專利名稱：針對人程序性死亡受體pd-1的抗體的制作方法
針對人程序性死亡受體PD-1的抗體
背景技術：
程序性死亡受體1 (PD-I)是首先在激活的T細胞和B細胞上表達的免疫抑制性受 體。該受體與其配體的相互作用在體外和體內一直顯示減弱的τ細胞應答。阻斷PD-I與 其配體之一 PD-Ll間的相互作用顯示提高腫瘤特異性CD8+T細胞的免疫性，因此，可有助于 免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞。PD-I (由基因Pdcdl編碼)為與⑶有關的免疫球蛋白超家族成員。 業(yè)已顯示PD-I當與其配體(PD-L1和/或PD-L2)結合時會負調節(jié)抗原受體信號轉導。業(yè) 已弄清鼠PD-I結構以及小鼠PD-I與人PD-Ll的共結晶結構Chang，X.等，Immunity 20 337-347(2004) ；Lin 等，Proc. Natl. Acad. ki. USA 105 :3011-6 (2008)) PD-1 及類似的家 族成員為I型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的Ig可變型(V-型)結構域和負責結合信 號轉導分子的胞質尾區(qū)。PD-I胞質尾區(qū)含有兩個基于酪氨酸的信號轉導模體ITIM(免疫受 體酪氨酸抑制作用模體)和ITSM(免疫受體酪氨酸轉換作用模體)。在T細胞刺激后，PD-I將酪氨酸磷脂酶SHP-2募集到胞質尾區(qū)內的ITSM模體， 這導致效應分子的去磷酸化作用，效應分子例如有⑶3 ζ、PKC θ和ΖΑΡ70，這些分子參與 CD3T細胞信號轉導級聯。PD-I減量調節(jié)T細胞應答的機理與CTLA-4的相似，但又有所 不同，因為這兩種分子都調控重疊的一系列信號轉導蛋白(Parry等，Mol. Cell Biol. 25 9543-9553.)。Bennett及合作者表明，僅當激活和抑制兩種信號都在同一表面時，PD-I介 導的對T細胞信號轉導的抑制作用才會有效，這表明PD-I信號轉導機制由時間及空間決定 (Bennett F.等，J Immunol. 170 :711-8 (2003)) 研究顯示PD-I在激活的淋巴細胞(外周⑶4+和⑶8+T細胞、B細胞和單核細胞) 上表達，并且還顯示在胸腺發(fā)育期間在⑶4TD8_(雙陰性)T細胞以及NK-T細胞上表達。PD-I配體(PD-L1和PD-L2)為組成型表達，或在多種細胞類型中可被誘導，這些細 胞類型包括非造血組織以及各種腫瘤類型。PD-Ll在B細胞、T細胞、髓樣細胞和樹突狀細 胞(DC)上表達，但也在外周細胞(例如微血管內皮細胞)和非淋巴器官(如心臟、肺等) 中表達。與此相反，PD-L2僅在巨噬細胞和DC中存在。PD-I配體的表達模式提示了 PD-I 在維持外周耐受中的作用，并且用于調節(jié)在外周中的自我活化的T細胞和B細胞應答。兩 種配體都為含有胞外區(qū)域中的IgV-樣和IgC-樣結構域的I型跨膜受體。兩種配體都含有 含未知信號轉導模體的短胞質區(qū)。迄今有大量的研究顯示PD-I與其配體的相互作用在體外及體內導致抑制淋巴細 胞增殖。業(yè)已顯示破壞PD-1/PD-L1相互作用可增加T細胞增殖和細胞因子產生，并阻斷 細胞周期進展。最初對Pdcdl+小鼠的分析并沒有鑒定任何明顯的免疫學表型。然而，老 齡小鼠自發(fā)發(fā)展了與Pdcdl缺陷回交株系不同的自身免疫疾病。這些疾病包括狼瘡樣增殖 性關節(jié)炎(C57BL/6) (Nishimura H.等，ht. Immunol. 10 :1563-1572 (1998))、致死性心肌 病(BALB/c) (Nishimura H.等，Science 291 :319-322(2001))和 I 型糖尿病(NOD) (Wang J. ^,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102 11823-11828 (2005)) 總之，對敲除動物的分析使 得清楚了 PD-I主要起誘導并調節(jié)外周耐受的作用。因此，治療性阻斷PD-I途徑可有助于克服免疫耐受。這種選擇性阻斷可用于治療癌癥或感染以及用于在接種(預防性或治療性) 期間加強免疫性。在文獻中已確定了 PD-I在癌癥中的作用。已知腫瘤微環(huán)境可保護腫瘤細胞免受 有效的免疫破壞。最近顯示PD-Ll在許多小鼠和人腫瘤中表達(并在大多數PD-Ll陰性腫 瘤細胞系中可由IFNy誘導)，并被推定介導免疫逃避(Iwai Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 12293-12297 (2002) ；Strome S. Ε.等，Cancer Res. ,63 :6501-6505(2003) 通過免疫組織化學評估活組織檢查業(yè)已在人的很多原發(fā)性腫瘤中發(fā)現PD-I (在 腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或PD-L1(在腫瘤細胞上)。這樣的組織包括肺癌、肝癌、 卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔 鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤(Brown J. Α.等，J. Immunol. 170 1257-1266 (2003) ；Dong H.等，Nat. Med. 8 :793-800(2002) ；Wintterle 等，Cancer Res. 63 :7462-7467 (2003) ；Strome S. Ε.等，Cancer Res.，63 :6501-6505 (2003)； Thompson R. H.等，Cancer Res. 66 :3381-5 (2006) ；Thompson 等，Clin. Cancer Res. 13 1757-61 (2007) ；Nomi Τ.等，Clin. Cancer Res. 13 :2151-7. (2007)) 更引人注目的是，PD 配體在腫瘤細胞上的表達在多種腫瘤類型中與癌癥患者預后不良相關聯(在Okazaki和 Honjo, Int. Immunol. 19 :813-824(2007)中綜述)。阻斷PD-1/PD-L1的相互作用可導致腫瘤特異性T細胞的免疫性提高，因此，有助 于由免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞。針對這一問題，進行了大量研究。在侵襲性胰腺癌的鼠模型 中，T.Nomi 等(Clin. Cancer Res. 13 :2151-2157(2007))證明 PD-I/PD-Ll 阻斷的治療功 效。給予針對PD-I或PD-Ll的抗體顯著抑制腫瘤生長?？贵w阻斷有效促進了腫瘤活性 CD8+T細胞浸潤到腫瘤中，導致對抗腫瘤效應物(包括IFNY、粒酶B和穿孔蛋白)的增量 調節(jié)。另外，作者表明PD-I阻斷可與化療有效聯合以產生協同作用。