鮮祝7M7土拉菌鼠疫桿菌EBOLA病毒EBOLAVIRUSVENEZUELAN馬腦炎病毒VENEZUELANEQUINEENCEPHALITISVIRUS重組流感病毒ENGINEEREDINFLUENZAVIRUS重組其它病原體OTHERENGINEEREDORGANISMS注主要根據(jù)KAPERJ，RAPPUOLIRANDBUCKLEYM:VACCINEDEVELOPMENT:CURRENTSTATUSANDFUTURENEEDS,美國(guó)微生物協(xié)會(huì)資料(2005)WWW.PENSAREDESIGN.COM,美國(guó)CDC將恐怖分子可能的生物武器分為A，B，C三類作者有所刪加.1.4世界衛(wèi)生組織報(bào)告到2015年將要開(kāi)發(fā)和改進(jìn)的疫苗1.輪狀病毒(Rotavirus)2.人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus)(已經(jīng)上市)3J市炎球菌(Pneumococcus)(改進(jìn)的聯(lián)合或基于蛋白質(zhì)的疫苗)*4.日本乙型腦炎疫苗(JapaneseBenc印halitis)(改進(jìn))*5.腦膜炎球菌(MeningococcusA)(多價(jià)結(jié)合)*6.麻疹(Measles)(氣溶膠)*7.脊髓灰質(zhì)炎(基于Sabin株的滅活疫苗)*8.脊髓灰質(zhì)炎(單價(jià)0PV1型)**9.登革熱**10.A組鏈球菌(GroupAStreptococcus)**11.呼吸道合胞病毒(RSV)**12.痢疾(Shigella)**13.ETEC**14.傷寒(Typhoid)(結(jié)合)**15.西尼羅河熱(WestNileFever)**16.SARS**17.瘧疾**18.DTaP(用2個(gè)P抗原)**19.現(xiàn)有疫苗的新組合**20.預(yù)防流感大流行的疫苗注*已經(jīng)處于開(kāi)發(fā)的晚期**將在2010-2015年批準(zhǔn)上市。根據(jù)WHO資料(2005)這說(shuō)明疫苗的需求愈來(lái)愈迫切，許多疫苗經(jīng)過(guò)數(shù)十年的研究尚不能投放市場(chǎng)，當(dāng)然有諸多原因，除病原體的性質(zhì)等原因外，最重要的是迄今還沒(méi)有適當(dāng)?shù)陌踩行У拿庖咦魟?2.免疫佐劑疫苗免疫佐劑(Immunoadjuvant)的使用極為重要，免疫佐劑的使用與否往往能決定某種疫苗使用的效果。目前正在研究開(kāi)發(fā)的免疫佐劑多種多樣,包括鋁佐劑(AlumAdjuvant),MF59(水包角鳘烯油微乳劑)，Loxoribine，粒狀棒狀桿菌(Corynebacteriumgranulosum)，酪氨酸酶肽(TyrosinaseP印tide)，不完全費(fèi)氏佐齊U(IncompleteFreund，sAdjuvant),GPI-OIOO，CEL-1000，SCV-07,BCG，QS21，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-d-Met，SB-AS02B佐劑，lipopeptideMALP-2，PADRE96510Theramide，CorynebacteriumParvura，TherapeuticCrotoxin，非甲基化的CpG雙核苷酸(CpG0DN)，二硝基苯(Dinitrophenyl)，HERP印tides，Ethylchlorformate，費(fèi)氏佐劑(Freund，sAdjuvant)，破傷風(fēng)類毒素(TetanusToxoid)，HER-2廳IntracellularDomainProtein,CRL1005,Ubenimex，免疫增強(qiáng)劑Ampligen(PolyI:C)，端粒酶540-548肽(Telomerase540-548P印tide)，AS02A，AS04,TLR等。但是，經(jīng)過(guò)世界各國(guó)疫苗審批機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的通用的免疫佐劑仍然僅有使用了數(shù)十年的鋁佐劑，MF59佐劑僅限于流感疫苗使用。因此，急待開(kāi)發(fā)安全通用的免疫佐劑或佐劑系統(tǒng)。3.殼聚糖3.1殼聚糖的結(jié)構(gòu)殼聚糖(Chitosan)的化學(xué)名為(1，4)-2-氨基-2-脫氧-e-D葡聚糖；分子式[C晶3NCa'[C6H,N04]n2n2/(nl+n2)〉60%。殼聚糖又稱為脫乙酰甲殼素(Deacetylatedchitin)、FlonacN、甲殼胺、可溶性甲殼質(zhì)、脫乙酰幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖、可溶性甲殼素、粘性甲殼素等。