專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種注射用灰樹(shù)花β-葡聚糖凍干粉的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用灰樹(shù)花菌絲體提取分離出的P-葡聚糖制成的注射用凍干粉及制備方法，屬醫(yī)藥制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射和抑制腫瘤等特點(diǎn)。
背景技術(shù)：
：灰樹(shù)花(&7'/o7a是擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱，非褶菌目，多孔菌屬中的大型真菌，又名貝葉多孔菌(尸0J，0777S/7W^OWS)、栗子蘑、千佛菌、重菇等，日本稱(chēng)之為舞茸(niaitake)，為名貴藥食兩用真菌。主要分布在亞熱帶至溫帶森林中，外觀灰白色，其子實(shí)體中富含氨基酸、多糖以及微量元素等在內(nèi)的多種營(yíng)養(yǎng)成份。1984年0hno等在"AntitumoractivityandstructuralcharacterizationofGlucansextractedfromculturedfruitbodiesofGrifolarondosa.ChemicalandPharmaceuticalBulletin,1984，32(3):1142-1151"中首次報(bào)道了灰樹(shù)花多糖具有抗腫瘤活性以來(lái)，各國(guó)對(duì)灰樹(shù)花多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及保健功能的研究已逐步展開(kāi)，其對(duì)人體生理功能良好的調(diào)節(jié)作用也逐漸被人們認(rèn)識(shí)。傳統(tǒng)的生產(chǎn)方法為固體栽培，利用液體發(fā)酵方法可以大規(guī)模獲得灰樹(shù)花菌絲體。研究表明，灰樹(shù)花菌絲體中含有多種不同結(jié)構(gòu)的多糖，如a構(gòu)型的多糖和3構(gòu)型的多糖。其中3-葡聚糖具有廣泛的藥理活性，其免疫調(diào)節(jié)活性、抑制腫瘤活性和抗輻射活性尤其突出。此外還具有抗人免疫缺陷病毒(HIV)以及各種肝炎病毒，降低血糖，改善睡眠和調(diào)節(jié)血脂代謝等活性。目前，以灰樹(shù)花及灰樹(shù)花多糖為原料的保健品已風(fēng)靡日本和美國(guó)，已上市的產(chǎn)品主要有日本的MAITEX系列產(chǎn)品、美國(guó)的GRIFR0N、MAITAKE系列產(chǎn)品及我國(guó)的保力生膠囊、栗蘑膠囊等。以上產(chǎn)品所用主要原料多是從固體栽培的子實(shí)體中提取的粗多糖，該類(lèi)產(chǎn)品存在生物降解嚴(yán)重，生物利用度低，口服效果差的缺點(diǎn)。而利用灰樹(shù)花菌絲體可生產(chǎn)高純度葡聚糖，利用純化的灰樹(shù)花P-葡聚糖生產(chǎn)注射用e-葡聚糖凍干粉針制劑尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。灰樹(shù)花多糖的提取多通過(guò)水提取獲得水溶多糖，但存在得率低，a構(gòu)型的多糖和P構(gòu)型的多糖不易分離的缺點(diǎn)，本發(fā)明則先用乙醇和水作為溶劑去除菌絲體中的小分子物質(zhì)和雜多糖，再利用堿提取出制劑所需的P-葡聚糖。
發(fā)明內(nèi)容.-本發(fā)明的目的是提供一種注射用灰樹(shù)花0-葡聚糖凍干粉以及制備方法?；覙?shù)花P-葡聚糖凍干粉能夠有效保持3-葡聚糖的特有結(jié)構(gòu)和藥理活性，體內(nèi)吸收快，并能克服現(xiàn)有技術(shù)所制備產(chǎn)品存在生物降解嚴(yán)重，生物利用度低，口服效果差的缺點(diǎn)。本發(fā)明涉及一種注射用灰樹(shù)花3-葡聚糖凍干粉制劑，其主要原料為灰樹(shù)花3-葡聚糖。用作制劑原料的灰樹(shù)花P-葡聚糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)式如附圖I所示。