在另一項研究中，使 用小鼠鱗狀細胞癌模型，對PD-I或PD-Ll的抗體阻斷顯著抑制腫瘤生長(Tsushima F.等， OralOncol. 42 :268-274 (2006)) 在其它研究中，當與腫瘤特異性CTL克隆共同培養(yǎng)時，用PD-Ll轉染鼠肥大細胞瘤 細胞系導致腫瘤細胞的裂解減少。當加入抗PD-LlmAb時，細胞裂解得以恢復(Iwai Y.等， Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 :12293-12297 (2002)) 研究顯示在小鼠腫瘤模型中體內 阻斷PD1/PD-L1的相互作用提高過繼性T細胞轉移療法的功效(Strome S. Ε.等，Cancer Res. 63 :6501-6505(2003))。PD-I在癌癥治療中所起作用的另外的證據來自用PD-I敲除 小鼠所做的實驗。表達PD-Ll的骨髓瘤細胞僅在野生型動物中生長(導致腫瘤生長并與 動物死亡有關)，而不能在PD-I缺陷型小鼠中生長(Iwai Y. m, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 99 :12293-12297 (2002))。R.M.Wong 等(Int. Immunol. 19 :1223-1234(2007))在對人的研究中顯示，在用疫 苗抗原和來自免疫個體的細胞進行的離體刺激測定中，用全人抗PD-I抗體對PD-I的阻斷 增加了腫瘤特異性CD8+T細胞(CTL)的絕對數量。在相似的研究中，對PD-Ll的抗體阻斷 導致腫瘤相關抗原特異性細胞毒性T細胞的溶細胞活性提高，以及由腫瘤特異性Th細胞產 生的細胞因子增加(Blank C.等，Int. J. Cancer 119:317-327(2006))。相同作者顯示，在 體外當與抗CTLA-4阻斷聯合使用時，PD-Ll阻斷增強了腫瘤特異性T細胞應答?？傊?，PD-1/PD-L1途徑是開發(fā)癌癥治療的抗體療法的被充分證實的靶標?？筆D-I抗體還可用于慢性病毒性感染。在急性病毒性感染后產生的記憶CD8+T細胞具有很高功 能，并構成保護性免疫的重要組分。與此相反，慢性感染的特征常常在于病毒特異性T細胞 應答的不同程度的功能受損(衰竭)，這種缺陷是宿主不能消除持續(xù)的病原體的主要原因。 盡管在感染的早期階段最初產生功能效應T細胞，但它們在慢性感染期間逐漸失去功能。 Barber等(Barber等，Nature 439 :682-687(2006))顯示，用LCMV實驗室毒株感染的小鼠 發(fā)展為導致血液和其它組織中有高水平病毒的慢性感染。這些小鼠最初會產生較強的T細 胞應答，但隨著T細胞衰竭而最終受到感染。作者發(fā)現在慢性感染小鼠中的效應T細胞的 數量和功能下降可通過注射阻斷PD-I和PD-Ll之間相互作用的抗體來逆轉。最近，有研究顯示PD-I在來自HIV感染的個體的T細胞中高度表達，并且受體表 達與T細胞功能損傷和疾病進展相關(Day等，Nature443 :350-4(2006) ；Trautmann L.等， Nat. Med. 12 1198-202 (2006))。在兩項研究中，對配體PD-Ll的阻斷都顯著增加了 HIV特 異性產IFNy細胞的體外增殖。其它研究還涉及PD-I途徑在控制病毒感染中的重要性。PD-I敲除小鼠表現出比 野生型小鼠更好地控制腺病毒感染(Iwai等，J.Exp. Med. 198 :39-50 (2003)) 0同樣，將HBV 特異性T細胞過繼性轉移到HBV轉基因動物中會引發(fā)肝炎(Isogawa M.等，Immunity 23: 53-63(2005))。這些動物的疾病狀態(tài)因肝中的抗原識別和肝細胞增量調節(jié)PD-I而游移不定。發(fā)明簡述本發(fā)明提供結合人和犬PD-I的分離的抗體及抗體片段。在一些實施方案中，所述 抗體或抗體片段阻斷人PD-Ll和人PD-L2與人PD-I的結合。在一些實施方案中，本發(fā)明 PD-I抗體或抗體片段包括選自以下的一個或多個⑶R(抗體互補決定區(qū))SEQ ID NO :9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；在另外的實施方案中，包括以下一個或多個重鏈 CDR =SEQ ID NO 12、13、14、18、19 和 20 和 / 或以下一個或多個輕鏈 CDR :SEQ ID NO :9,10,
11、15、16和17。在一些實施方案中，所述抗體或抗體片段為嵌合抗體、人抗體、人源化抗體 或它們的片段。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含⑶R SEQ ID NO :9、10和11或任何所述序列變體的輕鏈；和/或包含⑶R SEQ ID NO:
12、13和14或任何所述序列變體的重鏈。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包 含包含⑶R SEQ ID NO 15、16和17或任何所述序列變體的輕鏈；和/或包含⑶R SEQ ID NO 18,19和20或任何所述序列變體的重鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 5或其變體；和/或包含SEQ ID NO 6或其變體的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含重鏈可變區(qū)SEQ ID NO 7或其變體；和/或包含SEQ ID NO 8或其變體的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO 30 的20-139位氨基酸殘基或其變體的重鏈可變區(qū)；和/或包含SEQ ID NO 32的20-130位氨 基酸殘基或其變體的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO 30的20-139位氨基酸殘基或其變體的重鏈可變區(qū)；和/或包含SEQ ID NO 33的20-130位氨 基酸殘基或其變體的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含包含SEQ ID NO 30 的20-139位氨基酸殘基或其變體的重鏈可變區(qū)；和/或包含SEQ ID NO 34的20-130位氨 基酸殘基或其變體的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明包括抗體或抗原結合片段，其包含包含具有與SEQ ID NO :30的20-139位氨基酸殘基至少90%同源性的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)；和/或包含具 有與SEQ ID NO :32、33、34的20-130位氨基酸殘基至少90%同源性的氨基酸序列的輕鏈 可變區(qū)。