實(shí)際上，采用脫乙酰甲殼素較為準(zhǔn)確。其脫乙?？梢园ㄈ亢筒糠置撘阴；?，值得注意的是，目前市售品一般都為部分脫乙?；撘阴６?00%的極少見(jiàn)，因此，用(C晶AN)n作分子式是不妥的。殼聚糖由殼質(zhì)(chitin)所產(chǎn)生，它存在于甲殼類的殼中，通過(guò)脫乙酰作用而形成，可有一系列的脫乙酰程度和不同的分子量。殼聚糖的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖l。3.2殼聚糖的生物活性及在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用殼聚糖是一種帶陽(yáng)電荷的線性多糖，它是一種生物粘附物質(zhì)，能夠與鼻上皮細(xì)胞及其粘液層起強(qiáng)烈作用，以保證在被粘膜纖毛清除之前使藥物搬運(yùn)通過(guò)鼻粘膜。此外，證明殼聚糖還可通過(guò)上皮細(xì)胞之間緊密連接處的暫時(shí)開(kāi)放而增加極性藥物細(xì)胞旁路搬運(yùn)的能力。用于鼻腔藥物遞送的常見(jiàn)殼聚糖類型是殼聚糖谷氨酸鹽，其平均分子量250kDa左右，脫乙酰程度為80%以上。殼聚糖鹽是水溶性的(pH6.5)。影響鼻吸收的兩個(gè)主要屏障是搬運(yùn)通過(guò)上皮膜和藥物組方的被粘膜纖毛的快速清除。目前的策略是采用生物粘附鼻腔遞送系統(tǒng)，保證延長(zhǎng)藥物組方與鼻腔吸收部位的接觸時(shí)間，以延遲粘膜纖毛的清除作用。這樣的生物粘附鼻腔遞送系統(tǒng)可以是粉劑和水劑，或水凝膠系統(tǒng)。粉劑可以冷凍干燥或干顆粒^^微球形式，殼聚糖對(duì)此系統(tǒng)最合適。最近開(kāi)發(fā)出生物粘附多糖殼聚糖(Chitosan)，同時(shí)開(kāi)發(fā)了基于此物質(zhì)的一系列遞送系統(tǒng)。chitosans可用于藥物和生物醫(yī)學(xué)工業(yè)，推薦的鹽類是chitosanchloride禾口chitosanglutamate。如上所說(shuō)，Chitosan的作用機(jī)制有2個(gè)方面第一，陽(yáng)離子多聚物可以結(jié)合在鼻上皮細(xì)胞層的粘液的帶陰電荷的唾液酸殘基，從而減慢被鼻腔的清除速度。第二，chitosan可作用于上皮細(xì)胞之間緊密的連接處，chitosan的結(jié)合可引起緊密連接處暫時(shí)開(kāi)放，從而增加極性分子的細(xì)胞旁的搬運(yùn)，使免疫原進(jìn)入粘膜上皮內(nèi)，直接與樹(shù)突狀細(xì)胞相接觸，充分發(fā)揮免疫作用。一般的極性藥物不能很好地通過(guò)鼻粘膜吸收，這些藥物包括低分子的化合物以及生物制品，如多肽和蛋白質(zhì)。溶液或粉劑的分子量在100kD以上的，一定程度脫乙?；腸hitosans可以改進(jìn)多肽藥物的吸收程度，如胰島素、降鈣素、LHRH類似物、生長(zhǎng)激素以及用于鎮(zhèn)疼的非肽的極性化合物。chitosan具有生物降解性、生物粘附性和促滲透作用，且無(wú)毒副作用，可改善生物大分子藥物(基因藥物、疫苗、蛋白類藥物、激素類藥物)口服、鼻用、肺部等多種給藥途徑的吸收，有廣泛的應(yīng)用前景。Kas表明chitosan在牛血清白蛋白(BSA)、氨基酸、抗血栓形成劑(水姬素、抗凝血酶和肝素)、基底成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、白喉毒素、單克隆抗體、胰島素、鮭降鈣素、皋九激素等制劑中己得到廣泛應(yīng)用。Davis在綿羊和人體實(shí)驗(yàn)中研究證明了chitosan可以提高破傷風(fēng)毒素、去氨加壓素、胰島素、亮丙瑞林、降鈣素、甲狀旁腺素(PTH)、縮膽囊素(CCK—8)等多類肺部給藥的生物利用度；IllumL和McNeelaEA采用chitosan在人體試用了幾種疫苗制劑鼻腔給藥，如抗流感、白喉疫苗和嗎啡，能改善免疫應(yīng)答(反映在抗體IgG、IgA滴度)并證明低于0.25%濃度的chitosan，連續(xù)7天給藥對(duì)鼻腔無(wú)損害。3.3殼聚糖的安全性chitosan是人體內(nèi)最為惰性的物質(zhì)，研究者證明〃chitosan具有低毒性，對(duì)此過(guò)敏者極少，有中等度免疫刺激作用"。一項(xiàng)研究甚至將chitosan的毒性與鹽或糖的副作用相提并論。一項(xiàng)在Helsinki進(jìn)行的臨床研究證明人服用后有急性的、直接的降低體重的作用。這一研究及其它研究表明人服用chitosan后不僅體重下降，血壓也下降。