專利名稱：利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法。
背景技術(shù)：
家蠶是一種重要的經(jīng)濟(jì)和模式生物，為我國(guó)社會(huì)主義經(jīng)濟(jì)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)并正在為中國(guó)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展進(jìn)一步做著更大的貢獻(xiàn)。由中國(guó)家蠶基因組計(jì)劃研究小組領(lǐng)導(dǎo)的家蠶基因組框架圖的率先完成，不但確立了我國(guó)家蠶功能基因組研究在國(guó)際上的地位，而且也為蠶絲業(yè)和昆蟲學(xué)科的發(fā)展提供了新的契機(jī)。功能基因組時(shí)期的主要工作包括主要功能基因的鑒定克隆，重要生物學(xué)性狀的分子機(jī)理的闡明，最終實(shí)現(xiàn)重要經(jīng)濟(jì)性狀的人為調(diào)節(jié)和創(chuàng)造。家蠶最重要的性狀是家蠶絲腺能在短時(shí)間高效地大量合成絹絲蛋白。利用家蠶絲腺的這一特點(diǎn)，在絲腺中高效表達(dá)外源蛋白一直是許多蠶學(xué)和生物學(xué)科技工作者追求的目標(biāo)。目前，這項(xiàng)工作主要瓶頸是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突破和轉(zhuǎn)基因蠶中被表達(dá)的外源蛋白在絲心蛋白中的比例含量低。解決這些制約學(xué)科研究發(fā)展的瓶頸，是創(chuàng)造真正實(shí)用的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，拓寬家蠶的應(yīng)用領(lǐng)域，保持蠶絲產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)我國(guó)蠶學(xué)和昆蟲學(xué)科的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展的重要基礎(chǔ)工作。
利用鱗翅目來源的轉(zhuǎn)座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)最初在日本取得成功，但該技術(shù)在我國(guó)一直沒有獲得實(shí)質(zhì)性突破，成為制約我國(guó)該學(xué)科研究發(fā)展的瓶頸。目前，本發(fā)明申請(qǐng)人已經(jīng)建立了系統(tǒng)而完善的家蠶胚胎顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)并取得成功，為本研究的工作開展打下了良好的基礎(chǔ)。最近，在國(guó)外，在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺里生產(chǎn)外源蛋白曾被報(bào)道。然而，由于轉(zhuǎn)基因家蠶繭的主要成分仍然是家蠶本身的蠶絲蛋白，而這些家蠶表達(dá)系統(tǒng)是分別利用家蠶絲心蛋白的兩個(gè)非主要的成分——輕鏈和fibrohexamerin/P25的啟動(dòng)子，故這些家蠶表達(dá)系統(tǒng)不是很有效的外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
普通家蠶繭的主要組成是蠶絲絲心蛋白(fibroin)和絲膠(sericin)，其中絲心蛋白是繭的主要成分，約占繭層重的82％。蠶絲絲心蛋白由家蠶的后部絲腺(PSG)細(xì)胞合成，絲膠由中部絲腺細(xì)胞合成，它們都在中部絲腺聚集，最后經(jīng)過前部絲腺被榨絲后而吐絲結(jié)繭。絲心蛋白由350-kDa的重鏈蛋白(H-chain)，26-kDa的輕鏈蛋白(L-chain)和30-kDafibrohexamerin/P25(fhx)三種蛋白構(gòu)成。這些蛋白在后部絲腺細(xì)胞內(nèi)首先按照一定的比例(H-chain∶L-chain∶fhx＝6∶6∶1)形成絲心蛋白基本單位，然后絲心蛋白基本單位被分泌到腺腔。在絲心蛋白基本單位中重鏈蛋白是最主要的成分，達(dá)92％，而輕鏈蛋白只占約7％，fhx約占1％。最近報(bào)道的在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺里產(chǎn)生外源蛋白都是利用輕鏈蛋白和fhx啟動(dòng)子，這些家蠶表達(dá)系統(tǒng)不能很有效的表達(dá)外源蛋白是由于這兩個(gè)組分本來就是絲心蛋白的兩個(gè)非主要的成分。家蠶絲心蛋白最主要成分——重鏈蛋白啟動(dòng)子的開發(fā)將有助于較大幅度地提高轉(zhuǎn)基因家蠶繭中外源重組蛋白的比例，而且在利用鱗翅目來源的轉(zhuǎn)座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究報(bào)道中，有關(guān)利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法。該方法突破轉(zhuǎn)基因蠶中被表達(dá)的外源蛋白在絲心蛋白中的含量低的難點(diǎn)，首次開發(fā)和利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子，使家蠶絲腺生物反應(yīng)器向人為控制的方向發(fā)展。