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO :36的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO 37的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO :31的20-466位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO 38的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO 35的20-469位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO 36的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO 35的20-469位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO 37的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明提供結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含 包含SEQ ID NO 35的20-469位氨基酸殘基或其變體的重鏈；和/或包含SEQ ID NO 38的 20-237位氨基酸殘基或其變體的輕鏈。在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段的變體可包含一個、兩個或三個 保守修飾的氨基酸取代。在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段可包含人重鏈恒定區(qū)或其變體， 其中所述變體包含至多20個保守修飾的氨基酸取代；和/或人輕鏈恒定區(qū)或其變體，其中 所述變體包含至多20個保守修飾的氨基酸取代。在一些實施方案中，所述變體可包含至多 10個保守修飾的氨基酸取代。在一些實施方案中，所述變體可包含至多5個保守修飾的氨 基酸取代。在一些實施方案中，所述變體可包含至多3個保守修飾的氨基酸取代。在上述 任何實施方案中，人重鏈恒定區(qū)或其變體可為IgGl或IgG4同種型。在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段可以以約IOOpM或更低的Kd結合 人PD-I。在另一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以約30pM或更低的Kd結合人PD-I。 在另一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以與下述抗體接近相同的Kd結合人PD-I 所述 抗體具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的輕鏈。在另一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以與下述抗體接近相同的Kd結合人PD-I 所述 抗體具有包含SEQ ID NO :31氨基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO :33氨基酸序列的輕鏈。在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段可以以約7. 5X1051/M · s或更快 的kg合結合人PD-1。在一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以約1X1061/M*S或更快的 k結合結合人PD-I。在上述任何實施方案中，抗體或抗體片段可以以約2 X 10_5l/s或更慢的結合 人PD-I。在一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以約2. 7 X 10_5l/s或更慢的I^w結合人 PD-I。在一個實施方案中，抗體或抗體片段可以以約3 X 10_5l/s或更慢的k·結合人PD-I?？捎萌魏斡行У姆椒y量KD、k@和I^w值。在優(yōu)選的實施方案中，用生物發(fā)光干 涉測量法(例如，實施例2中所述的!^rteBio Octet法)來測量解離常數。在其它優(yōu)選的 實施方案中，可用表面等離子共振技術(例如Biacore)或Kinexa來測量解離常數。此外，在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段可以以約InM或更低的IC5tl 阻斷人PD-Ll或人PD-L2與人PD-I的結合?？捎帽绢I域任何已知的方法測量配體結合的 阻斷情況并計算IC5tl，例如下文實施例中所述的FACS或FMAT法。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以約InM或更低的IC5tl阻斷人PD-Ll或人PD-L2與人PD-I的結合。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以約IOOpM或更低的Kd結合人PD-I。在一個實施方案中，抗體或抗體片 段以約30pM或更低的Kd結合人PD-I。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以與下述抗體接近相同的Kd結合人PD-I 所述抗體具有包含SEQ ID NO 31氨基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO :32氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以與下述抗體接近相同的Kd結合人PD-I 所述抗體具有包含SEQ ID NO 31氨基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO :33氨基酸序列的輕鏈。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以約7. 5X1051/M.S或更快的kg纟結合人PD-1。在一個實施方案中，抗 體或抗體片段可以以約1X1061/M · s或更快的k結合結合人PD-1。本發(fā)明還包括與上述任何抗體競爭人PD-I上的結合表位的抗體或抗體片段，所 述抗體或抗體片段以約2X10_5l/s或更慢的I^js結合人PD-1。在一個實施方案中，抗體或 抗體片段可以以約2. 7 X 10_5l/s或更慢的I^w結合人PD-I。在一個實施方案中，抗體或抗 體片段可以以約3X10_5l/s或更慢的結合人PD-I。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段為嵌合抗體或嵌合抗體片段。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段為人抗體或人抗體片段。