研究者將參加試驗(yàn)的志愿者分為二組使用chitosan組和空白組膠囊，結(jié)果表明，空白組有某些惡心和頭疼，而實(shí)驗(yàn)組則無(wú)。另一副作用是服用chitosan后可使糞便變軟，有利便作用。Chitosan還可促進(jìn)礦物質(zhì)和脂溶性維生素的吸收，但無(wú)報(bào)道與此有關(guān)的健康問(wèn)題。早在1995年，HwangD的研究表明，"Chitosan在某些發(fā)達(dá)國(guó)家已批準(zhǔn)作為食物添加劑，某些毒理學(xué)研究證明是無(wú)毒的"(HwangD，D印artmentofFoodScience,UniversityofWisconsin,Madison。JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1995，43(1):33-37)。Chitosan已經(jīng)安全使用了30年。研究還表明，大白鼠每日使用10%chitosan,未見(jiàn)毒性反應(yīng)也無(wú)超敏反應(yīng)。服用維生素C可以增加Chitosan的效果，服用Chitosan不僅對(duì)健康是安全的，對(duì)環(huán)境也安全，利便對(duì)大多數(shù)人是有益的。參考文獻(xiàn)1.Aspden,T丄IliumL.&Skaugrud0.,/尸/wr附.SW.,4,23-31,1996.2.Chandy,T.Sharma,C.P."Chitosan-asabiomaterialbiosurfacetechnologydivision,"SreeChitaTriunalInstituteforMedicalSciencesandTechnology,Poojandrum,India.19903.Chobot，V."Physiotherapeuticaspectsofdiseasesofthecirculatorysystem,"CeskaaSlovenskaFarmacie，Aug44:190-5，19954.DavisSS.Deliveryofpeptideandnon~peptidedrugsthroughtherespiratorytract.J.PharmSciTechToday，1999,U(2):450~456.5.KasHS.Chitosan:properties,preparationsandapplicationtomicroparticulatesystems.jMicro-capsulation,1997,14(6):6896JllumL.,FarrajN.F.&DavisS.S.,戶/zar,wace油'cfl/Am.11,1186-1189,1994.7.P.Artursson,T.Lindmark，S.S.Davis&L.Ilium,/7wnacra"ca/11，1358-1361，1994.8.111umL.Nasaldrugdeliverypossibility,problemandsolutions.JControlledRelease87(2003):187-1989.111umL.Intranasaldeliveryofmorphine.JPharmacolExpTher.2002Apr;301(l):391-400lO.IllumL.Chitosanasanasaldeliverysystem:theeffectofchitosansolutionsoninvitroandinvivomucociliarytransportratesinhumanturbinatesandvolunteers.JPharmSci.1997Apr;86(4):509墨1311.IliumL.Chitosanasanovelnasaldeliverysystemforvaccines.AdvancedDrugDeliveryReviews51(2001)81—9612.McNeelaEA.Intranasali印munizationwithgeneticallydetoxifieddiphtheriatoxininducesTcellresponsesinhumans:enhancementofTh2responsesandtoxin-neutralizingantibodiesbyformulationwithchitosan.Vaccine.2004Feb25;22(8):909-144.