本發(fā)明將家蠶胚胎顯微注射技術(shù)，熒光檢測(cè)與分子生物操作技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了一個(gè)在家蠶絲腺中特異高效表達(dá)的家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子，簡(jiǎn)稱為Fib-HP3，長(zhǎng)度為2304bp，其核酸序列是aagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagCATCAGTTCGGTTCCAACTCTCAAGATGAGAGTCAAAACCTTTGTGATCTTGTGCTGCGCTCTGCAGgtgagttaattattttactattatttcagaaggtggccagacgatatcacgggccacctgataataagtggtcgccaaaacgcacagatatcgtaaattgtgccatttgatttgtcacgcccgggggggctacggaataaactacatttatttatttaaaaaatgaaccttagattatgtaacttgtgatttatttgcgtcaaaagtaggcaagatgaatctatgtaaatacctgggcagacttgcaatatcctatttcaccggtaaatcagcattgcaatatgcaatgcatattcaacaatatgtaaaacaattcgtaaagcatcattagaaaatagacgaaagaaattgcataaaattataaccgcattattaatttattatgatatctattaacaattgctattgcctttttttcgcaaattataatcattttcataacctcgaggtagcattctgttacattttaatacattgg
tatgtgattataacacgagctgcccactgagtttctcgccagatcttctcagtgggtcgcgttaccgatcacgtgatagattctatgaagcactgctcttgttagggctagtgttagcaaattctttcaggttgagtctgagagctcacctacccatcggagcgtagctggaataggctaccagctaataggtagggaaaacaaagctcgaaacaagctcaagtaataacaacataatgtgaccataaaatctcgtggtgtatgagatacaattatgtactttcccacaaatgtttacataattagaatgttgttcaacttgcctaacgccccagctagaacattcaattattactattaccactactaaggcagtatgtcctaactcgttccagatcagcgctaacttcgattgaatgtgcgaaatttatagctcaatattttagcacttatcgtattgatttaagaaaaaattgttaacattttgtttcagTATGTCGCTTATACAAATGCAAACATCAATGATTTTGATGAGGACTATTTTGGGAGTGATGTCACTGTCCAAAGTAGTAATACAACAGATGAAATAATTAGAGATGCATCTGGGGCAGTTATCGAAGAACAAATTACAACTAAAAAAATGCAACGGAAAAATAAAAACCATGGAATACTTGGAAAAAATGAAAAAATGATCAAGACGTTCGTTATAACCACGGATTCCGACGGTAACGAGTCCATTGTAGAGGAAGATGTGCTCATGAAGACACTTTCCGATGGTACTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCATATTCTCAGAGCGGGCCATACGTATCAAACAGTGGATACAGCACTCATCAAGGATATACGAGCGATTTCAGC本發(fā)明利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法，依次包括下列步驟(1)載體的構(gòu)建本發(fā)明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉(zhuǎn)座子載體是piggyBac衍生來載體，它是將來自于pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆進(jìn)用BgIII/HpaI酶切并被補(bǔ)平的p3E1.2載體(Cary et al.，1989)，重組pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉(zhuǎn)座子載體是參照Horn& Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭載體采用兩步克隆法構(gòu)建的，首先，復(fù)雜的構(gòu)建都在含有所有可能識(shí)別6個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶和Notl的多克隆位點(diǎn)的pSLfa1180fa克隆穿梭載體中完成，然后，構(gòu)建好的重組pSLfa1180fa克隆穿梭載體用識(shí)別10個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶Ascl和Fsel消化，得到的重組部分最后被克隆進(jìn)pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重組注射載體；啟動(dòng)子元件的PCR擴(kuò)增是用含有家蠶品種p50絲心蛋白基因的細(xì)菌人造染色體(BAC)克隆(下面簡(jiǎn)稱H-chain BAC)為模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是從pBS-A3EGFP質(zhì)粒的中擴(kuò)增得到，具體構(gòu)建如下首先是不同元件片段的獲得絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子3(簡(jiǎn)稱為Fib-H P3)由絲心蛋白重鏈基因5′-上游序列，外顯子1，內(nèi)含子1和外顯子2的5′端非重復(fù)序列組成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物對(duì)從H-chain