從圖中可知，該多糖的單糖組成均為葡萄糖，主鏈的葡萄糖殘基以J3-1，6-糖苷鍵連接，支鏈的葡萄糖殘基以3-1,3-糖苷鍵連接，支鏈長(zhǎng)度為2個(gè)葡萄糖殘基，分支度約二分之一。該P(yáng)-葡聚糖的分子量范圍為50，000250,000道爾頓，分子量分布寬度小于3.0。該葡聚糖為具有一定分子量范圍的單一組分，該組分分子無(wú)論分子量大小，均具有相同的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及一種注射用灰樹(shù)花3-葡聚糖凍干粉制劑的制備方法，其特征是以灰樹(shù)花P-葡聚糖為主要原料，加入賦形劑，經(jīng)濃配、稀配、過(guò)濾、除菌、分裝，在-4(TC3(TC的范圍內(nèi)，連續(xù)冷凍干燥2838小時(shí)，軋蓋、封裝制成。本發(fā)明的制劑產(chǎn)品有效成分結(jié)構(gòu)獨(dú)特，制劑劑型新穎，具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射和抑制腫瘤活性。該制劑產(chǎn)品制備工藝簡(jiǎn)單，容易操作，所用的原料來(lái)源豐富。制劑有效成分的結(jié)構(gòu)和藥理活性保持良好，生物利用度高。具體實(shí)施例方式取灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體100g，加入80%的乙醇300ml，室溫?cái)嚢?h，4000r/min離心。取沉淀加入去離子水300ml，加熱至微沸，攪拌提取2h，6000r/min離心，重復(fù)提取2次。取沉淀加入4。/。的NaOH200ml，室溫?cái)嚢杼崛h，6000r/min離心，沉淀中再加入4%的NaOH200ml，6(TC提取3h,6000r/min離心。熱堿重復(fù)提取2次，合并上清液。取上述熱堿提取的上清液，緩慢加入冰乙酸至ph值為7，此時(shí)有大量沉淀產(chǎn)生，6000r/min離心。取上清液，用截流分子量為10000Dalton的超濾膜濃縮并脫鹽。濃縮至100ml時(shí)，在濃縮液中加入4倍體積95%的乙醇，此時(shí)有大量多糖析出。6000r/min離心，收集濾餅。將該濾餅重新溶于300ral去離子水，6000r/min離心后，取上清液上10000Dalton的超濾膜濃縮，再用4倍體積95%的乙醇析出多糖。此過(guò)程重復(fù)2次。對(duì)最后析出的多糖溶于50ml去離子水，離心后，將上清液冷凍干燥，即為灰樹(shù)花0-葡聚糖原料。用上述方法提取時(shí)，該P(yáng)-葡聚糖的得率為1.1%。對(duì)上述原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析證明，其結(jié)構(gòu)如附圖l所示，為帶有P-1.3-分支的e-1.6-葡聚糖。用硫酸苯酚法測(cè)定其多糖含量為95.2%，用HPLC法測(cè)定，其含量為96.5%。取灰樹(shù)花葡聚糖原料2g，加入1000ml注射用水，充分溶漲3小時(shí)，再加入甘露醇200g，加熱攪拌使充分溶解，加注射用水至2000ml，攪拌均勻，按藥液體積的O.1%加入針用活性炭，攪拌吸附30分鐘，過(guò)濾脫炭。檢驗(yàn)合格后，用0.22um的濾膜精濾除菌，按2ml/支的量分裝到1000支5ml的西林瓶中。在-4(TC的溫度下冷凍4小時(shí)，在-40°C-5'C的溫度范圍內(nèi)冷凍干燥15小時(shí)，在-5卩30"的溫度范圍內(nèi)冷凍干燥15小時(shí)。完成凍干后，軋蓋，檢驗(yàn)包裝。該制劑產(chǎn)品含有效成分灰樹(shù)花葡聚糖2mg/支。本實(shí)施例中，P-葡聚糖溶漲所用的時(shí)間可以是0.54小時(shí)，甘露醇用量可以是100200g，針用活性炭用量可以是藥液體積的0.1%1%，注射用水總量為4002000ml，冷凍干燥的時(shí)間為2838小時(shí)。用本發(fā)明的制劑按現(xiàn)有方法進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)、抗輻射和抑制腫瘤活性試驗(yàn)，結(jié)果如表l、表2和表3所示。