人白細(xì)胞介素-2(IL-2)4.1IL-2概況IL-2在歷史上曾采用過(guò)多種名稱胚源性因子(blastogenicfactor，BF);Costimulator;噬伊紅細(xì)胞分化因子(eosinophildifferentiationfactor,EDF);殺傷細(xì)胞輔助因子(killercellhelperfactor,.KHF);淋巴細(xì)胞促有絲分裂因子(lymphocytemitogenicfactor,LMF);條件性淋巴細(xì)胞介質(zhì)(lymphocyte-conditionedmediumfactor，LCMfactor);淋巴細(xì)胞增殖因子(lymphocyteproliferationfactor,LPF);巨噬細(xì)胞激活細(xì)胞毒因子(macrophage-activatingfactorforcytotoxicity,IMAF-CI);空斑形成細(xì)胞增強(qiáng)因子(plaqueformingcellenhancingfactor,PFC-EA);第二細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)因子(secondarycytotoxicT-cellinducingfactor,SCIF);T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T-cellgrowthfactor,TCGF);促進(jìn)T細(xì)胞克隆活性(Tcolony-promotingactivityTCPA);胸腺細(xì)胞分化因子(thymocytedifferentiationfactor,TDF);胸腺細(xì)胞促有絲分裂因子(thymocyteraitogenicfactor,TMF);TGP-3;T細(xì)胞成熟因子(T-cellmaturationfactor,TMF);T細(xì)胞促有絲分裂因子(T-cellmitogenicfactor,TMF);T細(xì)胞替代因子(T-cellr印lacingfactor-3，TRF-3);胸腺細(xì)胞刺激因子(thymocytestimulatingfactor,TSF)。在生理?xiàng)l件下，IL-2是由CD4(+)T細(xì)胞在受促有絲分裂素或異源物刺激后分泌的一種15kD蛋白，它對(duì)維持正常免疫反應(yīng)是必需的；隨著年齡的老化，抗原和促有絲分裂素刺激合成IL-2的能力下降，因而細(xì)胞免疫反應(yīng)能力降低。雖然只有T細(xì)胞分泌IL-2，但它可以刺激所有的類淋巴細(xì)胞，通過(guò)與細(xì)胞表面的特異性IL-2受體的結(jié)合，發(fā)揮促使細(xì)胞增殖和分化的功能。NK細(xì)胞可以組成性地表達(dá)這些受體，而大多數(shù)T和B細(xì)胞的IL-2受體的表達(dá)則依賴于抗原的刺激。IL-2不論對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫，還是原始和再次免疫反應(yīng)都是極為重要的。4.2IL-2的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)IL-2全長(zhǎng)為153個(gè)氨基酸，N端20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。成熟的IL-2分子由133個(gè)氨基酸所組成，分子量為15.4kDa，pl偏堿。它與其它的細(xì)胞素在序列上無(wú)同源性。IL-2分子具有單一二硫鍵，位于Cys58/105，它對(duì)其生物學(xué)活性的發(fā)揮是必需的。IL-2是一種球形蛋白，由4個(gè)主要的兩性a螺旋所組成，后者呈反平行方式排列，其疏水面構(gòu)成一疏水核心。IL-2在3位蘇氨酸有一0糖基化位點(diǎn)。糖基化程度的不同可影響其分子量和電荷。大腸桿菌生產(chǎn)的重組IL-2無(wú)糖基化，但具有天然分子同樣的生物學(xué)活性。糖基化的作用是促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)它的清除。IL-2分子十分穩(wěn)定，耐酸和熱。4.3IL-2的生物學(xué)活性IL-2可以高效刺激同種T細(xì)胞的增殖。人IL-2在同樣濃度下可刺激鼠T細(xì)胞的增殖，但鼠IL-2刺激人T細(xì)胞的能力低得多，約低60-170倍。IL-2是所有T細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)因子。它是抗原非特異性的T細(xì)胞增殖因子，對(duì)靜止細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞周期的增殖，致使激活T淋巴細(xì)胞的克隆擴(kuò)增。IL-2也促進(jìn)己激活的B細(xì)胞的增殖。IL-2擴(kuò)增LAK細(xì)胞(lymphokine-activatedkillercells)。