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段為人源化抗體或人源化抗體片段。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體片段為Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、scFv或F (ab，)2 抗體片段。在一些實施方案中，本發(fā)明抗體片段為雙抗體。本發(fā)明還包括包含上述結合人PD-I的抗體或抗體片段中的任一種的雙特異性抗體。 在一些實施方案中，本發(fā)明分離的抗PD-I抗體及抗體片段增加了 T細胞活化作用 (包括但不限于免疫細胞增殖提高、細胞因子分泌提高或活化標記例如⑶25和/或⑶69的 表達提高)，其根據本領域技術人員所知的典型手段來測量。在上述任何實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體片段可在離體或體內用葡萄球菌腸毒 素B或破傷風類毒素刺激后提高免疫應答?？捎帽绢I域任何技術人員已知的方法測定增加 的免疫激活作用，例如，定量測定免疫細胞(例如T細胞)增殖情況或由免疫細胞產生的細 胞因子(例如由T細胞產生的IFN或IL-2)。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明抗PD-I抗體及抗體片段的核酸。本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO :5-20和30-38(含或不含前導序列)中所示的氨基酸序列中的任何一種的核酸。本 發(fā)明還包括包含SEQ ID NO 1-4和21-29 (含或不含編碼前導序列的核酸)的核酸。本發(fā)明還包括包含編碼本發(fā)明抗體或抗體片段的核酸的細胞及表達載體。此外， 本發(fā)明包括制備本發(fā)明抗體或抗體片段的方法，該方法包括(a)在使所述核酸序列表達 的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼本發(fā)明抗體或抗體片段的核酸的宿主細胞，由此產生包 含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；和(b)從所述宿主細胞或培養(yǎng)基回收多肽。本發(fā)明還包括包含與可藥用載體或稀釋劑組合的本發(fā)明抗體或抗體片段的組合 物。本發(fā)明還包括提高免疫細胞活性的方法，所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明抗 體或抗體片段給予需要治療的對象。在一個實施方案中，所述方法可用于治療癌癥。在另 一個實施方案中，所述方法可用于治療感染或感染性疾病。在又一實施方案中，所述方法可 用作疫苗佐劑。在一些實施方案中，所述方法包括進一步給予第二種治療劑或治療形式。在一些實施方案中，本發(fā)明包括提高免疫細胞活性的方法，所述方法包括將治療 有效量的本發(fā)明抗體或抗體片段給予需要治療的對象，并進一步包括在源自所述對象的樣 品中離體測量T細胞激活情況，其中T細胞活性的提高表明應該繼續(xù)治療。在其它實施方 案中，本發(fā)明包括提高免疫細胞活性的方法，所述方法包括將治療有效量的本發(fā)明抗體或 抗體片段給予需要治療的對象，并進一步包括在源自所述對象的樣品中離體測量T細胞激 活情況，其中T細胞活性提高預示治療成功的可能性。在一個實施方案中，由以下方法測定 T細胞活性的提高(i)測量SEB誘導產生的選自以下的一種或多種細胞因子IL-2、TNF、 IL-17、IFN、GM-CSF、RANTES, IL-6、IL-8、IL-5 和 IL-13 ；或(ii)測量 TT 誘導產生的選自 以下的細胞因子IL-2、TNF、IL-17、IFN、GM-CSF、RANTES、IL-6, IL-8, IL-5 和 IL-13。本發(fā)明還包括本發(fā)明抗PD-I抗體或抗體片段在用于制備提高免疫應答的藥物中 的用途。本發(fā)明還包括本發(fā)明抗PD-I抗體或抗體片段在用于制備治療癌癥的藥物中的用途。本發(fā)明還包括本發(fā)明抗PD-I抗體或抗體片段在用作疫苗佐劑中的用途。本發(fā)明還包括包含與治療劑(例如細菌毒素或放射性毒素)連接的本發(fā)明抗 PD-I抗體或抗體片段的免疫連接物。細胞毒劑的非限制性實例包括泰素(taxol)、細胞 松弛素B(cytochalasin B)、絲裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)和長春新堿 (vincristine)或其它抗代謝物、烷化劑、抗生素和抗有絲分裂藥。
本發(fā)明還包括提高免疫細胞活性或降低免疫細胞下調的方法，所述方法包括讓免 疫細胞與任何一種本發(fā)明抗體或抗體片段接觸。該方法可用于治療癌癥或感染性疾病(例 如慢性病毒性感染)，或可用作預防性或治療性疫苗的佐劑。本發(fā)明還包括提高對抗原的免疫應答的方法，所述方法包括讓免疫細胞與抗原和 抗PD-I抗體或抗體片段接觸，以便提高或加強對抗原的免疫應答。該方法可在體內(在受 治療者中)或離體進行。在一些實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與第二治療劑或治療形式組合。在 一個實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與包括施用重組的細胞因子或分泌的免疫因 子的癌癥治療組合。組合的非限制性實例包括抗PD-I抗體與重組IL-2或重組IFN 2聯合 用于治療黑素瘤或腎細胞癌。重組IL-2增加癌癥患者中的T細胞產生。重組IFN 2在被 治療的患者中不但抑制癌細胞生長，而且還提高癌細胞、抗原呈遞細胞和其它體細胞上的 PD-I的抑制性配體的表達?？筆D-I可與被認為可用于治療癌癥或感染性疾病的其它細胞 因子組合。在一些實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與疫苗組合以預防或治療癌癥或 感染性疾病。作為非限制性實例，抗PD-I可與以下物質組合含有與待治療的癌癥或感染 有關的一種或多種抗原的蛋白質、肽或DNA疫苗或由用所述抗原刺激(pulsed)的樹突細胞 組成的疫苗。另一個實施方案包括抗PD-I與(減弱的)癌細胞或全病毒疫苗的用途。一 個實施方案涉及抗PD-I療法與經工程改造而分泌GM-CSF的全細胞癌癥疫苗組合。在一些實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與被認為是癌癥或感染性疾病中 的護理標準的治療組合。所述組合的基本原理是，由抗PD-I并行提高的免疫活化作用將 誘導或促進對護理治療標準的初始臨床反應、誘導長期的臨床反應和對疾病的長期免疫控 制。在一個實施方案中，用抗PD-I抗體或抗體片段的治療可與化療組合。使用細胞毒 劑的化療將導致癌細胞死亡，由此增加腫瘤抗原的釋放。所述增加腫瘤抗原的有效性可導 致與抗PD-I治療的協同作用。