從表l、表2和表3的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本發(fā)明的制劑產(chǎn)品能明顯提高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，具有細(xì)胞免疫和體液免疫的功能，可提高輻射后肌體的白細(xì)胞數(shù)、存活時(shí)間和存活率，對(duì)實(shí)體瘤S180的抑瘤率可達(dá)65%，具有明顯的提高免疫、抗輻射和抑制腫瘤活性。表l注射用灰樹(shù)花P-葡聚糖凍干粉的免疫調(diào)節(jié)作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2注射用灰樹(shù)花p-葡聚糖凍干粉的抗輻射作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>a:p<0.01，b:p<0.05表3注射用灰樹(shù)花P-葡聚糖凍千粉對(duì)實(shí)體瘤S180的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>附圖是灰樹(shù)花p-葡聚糖的基本結(jié)構(gòu)單元圖。權(quán)利要求1、一種注射用灰樹(shù)花β-葡聚糖凍干粉，其特征是以灰樹(shù)花β-葡聚糖為主要成分制成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的灰樹(shù)花葡聚糖的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)式如附圖I所示。從圖中可知，該多糖的單糖組成均為葡萄糖，主鏈的葡萄糖殘基以1，6-糖苷鍵連接，支鏈的葡萄糖殘基以0-1,3-糖苷鍵連接，支鏈長(zhǎng)度為2個(gè)葡萄糖殘基，分支度約二分之一。該J3-葡聚糖的分子量范圍為50，000250,000道爾頓，分子量分布寬度小于3.0。該葡聚糖為具有一定分子量范圍的單一組分，該組分分子無(wú)論分子量大小，均具有相同的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。3、一種注射用灰樹(shù)花e-葡聚糖凍干粉的制備方法，其特征是以灰樹(shù)花e-葡聚糖為主要原料，加入賦形劑，經(jīng)濃配、稀配、過(guò)濾、除菌、分裝、冷凍干燥、軋蓋、封裝制成。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是e-葡聚糖溶漲所用的時(shí)間為0.54小時(shí)，針用活性炭用量為藥液體積的0.1%1%，冷凍干燥的溫度為-40°C30°C，冷凍干燥時(shí)間為2838小時(shí)。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用灰樹(shù)花菌絲體提取分離出的如附圖I所示結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖制成的注射用凍干粉及制備方法，屬醫(yī)藥制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
。從圖中可知，該多糖的單糖組成均為葡萄糖，主鏈的葡萄糖殘基以β-1，6-糖苷鍵連接，支鏈的葡萄糖殘基以β-1，3-糖苷鍵連接，支鏈長(zhǎng)度為2個(gè)葡萄糖殘基，分支度約二分之一。該β-葡聚糖的分子量范圍為50,000～250,000道爾頓，分子量分布寬度小于3.0。該葡聚糖為具有一定分子量范圍的單一組分，該組分分子無(wú)論分子量大小，均具有相同的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)證明本發(fā)明所提供的注射用凍干粉具有免疫調(diào)節(jié)、抗輻射、抑制腫瘤的特點(diǎn)。文檔編號(hào)A61P37/00GK101297796SQ200710107109公開(kāi)日2008年11月5日申請(qǐng)日期2007年4月30日優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日發(fā)明者艷丁,周傳輝,徐澤平,李春林,楊傳論,蘇亞平,鄭耀光申請(qǐng)人:山東京博控股發(fā)展有限公司