在體內(nèi)和體外，在無(wú)任何抗原的情況下，IL-2可以選擇性地剌激NK細(xì)胞，NK細(xì)胞被認(rèn)為是對(duì)細(xì)胞內(nèi)微生物特別是病毒感染的免疫細(xì)胞。在有抗原刺激下，使T、B細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免。IL-2同時(shí)可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的分泌能力，如上所述激活和釋放多種細(xì)胞素，包括IFN-y，GM-CSF禾t!TNF-a、e，轉(zhuǎn)而刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，分泌IL-1，IL-6、IL-8、TNF-a等。由此可見(jiàn)，IL-2在細(xì)胞免疫反應(yīng)中起中心作用，選擇性地缺損IL-2可以導(dǎo)致嚴(yán)重的綜合免疫缺損癥(SCID)。目前重組人白細(xì)胞介素-l(rhIL-2)已經(jīng)被我國(guó)SFDA，美國(guó)FDA，歐共體及世界上許多國(guó)家藥審機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)上市治療黑色素瘤，腎癌等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明將帶有正電荷的多醣與帶有負(fù)電荷的、具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))所組成的復(fù)方，即JY佐劑系統(tǒng)，用于預(yù)防性疫苗和治療性疫苗的粘膜免疫(鼻腔，陰道，肛門(mén)，口咽，舌下)和系統(tǒng)免疫(肌肉注射，皮下注射，皮內(nèi)注射等)，來(lái)提高疫苗的免疫效果或提高肽或蛋白質(zhì)藥物的藥物利用度。JY佐劑系統(tǒng)的
發(fā)明內(nèi)容如下1.帶有正電荷的多醣和具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子雖均有報(bào)道，它們均有一定的免疫佐劑作用，但是我們的發(fā)明在于這兩者具有強(qiáng)烈的協(xié)同作用，可以大幅度刺激和提高機(jī)體的免疫應(yīng)答。帶有正電荷的多醣，包括不同脫乙?；潭鹊臍ぞ厶呛推渌鼛д姾傻亩圊狈肿?；具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子包括天然的，重組的，修飾過(guò)的白細(xì)胞介素-2,I型干擾素cda、b、c、d、e，cc2a、b、c，pia、lb，干擾素Y，干擾素-S,干擾素-K,干擾素-X1、2、3，干擾素ffl，干擾素-T，干擾素-s，Limitin等，GM-CSF，G-CSF，M-CSG，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，TLRX,各類胸腺肽，以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的其它細(xì)胞因子。2.JY佐劑系統(tǒng)的合理組方一種帶有正電荷的多醣，一種帶有負(fù)電荷的、具有剌激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，一種或多種免疫抗原，包括滅活或減毒的病原體，一種保護(hù)蛋白質(zhì)不易被降解的蛋白酶抑制劑，一種穩(wěn)定pH的緩沖系統(tǒng)，以合理的劑量比例配合成組方。3.合理組方的JY佐劑系統(tǒng)對(duì)粘膜組織無(wú)明顯的刺激作用；其安全性符合藥物的要求。4.合理組方的JY佐劑系統(tǒng)具有普遍性和通用性可以改進(jìn)目前已經(jīng)使用的疫苗的效果，及提高新疫苗的免疫應(yīng)答或提高JY佐劑系統(tǒng)中的肽或蛋白質(zhì)藥物的藥物利用度。JY佐劑系統(tǒng)粘膜疫苗作用機(jī)制如圖2所示。圖l:甲殼素、殼聚糖、纖維素結(jié)構(gòu)圖圖2:JY佐劑系統(tǒng)粘膜免疫作用機(jī)制圖3:對(duì)照組鼻腔前庭部鱗狀上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖4:給藥組鼻腔前庭部鱗狀上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖5:對(duì)照組鼻腔嗅部嗅上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖6:實(shí)驗(yàn)組鼻腔嗅部嗅上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖7:對(duì)照組鼻腔呼吸部纖毛狀上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖8:實(shí)驗(yàn)組鼻腔呼吸部纖毛狀上皮組織，未見(jiàn)異常。