提供的非限制性實例為使用氨烯咪胺(decartazine)或替 莫唑胺(temozolomide)治療黑素瘤和使用吉西他濱(gemcitabine)治療胰腺癌。在一個實施方案中，用抗PD-I抗體或抗體片段治療可與放療組合。放療誘導癌細 胞死亡，并增加用于呈遞和激活免疫細胞的腫瘤抗原的有效性。在另一個實施方案中，用抗PD-I抗體或抗體片段治療可與手術組合以從受治療 者中去除癌細胞。在其它實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與能同PD-I阻斷產生協同作用的 療法組合，所述療法包括用于激素消除(hormoned印rivation)或抑制血管生成的靶向藥 物，或靶向在腫瘤細胞中具有活性的蛋白質的靶向藥物，所有這些均導致腫瘤細胞死亡增 加和免疫刺激性腫瘤抗原的有效性提高。在與抗PD-I抗體或抗體片段聯合的情況下，T細 胞活化作用的提高可導致對癌癥的持久免疫控制。在一些實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段可與用于治療癌癥或感染性疾病的 另一種治療性抗體聯合。提供的非限制性實例為抗PD-I與靶向Herf/neu或靶向EGF受體 的抗體的組合。在另一個非限制性實例中，抗PD-I抗體或抗體片段與靶向VEGF或其受體 的治療組合。在另一個實施方案中，抗PD-I抗體或抗體片段與抗CTLA-4組合。在又一個非限制性實例中，抗PD-I與靶向RSV的抗體組合。附圖
簡述圖IA和IB顯示的實驗結果表明來自雜交瘤上清液的被固定化的抗體能減少用固 定化的抗⑶3和可溶性抗⑶觀刺激的Jurkat E6. 2. 11細胞的IL-2分泌。圖2顯示的實驗結果表明抗人PD-I抗體結合PD-1。圖2A為顯示在蛋白ELISA 中抗PD-I抗體與純化的PD-1/Fc劑量依賴性結合的曲線圖。圖2B為顯示在CELISA中抗 PD-I抗體與在用hPD-Ι轉染的CHO細胞表面上表達的PD-I劑量依賴性結合的曲線圖。圖3顯示的FMAT實驗結果表明抗PD-I抗體與PD-Ll和PD-L2競爭結合用人PD-I 轉染的CHO細胞。圖3A的曲線圖顯示hPD-1.08A和hPD-1.09A對結合PD-Ll的劑量依賴 性抑制，J116的抑制程度較低。圖:3B為顯示劑量依賴性抑制PD-L2的曲線圖。圖4條形圖所顯示的實驗結果表明在抗PD-I、抗PD-Ll或抗CTLA-4抗體存在下 受SEB刺激的健康供者血細胞產生IL-2得到提高。條形顯示在不同供者中IL-2的平均 倍數增加(士SEM)。每一條形里面的數字表示所代表的供者的數目。小鼠(m)IgGl是抗 PD-1.08A(08A)、抗 PD-1.09A(09A)和抗 PD-Ll 的同種型對照。小鼠(m) IgG^i 是抗 CTLA-4 的同種型對照。將各IL-2值與其自己的對照比較，以確定倍數變化(當與只用SEB比較時， IL-2的倍數改變?yōu)?意即IL-2生產增加400% )。無=只有SEB。圖5顯示的實驗結果表明當用回憶抗原破傷風類毒素刺激時抗PD-I抗體促進T 細胞增殖和細胞因子分泌(IL-2和IFN γ )。圖5顯示濃度依賴性IFN γ分泌。圖6為描述由生物發(fā)光干擾測量法(bio-light interferometry)測定的抗PD-1 抗體的和率的曲線圖。對角線表示理論上計算的Kd值?？贵w以遞升次序列在Kd 的右邊。圖7條形圖顯示的實驗結果表明在25ug/ml鼠(09A)或人源化抗PD-1抗體 (h409All、h409A16和h409A17)存在下，受SEB刺激的健康供者血細胞產生IL-2得到提高。 條形顯示在不同供者中IL-2的平均倍數增加(士SEM)。小鼠(m)IgGl是抗PD-1. 09A(09A) 的同種型對照。人(h)IgG4是h409All、h409A16和h409A17抗體的同種型對照。將各IL-2 值與其自己的對照比較，以確定倍數變化。無=只有SEB。發(fā)明詳述
縮寫和定義
在本發(fā)明的發(fā)明詳述和實施例各處中將使用以下縮寫
hPD-1. 08A鼠單克隆抗hPD-1抗體
hPD-1. 09A鼠單克隆抗hPD-Ι抗體
08A-VH分離自hPD-1. 08A雜交瘤 的VH
08A-VK分離自hPD-1. 08A雜交瘤 的VK
09A-VH分離自hPD-1. 09A雜交瘤 的VH
09A-VK分離自hPD-1. 09A雜交^曹的VK
cl09AhPDl. 09A抗體的嵌合IgGl形式
cl09A-VH由與hlgGl恒定區(qū)融合的鼠09A-VH組成的嵌合重鏈
cl09A-VK由與人κ恒定區(qū)融合的鼠09A-VK組成的嵌合輕鏈
109A-H具有零回復突變的人源化IgGl 09A重鏈序列
409A-H具有零FWR回復突變的人源化IgG4-09A重鏈序列
K09A-L-11 含最初具有長11個氨基酸的CDRl的構架的人源化09A- κ序列
K09A-L-16 含最初具有長16個氨基酸的CDRl的構架的人源化09Α- κ序列
K09A-L-17 含最初具有長17個氫基酸的CDRl的構架的人源化09Α- κ序列
h409All包含含有409Α-Η序列的重鏈和含有K09A-L-11序列的輕鏈的09Α抗體的人源化IgG4形式
h409A16包含含409Α-Η序列的重鏈和含K09A-L-16序列的輕鏈的09Α抗體的人源化IgG4形式
h409A17包含含409Α-Η序列的重鏈和含K09A-L-17序列的輕鏈的09Α抗體的人源化IgG4形式
hPD-1人PD-I蛋白
CDR用Kabat編號系統(tǒng)界定的免疫球蛋白可變區(qū)中的互補決定區(qū)
EC50產生50%功效或結合的濃度
ELISA酶聯免疫吸附測定
Fff抗體構架區(qū)將CDR區(qū)排除在外的免疫球蛋白可變區(qū)
HRP辣根過氧化物酶
IL-2白細胞介素2
IFN干擾素
IC50產生50%抑制的濃度
IgG免疫球蛋白G
Kabat由Elvin A Kabat倡導的免疫球蛋白比對及編號系統(tǒng)
mAb單克隆抗體
MES2-(N-嗎啉代)乙磺酸
NHS正常人血清
PCR聚合酶鏈式反應
SAM綿羊抗小鼠(IgG)多克隆抗體