BAC擴(kuò)增獲得；輕鏈結(jié)合位點(diǎn)(簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)BS)由包含Cys-c20(C-端的倒數(shù)第20個(gè)氨基酸)的絲心蛋白重鏈基因的3′端和包含重鏈基因多聚腺嘌呤化信號(hào)序列的3’端下游序列組成，它是用含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)的LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和含有一個(gè)Sall位點(diǎn)的LBS-r(79359-79335)(5′-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3′)從H-chainBAC擴(kuò)增獲得；EGFP基因是用含有一個(gè)XbaI位點(diǎn)的pEGFP-f(5′-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′)和含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)的pEGFP-r(5′-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)從pBS-A3EGFP質(zhì)粒擴(kuò)增獲得，上面的PCR擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性5分鐘，5個(gè)94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分30秒的循環(huán)，然后是25個(gè)94℃1分鐘，55℃1分鐘；和72℃1分30秒的循環(huán)，接下來是72℃7分鐘和4℃保存；然后是這些擴(kuò)增元件按照下面的方法克隆進(jìn)pSLfa1180fa(下面簡(jiǎn)稱為pSL)穿梭載體①克隆LBS片段進(jìn)pSL穿梭載體獲得pSL-LBS質(zhì)粒；②克隆EGFP片段進(jìn)pSL-LBS質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒；③克隆Fib-H P1片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1質(zhì)粒，而克隆Fib-H P3片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質(zhì)粒；④克隆外顯子2的5′端非重復(fù)序列片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2質(zhì)粒，然后再克隆絲心蛋白重鏈基因5’-上游序列和外顯子1的片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2質(zhì)粒而獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H 2質(zhì)粒；最后，把獲得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質(zhì)粒的重組部分克隆進(jìn)pBac[3XP3-DsRedaf]載體，獲得重組注射載體pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)轉(zhuǎn)基因家蠶的獲得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作輔助質(zhì)粒產(chǎn)生轉(zhuǎn)位酶，用QIAGEN Plasmid Midikit(Qiagen)試劑盒純化注射質(zhì)粒DNA，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法進(jìn)行家蠶胚胎顯微注射，注射后的蠶卵用無(wú)毒膠封口，在25℃條件下，進(jìn)行催青直到孵化，飼養(yǎng)孵化出來的蟻蠶，將當(dāng)代(G0)的蠶蛾進(jìn)行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體；最后，獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體飼養(yǎng)、傳代，并進(jìn)行表達(dá)的檢測(cè)和表達(dá)效率的測(cè)量。
啟動(dòng)子特異表達(dá)的檢測(cè)和表達(dá)效率的測(cè)量可用如下方法啟動(dòng)子注射載體獲得的轉(zhuǎn)基因家蠶用不同的探針進(jìn)行Southern blot和Northern blot分析以及用EGFP抗體進(jìn)行Western blot分析。實(shí)驗(yàn)中的所有核酸探針都是用地高辛標(biāo)記試劑(DIG-High Prime reagent(Boehringer Mannheim，U.S.))進(jìn)行標(biāo)記。①Southern blot分析用酚-氯仿法從G1代的蛾或G2代的第7天的蛹抽提轉(zhuǎn)基因家蠶基因組DNA。6ug的基因組DNA用Spe I內(nèi)切酶完全消化，電泳后轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Hybond N+，AmershamBioscience)上，固定后進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。探針是EGFP片段；②Northern blot分析取～100mg的五齡第四天家蠶后部絲腺用1mL的TRIzolreagent(Invitrogen，U.S.)抽提后部絲腺總RNA。用10μg的總RNA電泳并按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行Northern blot分析(Sambrook et al.，1989)。探針用EGFP探針和絲心蛋白重鏈3’端探針。