HE染色，40X10圖9:給藥組鼻腔鼻中隔呼吸部纖毛狀上皮組織內(nèi)淋巴細(xì)胞灶性浸潤(rùn)，HE染色，40X10圖10:不同濃度殼聚糖對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物:n=30;血凝素含量4.5ug/株/劑，IL-2:20萬(wàn)IU/ml)圖11:不同濃度殼聚糖對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體的陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物:n=30;血凝素含量4.5ug/株/劑，IL-2:7.5萬(wàn)IU/ml)圖12:不同濃度IL-2(萬(wàn)單位/ml)對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物n=30;血凝素含量4.5ug/株/劑，殼聚糖:0.5%)圖13:不同濃度IL-2(萬(wàn)單位/ml)對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物n=30;血凝素含量4.5ug/株/劑，殼聚糖:O.1%)圖14:加與木加0.P/。人白蛋白對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物:『30，血凝素含量:4.5ug/株/劑，殼聚糖:O.1%，IL-2:20萬(wàn)單位/毫升)圖15:加與不加0.1%人白蛋白對(duì)三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫后血清HI抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(每組動(dòng)物:『30,血凝素含量:4.5ug/株/劑，殼聚糖:O.1%，IL-2:7.5萬(wàn)單位/毫升)圖16:三價(jià)滅活流感疫苗鼻腔免疫程序?qū)ρ錒I抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率的影響(疫苗組成75000單位/ml含量的IL-2、0.1%殼聚糖加全病毒流感疫苗；其中l(wèi):l次免疫；2:2次免疫(0，3天)；3:3次免疫(0，3，7天);4:2次免疫(0，7天))圖17:流感鼻腔接種不同類別疫苗免疫小鼠前、后血清抗體增加倍數(shù)(1:流感全病毒疫苗加IL-2及殼聚糖；2:流感全病毒疫苗加殼聚糖；3:流感全病毒疫苗加IL_2;4:流感全病毒疫苗；5:殼聚糖加IL-2:6:IL-2加PBS;7:不免疫的陰性對(duì)照)圖18:鼻腔接種不同類別疫苗免疫小鼠前、后血清抗體GMT(1:流感全病毒疫苗加IL-2及殼聚糖；2:流感全病毒疫苗加殼聚糖；3:流感全病毒疫苗加IL-2;4:流感全病毒疫苗；5:殼聚糖加IL-2:6:IL-2加PBS;7:不免疫的陰性對(duì)照)圖19:流感全病毒鼻腔噴霧疫苗免疫小鼠后不同時(shí)間血清HI抗體與對(duì)照組相比增長(zhǎng)倍數(shù)比較(h免疫后21天采血；2:免疫后28天采血；3:免疫后35天采血；對(duì)照組HI滴度為〈2.5)圖20:流感全病毒鼻腔噴霧疫苗免疫小鼠后不同時(shí)間血清HI抗體GMT比較(1:免疫后21天采血；2:免疫后28天采血；3:免疫后35天采血；對(duì)照組HI滴度為<2.5)圖21:流感全病毒鼻腔噴霧滅活疫苗免疫小鼠平均血清中和滴度(每組10只小鼠)具體實(shí)施例方式實(shí)施方案l:鼻腔噴霧或口咽噴霧疫苗/JY佐劑系統(tǒng)通用組方每毫升含一種或多種免疫原:根據(jù)不同免疫原實(shí)際劑量不同殼聚糖(或其它帶正電荷的多醣)1-10mgIL-2(或其他具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子)5-50萬(wàn)國(guó)際單位EDTA:O.05-2.Omg磷酸氫二鈉(十二水)2.52mg磷酸二氫鈉(二水)2.02mg氯化鈉7mgpH為6.0-6.5實(shí)施方案2:陰道噴霧疫苗/JY佐劑系統(tǒng)通用組方每毫升含一種或多種免疫原,如HPV16和HPV18VLP等:根據(jù)不同免疫原實(shí)際劑量不同殼聚糖(或其它帶正電荷的多醣)1-10mgIL-2(或其他具