V區(qū)在不同抗體之間序列可變的IgG鏈區(qū)段。其延伸到輕鏈的109位Kabat殘基和1■鏈的第113位殘基。VH免疫球蛋白重鏈可變區(qū)VK免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)“抗體”是指表現所需生物學活性(例如抑制配體與其受體的結合或通過抑制配體 誘導的受體信號轉導)的抗體的任何形式。因此，“抗體”以其最廣泛的意義來使用，并明確 包括但不限于單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體和多特異性抗體(例如雙特 異性抗體)?！翱贵w片段”和“抗體結合片段”意即抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常 包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區(qū)或可變區(qū)(例如一個或多個 CDR)?？贵w片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基于摩爾來表示活性時，抗 體片段保留至少10%的母體結合活性。優(yōu)選地，抗體片段保留至少20^^50^^70^^80%, 90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力?？贵w片段實例包括但不限于Fab,Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(linear antibody)；單鏈抗體分子，例 如sc-Fv、單抗體(技術來自Genmab)；納米抗體(技術來自Domantis)；結構域抗體(技術 來自Ablynx)；和由抗體片段形成的多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述于Holliger 和 Hudson Q005) Nat. Biotechnol. 23 :1126-1136 中。"Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的C0I及可變區(qū)組成。Fab分子的重鏈不能與 另一個重鏈分子形成二硫鍵?！癋e”區(qū)含有包含抗體的ChI和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個 或多個二硫鍵并通過CH3結構域的疏水作用保持在一起。"Fab'片段”含有一條輕鏈和包含Vh結構域和ChI結構域以及ChI和CH2結構域 之間區(qū)域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab'片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以 形成F(ab' )2分子。"F(ab' )2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含ChI和CH2結構域之間的恒定區(qū)的部分 的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab' )2片段由通過兩條重鏈間的二 硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段組成。"Fv區(qū)”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)，但缺少恒定區(qū)。“單鏈Fv抗體”(或“scFv抗體”)是指包含抗體的Vh和\結構域的抗體片段， 其中這些結構域存在于單個多肽鏈中。一般而言，Fv多肽另外在Vh和\結構域之間包 含多肽接頭，該接頭使得scFv能形成用于抗原結合的所需結構。對于scFv綜述，可參見 Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES(單克隆抗體藥理學)，第 113 卷，Rosenburg 禾口 Moore 主編，Springer-Verlag, New York，第 269—315 頁。還參見國 際專利申請公開號WO 88/01649和美國專利第4，946，778號和第5，260，203號?！半p抗體”為具有兩個抗原結合位點的小抗體片段。所述片段包含在相同的多肽 鏈中與輕鏈可變結構域連接的重鏈可變結構域(Vh) 或。通過使用短至 不能在同一鏈的兩個結構域之間配對的接頭，迫使所述結構域與另一條鏈的互補結構域配 對并形成兩個抗原結合位點。雙抗體更全面地闡述于例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和 Holliger 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444-6448 中?！敖Y構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)鏈的具有免疫學功能的免 疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個Vh區(qū)與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體 片段。二價結構域抗體片段的兩個Vh區(qū)可靶向相同或不同抗原。本發(fā)明抗體片段可包含足以使重鏈二聚體化(或多聚體化)的恒定區(qū)部分，所述 重鏈具有降低的二硫鍵合的能力，例如，如本文所述改變了通常參與重鏈間二硫鍵的鉸鏈 半胱氨酸中的至少一個。在另一個實施方案中，抗體片段(例如包含Fc區(qū)的抗體片段) 保留了當以完整抗體存在時通常與Fc區(qū)有關的生物學功能中的至少一種，這些功能例如 FcRn結合、抗體半衰期調節(jié)、ADCC功能和/或補體結合(例如抗體具有對ADCC功能或補體 結合必不可少的糖基化特征)。術語“嵌合”抗體指這樣的抗體以及表現出所需生物學活性的所述抗體的片段其 中部分重鏈和/或輕鏈與來源于特定物種或屬于特定抗體類別或亞類的抗體相應的序列 等同或同源，同時所述鏈的其余部分與來源于另一物種或屬于另一抗體類別或亞類的抗體 相應的序列等同或同源(參見例如美國專利第4，816，567號和Morrison等，1984、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855)。非人類(例如鼠)抗體的“人源化”形式為含有最小限度的來源于非人類免疫球 蛋白序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分為人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體抗體的 高變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和能力的非人類物種(供體抗體)高變區(qū)的殘基置 換，非人類物種例如有小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv 構架區(qū)(FR)殘基被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含不在受體抗體或供體 抗體中存在的殘基。進行這些修飾以進一步改進抗體性能。一般而言，人源化抗體包含至少 一個且通常為兩個可變結構域的幾乎全部，其中全部或幾乎全部超變環(huán)對應于非人類免疫 球蛋白的超變環(huán)，全部或幾乎全部FR區(qū)為人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體還任選 包含至少部分免疫球蛋白(通常為人免疫球蛋白)恒定區(qū)(Fe)。更詳細的資料參見Jones 等，Nature 321 :522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 :323-329(1988)；和 Presta， Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596(1992)。本文所用術語“超變區(qū)”是指負責抗原結合的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包含 以下氨基酸殘基來自序列比對所界定的“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基，例如， 輕鏈可變結構域的M_34(L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)位殘基和重鏈可變結構域的 31-35 (HI)、50-65 (H2)和 95-102 (H3)位殘基，參見 Kabat 等，1991，Sequences of proteins oflmmunological Interest (免疫目的物的蛋白質序列)，第 5 版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.；和/或來自根據結構來界定的“超變 環(huán)”(HVL)的殘基，例如，輕鏈可變結構域的^-32(L1)、50-52(L2)和91-96 (L3)位殘基和 重鏈可變結構域的26-32 (HI), 53-55 (H2)和96-101 (H3)位殘基，參見Chothia和Leskl, 1987，J. Mol. Biol. 196 :901-917. “構架”殘基或“FR”殘基為除本文定義的超變區(qū)殘基之 外的可變結構域殘基?！叭丝贵w”為其氨基酸序列對應于由人產生的抗體的氨基酸序列的抗體，和/或業(yè) 已用任何用于制備本文所示的人抗體的技術制備的抗體。該定義明確排除了包含非人類抗 原結合殘基的人源化抗體?！胺蛛x的”抗體為業(yè)已被鑒定并分離和/或回收自其天然環(huán)境組分的抗體。其天 然環(huán)境的污染組分是會干擾所述抗體的診斷性或治療性應用的物質，可包括酶、激素和其 它蛋白質溶質或非蛋白質溶質。在一些實施方案中，將所述抗體純化到以下程度(1)超過 95%重量的抗體，最優(yōu)選超過99%重量，其由Lowry法測定；( 足以通過用旋杯式測序儀 獲得N-末端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度；或C3)通過在還原或非還原條件 下用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色的SDS-PAGE確定為同質。分離的抗體包括在重組細胞內的原 位的抗體，因為抗體自然環(huán)境中的至少一種組分將不存在。然而，分離的抗體通常由至少一 個純化步驟制備?！胺蛛x的”核酸分子為被鑒定并與至少一種污染性核酸分子(通常在抗體核酸的天 然來源中與其締合)分離的核酸分子。分離的核酸分子不同于其天然存在的形式或環(huán)境。 因此，分離的核酸分子與在其天然細胞中存在的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包 括在如常表達抗體的細胞中所含的核酸分子，例如，所述核酸分子所處的染色體位置不同 于天然細胞的染色體位置。本文所用術語“單克隆抗體”是指從基本上同種抗體群中獲得的抗體，即除了可能少量存在的可能的天然突變體外，構成所述群的各個抗體是一致的。單克隆抗體具有高度 特異性，可針對單個的抗原位點。此外，與通常包括針對多個不同的決定簇(表位)的多 種不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制備物相反，每種單克隆抗體僅針對抗原上的單個決定 簇。修飾語“單克隆”表示從基本上同種抗體群獲得的抗體的特性，不能理解為需要通過任 何特定方法來制備所述抗體。例如，用于本發(fā)明的單克隆抗體可通過由Kohler等(1975， Nature 256:49 首先闡述的雜交瘤方法制備，或可通過重組DNA方法(參見例如美國 專利第4，816，567號)制備?！皢慰寺】贵w”還可用例如Clackson等(1991，Nature352 624-628)和Marks等(1991，J. Mol. Biol. 222 :581-597)所述技術分離自噬菌體抗體文庫。 本文單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體。本文所用術語“免疫細胞”包括具有造血的起源并在免疫應答中起作用的細胞。免 疫細胞包括淋巴細胞，例如B細胞和T細胞；天然殺傷細胞；髓樣細胞，例如單核細胞、巨 噬細胞、嗜曙紅細胞、肥大細胞、嗜堿細胞和粒細胞。本文所用“免疫綴合物”是指與治療性部分綴合的抗PD-I抗體或其片段，所述治 療性部分例如有細菌毒素、胞毒藥物或放射性毒素。可用本領域的有效方法使毒性部分與 本發(fā)明抗體綴合。本文使用以下核酸雙關碼1 =八或6;￥ =(或11;1 =八或(；1( = 6或11;5 = 6 或C ；和W = A或T。本文所用序列“變體”是指在一個或多個氨基酸殘基處不同于所示的序列但保留 所得到的分子的生物學活性的序列?！氨Ｊ匦揎椀淖凅w”或“保守的氨基酸取代”是指本領域技術人員已知的氨基酸 取代，進行這種取代通常不改變所得到的分子的生物學活性。一般而言，本領域技術人員 公認在多肽非必需區(qū)的單個氨基酸取代基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等， Molecular Biology ofthe Gene (基因的分子生物學)，The Benjamin/Cummings Pub. Co., 第2 頁(第四版，1987))。這樣的例示性取代優(yōu)選依照以下所示的取代來進行例示性保守氨基酸取代
權利要求
1.結合人PD-I的分離的抗體或抗體片段，其包含a.至少一個選自以下序列的⑶R:SEQ ID NO :9、10、11、15、16和17或任何所述序列的 變體；和/或b.至少一個選自以下序列的CDR:SEQ ID NO :12、13、14、18、19和20或任何所述序列的變體。
2.權利要求1的抗體或抗體片段，其包含a.輕鏈⑶RSEQ ID NO :9、10和11或任何所述序列的變體；和重鏈⑶R SEQ ID NO: 12,13和14或任何所述序列的變體；或b.輕鏈⑶RSEQ ID N0:15、16和17或任何所述序列的變體；和重鏈⑶R SEQ ID NO: 18、19和20或任何所述序列的變體。