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子)5-50萬(wàn)國(guó)際單位干擾素ot:100-500萬(wàn)國(guó)際單位EDTA:O.05-2.Omg磷酸氫二鈉(十二水)2.52mg磷酸二氫鈉(二水)2.02mg氯化鈉7mgpH為4.0-4.5實(shí)施方案3:肌肉或皮下注射疫苗/JY佐劑系統(tǒng)通用組方每毫升含一種或多種免疫原,如HPV16和HPV18VLP等:根據(jù)不同免疫原實(shí)際劑量不同殼聚糖(或其它帶正電荷的多醣)1-10mgIL-2(或其他具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子)5-50萬(wàn)國(guó)際單位EDTA:O.05-2.Omg磷酸氫二鈉(十二水)2.52mg磷酸二氫鈉(二水)2.02mg氯化鈉7mgpH為6.5-7.0實(shí)施方案4:鼻腔噴霧三價(jià)流感病毒滅活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)的安全性和效果4.1JY佐劑系統(tǒng)安全性試驗(yàn)4.1.1JY佐劑系統(tǒng)的異常毒性試驗(yàn)通過(guò)鼻腔噴霧的方法對(duì)小白鼠、豚鼠進(jìn)行了異常毒性的反應(yīng)。共分11組，其中，l組為無(wú)JY佐劑系統(tǒng)疫苗組；2-11組為不同組方JY佐劑系統(tǒng)；IL-2:5-40萬(wàn)IU/ml;殼聚糖0.5-4.0mg/ml的相組合。每只小白鼠鼻腔噴霧2支疫苗，豚鼠每只鼻腔噴霧20只疫苗(濃縮后噴霧)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JY佐劑疫苗系統(tǒng)對(duì)小鼠和豚鼠不產(chǎn)生異常毒性反應(yīng)，有很好的安全性。表4毒性實(shí)驗(yàn)分組<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4丄2.JY佐劑疫苗系統(tǒng)對(duì)大白鼠鼻粘膜剌激試驗(yàn)流感全病毒鼻腔噴霧滅活疫苗鼻腔滴入給予Wistar大鼠，每天給藥1次，0.1/鼻腔/次，連續(xù)7天，另設(shè)PBS對(duì)照組，每組6只，末次給藥后24小時(shí)活殺動(dòng)物，取給藥局部黏膜進(jìn)行病理學(xué)檢查。試驗(yàn)期間，對(duì)照組和供試品組動(dòng)物一般觀察指標(biāo)未見(jiàn)明顯異常，鼻腔前庭及鼻孔周圍無(wú)紅腫、潰爛反應(yīng)，組織病理學(xué)檢查動(dòng)物的給藥局部未見(jiàn)明顯損傷。結(jié)果附圖3-9。結(jié)果表明，JY佐劑系統(tǒng)疫苗反復(fù)滴鼻的鼻腔黏膜刺激試驗(yàn)為陰性。4.2.鼻腔噴霧三價(jià)流感病毒滅活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)的免疫效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鼻腔噴霧疫苗的效果與同等的注射疫苗的免疫效果相當(dāng)，但使用方便,依從性好，副反應(yīng)低，老年人和兒童均可使用。結(jié)果見(jiàn)附圖10-21和表5。表5流感鼻腔全病毒滅活疫苗與常規(guī)注射滅活疫苗兩種途徑免疫小鼠后抗體結(jié)果比較<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(試驗(yàn)噴霧疫苗本所研制；噴鼻對(duì)照組PBS加IL-2及殼聚糖；常規(guī)注射疫苗長(zhǎng)生公司生產(chǎn)的全病毒注射流感疫苗；注射對(duì)照組注射用生理鹽水)實(shí)施方案5:鼻腔噴霧麻疹/風(fēng)疹減毒活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)5丄鼻腔噴霧麻疹減毒活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)20人免疫后比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異(P〈0.05)。ELISA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。表6鼻腔噴霧麻疹減毒活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)的人群免疫效果_組別免前與免后21天平均P/N值的差數(shù)免前與免后28天平均P/N值的差數(shù)對(duì)照組(4).1.34^5.2.