3.權利要求2的抗體或抗體片段，其包含a.包含選自以下的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)i.SEQ ID NO 5或其變體；ii.SEQ ID NO 7 或其變體；iii.SEQ ID NO 30的20-139位氨基酸殘基或其變體；和iv.與SEQID NO 30的20-139位氨基酸殘基具有至少90%同源性的氨基酸序列； 和進一步包含b.包含選自以下的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)i.SEQ ID NO 6或其變體；ii.SEQ ID NO 8 或其變體；iii.SEQ ID NO 32的20-130位氨基酸殘基或其變體；iv.SEQ ID NO :33的20-130位氨基酸殘基或其變體；v.SEQ ID NO 34的20-130位氨基酸殘基或其變體；和vi.與SEQID NO :32、33、34的20-130位氨基酸殘基具有至少90%同源性的氨基酸序列。
4.權利要求1的抗體，所述抗體包含a.包含選自以下的氨基酸序列的重鏈i.SEQ ID NO 31的20-466位氨基酸殘基或其變體；和ii.SEQ ID NO 35的20-469位氨基酸殘基或其變體； 禾口b.包含選自以下的氨基酸序列的輕鏈i.SEQ ID NO 36的20-237位氨基酸殘基或其變體；ii.SEQ ID NO 37的20-237位氨基酸殘基或其變體；和iii.SEQ ID NO 38的20-237位氨基酸殘基或其變體。
5.上述權利要求中任一項的抗體或抗體片段，其中任何所述變體可包含至多3個保守 修飾的氨基酸取代。
6.權利要求1-3中任一項的抗體，所述抗體進一步包含a.人重鏈恒定區(qū)或其變體，其中所述變體包含至多20個保守修飾的氨基酸取代；和/或b.人輕鏈恒定區(qū)或其變體，其中所述變體包含至多20個保守修飾的氨基酸取代。
7.權利要求6的抗體，其中所述人重鏈恒定區(qū)包含Y4或Yl人重鏈恒定區(qū)或其變體， 其中所述變體包含至多20個保守修飾的氨基酸取代。
8.上述權利要求中任一項的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段a.以約IOOpM或更低的Kd結合人PD-I；b.以約30pM或更低的Kd結合人PD-I；c.以與以下抗體接近相同的Kd結合人PD-I所述抗體具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈；d.以與以下抗體接近相同的Kd結合人PD-I所述抗體具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO 33的氨基酸序列的輕鏈；e.以約7.5x1051/M · s或更快的k結合結合人PD-1 ；f.以約IxlO6VM· s或更快的k結合結合人PD-I ；g.以約2X10_51/S或更慢的k·結合人PD-I；h.以約2.7x10-51/s或更慢的結合人PD-I ；i.以約3X10_51/S或更慢的k·結合人PD-I；或j.以約InM或更低的IC5tl阻斷人PD-Ll或人PD-L2與人PD-I的結合。
9.分離的抗體或抗體片段，所述分離的抗體或抗體片段與權利要求1-4中任一項的抗 體競爭結合PD-I上的表位，并且具有以下特性之一a.以約IOOpM或更低的Kd結合人PD-I；b.以約30pM或更低的Kd結合人PD-I；c.以與以下抗體接近相同的Kd結合人PD-I所述抗體具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO 32的氨基酸序列的輕鏈；d.以與以下抗體接近相同的Kd結合人PD-I所述抗體具有包含SEQ ID NO :31的氨基 酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO 33的氨基酸序列的輕鏈；e.以約7.5x1051/M · s或更快的k結合結合人PD-1 ；f.以約IxlO6VM· s或更快的k結合結合人PD-I ；g.以約2X10_51/S或更慢的k·結合人PD-I；h.以約2.7x10-51/s或更慢的結合人PD-I ；i.以約3X10_51/S或更慢的k·結合人PD-I；或j.以約InM或更低的IC5tl阻斷人PD-Ll或人PD-L2與人PD-I的結合。
10.上述權利要求中任一項的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段為a.嵌合抗體或其片段；b.人抗體或其片段；c.人源化抗體或其片段；或d.選自以下的抗體片段Fab、Fab，、Fab，_SH、Fv、scFv、F(ab，)2和雙抗體。
11.上述權利要求中任一項的抗體或抗體片段，其中所述抗體或抗體片段提高T細胞 的激活。
12.編碼權利要求1-7中任一項的抗體或抗體片段的分離的多核苷酸。
13.包含權利要求12的分離的多核苷酸的表達載體。
14.包含權利要求13的表達載體的宿主細胞。
15.制備權利要求1-11中任一項的抗體或抗體片段的方法，所述方法包括a.在能使所述核酸序列表達的條件下于培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求14的宿主細胞，藉此 制備包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽；和b.從所述宿主細胞或培養(yǎng)基中回收多肽。
16.組合物，所述組合物包含與可藥用載體或稀釋劑組合的權利要求1-11中任一項抗 體或抗體片段。
17.提高免疫細胞活性的方法，所述方法包括讓所述免疫細胞與權利要求1-11中任一 項的抗體接觸。
18.提高免疫細胞活性的方法，所述方法包括將治療有效量的權利要求1-11中任一項 的抗體或抗體片段給予需要治療的對象。
19.權利要求18的方法，其中所述方法用于a.治療癌癥；b.治療感染或感染性疾??；或c.作為疫苗佐劑。
20.權利要求18的方法，所述方法進一步包括在來源于所述對象的樣品中離體測量T 細胞活化情況，其中T細胞活性提高表明應該繼續(xù)治療，或預示所述治療將成功的可能性。
21.權利要求20的方法，其中通過以下方法測定T細胞活性的提高a.測量SEB誘導的選自以下的一種或多種細胞因子的產生IL-2、TNFa、IL-17、 IFNy、GM-CSF、RANTES,IL-6、IL-8、IL-5 和 IL-13；或b.測量TT誘導的選自以下的細胞因子的產生IL-2、TNFa、IL-17、IFNy , GM-CSF, RANTES, IL-6、IL-8, IL-5 和 IL-13。
22.權利要求1-11中任一項的抗體或抗體片段在制備用于以下方面的藥物中的用途a.提高免疫細胞活化；b.治療癌癥；或c.治療感染或感染性疾病。
23.權利要求1-11中任一項的抗體或抗體片段用于診斷應用的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了阻斷人程序性死亡受體(hPD-1)與其配體(hPD-L1或hPD-L2)及其可變區(qū)序列結合的抗體。還公開了通過PD-1途徑增加免疫應答活性(或降低下調)的方法。
文檔編號C07K16/28GK102131828SQ200880103544
公開日2011年7月20日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月18日
發(fā)明者G·J·卡文, G·J·杜洛斯, H·范伊寧納姆 申請人:奧根農股份公司