鼻腔噴霧麻風(fēng)疹減毒活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)20人免疫后比較免前與免后21天和28天平均P/N值的差數(shù)，兩組有顯著差異。血清血凝抑制滴度平均增加倍數(shù)結(jié)果見(jiàn)表7。表7鼻腔噴霧風(fēng)疹減毒活疫苗/JY佐劑系統(tǒng)的人群免疫效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.一種由帶有正電荷的多醣與帶有負(fù)電荷的具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))所組成的復(fù)方，即JY佐劑系統(tǒng)，用于提高預(yù)防性疫苗和治療性疫苗的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫的效果以及提高肽或蛋白質(zhì)藥物的藥物利用度；2.上述1所述的一種帶有正電荷的多醣是指不同脫乙?；潭鹊臍ぞ厶呛推渌鼛д姾傻亩圊狈肿?；3.上述l所述的帶有負(fù)電荷的具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))是指包括天然的或重組的或修飾過(guò)的白細(xì)胞介素-2，I型干擾素ocla，b，c，d，e，ot2a，b，c，(31a，lb，干擾素Y,干擾素-S，干擾素-K干擾素-人l，2，3，干擾素co，干擾素-T,干擾素-s，Limitin等，GM-CSF，G-CSF，M-CSG，干細(xì)胞生長(zhǎng)因子，TLRx,各類胸腺肽以及具有免疫調(diào)節(jié)作用的其它細(xì)胞因子；4.上述1所述的預(yù)防性疫苗是指接種該疫苗可以預(yù)防多種傳染病或其它疾病的生物制劑；5.上述1所述的治療性疫苗是指接種該疫苗可以治療癌癥或其它疾病的生物制劑；6.上述1所述的粘膜免疫是指通過(guò)鼻腔，陰道，肛門(mén)，口咽，舌下等粘膜途徑接種疫苗產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫；7.上述l所述的系統(tǒng)免疫是指通過(guò)肌肉注射，皮下注射，皮內(nèi)注射等途徑接種疫苗產(chǎn)生的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，包括體液免疫和細(xì)胞免疫；8.上述1所述的JY佐劑系統(tǒng)是指一種帶有正電荷的多醣，一種具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，一種或多種免疫抗原，包括滅活或減毒的病原體，一種保護(hù)蛋白質(zhì)不易被降解的蛋白酶抑制劑，一種穩(wěn)定pH的緩沖系統(tǒng)；以合理的劑量比例配合成組方；9.合理組方的JY佐劑系統(tǒng)對(duì)粘膜組織無(wú)明顯的刺激作用，其安全性符合藥物的要求；10.合理組方的JY佐劑系統(tǒng)具有普遍性和通用性，可以改進(jìn)目前巳經(jīng)使用的疫苗的效果，及提高新疫苗的免疫應(yīng)答或提高JY佐劑系統(tǒng)中的肽或蛋白質(zhì)藥物的藥物利用度。全文摘要本發(fā)明涉及一種新型安全的JY免疫佐劑系統(tǒng)的組方及其應(yīng)用，屬于具有針對(duì)性預(yù)防性和治療性疫苗制劑領(lǐng)域。本發(fā)明將帶有正電荷的多醣與帶有負(fù)陰電荷的，具有刺激免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子(蛋白質(zhì))所組成的復(fù)方，即JY佐劑系統(tǒng)，用于預(yù)防性疫苗和治療性疫苗的粘膜免疫和系統(tǒng)免疫，以期提高疫苗的免疫效果。合理組方的JY佐劑系統(tǒng)對(duì)粘膜組織無(wú)明顯的刺激作用，其安全性符合藥物的要求。合理組方的JY佐劑系統(tǒng)具有普遍性和通用性，可以改進(jìn)目前已經(jīng)使用的疫苗的效果，及提高新疫苗的免疫應(yīng)答或提高JY佐劑系統(tǒng)中的肽或蛋白質(zhì)藥物的藥物利用度。文檔編號(hào)A61K39/39GK101347616SQ20071010752公開(kāi)日2009年1月21日申請(qǐng)日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2007年5月18日發(fā)明者侯云德,吳建華,張麗蘭,張利萍,段招軍,舒躍龍,靜趙,鄭麗舒申請(qǐng)人:北京金迪克生物技術(shù)研究所;北京遠(yuǎn)策藥業(yè)有限責(zé)任公司