絲心蛋白重鏈3’端片段是用LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和Fib-H 3′-endR(5′-ttttttAAATGCTCTCATTTATTAACG-3′)引物對(duì)從pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質(zhì)粒擴(kuò)增獲得。實(shí)驗(yàn)可估計(jì)外源基因EGFP的相對(duì)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量；③Western blot分析去掉亂絲的繭碎片溶解于60％的LiSCN溶液中(按照約0.025g的繭片/1ml of 60％LiSCN比例進(jìn)行溶解和處理)，然后離心取上清液，并用Tris緩沖液(10mM Tris-HCl pH＝7.0，2％SDS，5％β-巰基乙醇)稀釋5倍后作為實(shí)驗(yàn)分析的樣品。這些樣品與5×加樣緩沖液混合并在100℃變性3分鐘后上樣于10％SDS-聚丙稀酰胺膠并進(jìn)行Western blot分析。Western blot分析的抗體是GFP Epitope Tag(Affinity BioReagents，U.S.)，GFP量的估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品是利用PA1-980A Neutralizing Peptide(Affinity BioReagents，U.S.)。實(shí)驗(yàn)可估計(jì)轉(zhuǎn)基因蠶繭中EGFP的含量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，首次開發(fā)和利用了家蠶重鏈蛋白啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)基因家蠶大量表達(dá)外源表達(dá)蛋白，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用輕鏈蛋白和fhx啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺里產(chǎn)生外源蛋白的含量，利用輕鏈蛋白和fhx啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺里產(chǎn)生外源蛋白的含量，它們分別為0.84％和0.1％，而本方法外源蛋白的表達(dá)含量可達(dá)到16％左右。解決這一瓶頸，創(chuàng)造真正實(shí)用的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，可拓寬家蠶的應(yīng)用領(lǐng)域，保持蠶絲產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，促進(jìn)我國(guó)蠶學(xué)和昆蟲學(xué)科的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展。利用該項(xiàng)技術(shù)流程，通過大量飼養(yǎng)目的轉(zhuǎn)基因家蠶，就可以簡(jiǎn)單地收獲轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭而大量獲得目的外源蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例選擇家蠶品種用上述方法構(gòu)建家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子和目的外源蛋白基因的注射載體，并進(jìn)一步獲得目的轉(zhuǎn)基因家蠶，經(jīng)用上述方法測(cè)定，在轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭中外源蛋白的表達(dá)含量為16％。
權(quán)利要求
1.一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于依次包括下列步驟(1)載體的構(gòu)建本發(fā)明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉(zhuǎn)座子載體是piggyBac衍生來載體，它是將來自于pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆進(jìn)用BglII/HpaI酶切并被補(bǔ)平的p3E1.2載體(Cary et al.，1989)，重組pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉(zhuǎn)座子載體是參照Horn & Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭載體采用兩步克隆法構(gòu)建的，首先，復(fù)雜的構(gòu)建都在含有所有可能識(shí)別6個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶和NotI的多克隆位點(diǎn)的pSLfa1180fa克隆穿梭載體中完成，然后，構(gòu)建好的重組pSLfa1180fa克隆穿梭載體用識(shí)別10個(gè)堿基的限制性內(nèi)切酶AscI和FseI消化，得到的重組部分最后被克隆進(jìn)pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重組注射載體；啟動(dòng)子元件的PCR擴(kuò)增是用含有家蠶品種p50絲心蛋白基因的細(xì)菌人造染色體(BAC)克隆(下面簡(jiǎn)稱H-chain BAC)為模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是從pBS-A3EGFP質(zhì)粒的中擴(kuò)增得到，具體構(gòu)建如下首先是不同元件片段的獲得絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子3(簡(jiǎn)稱為Fib-H P3)由絲心蛋白重鏈基因5’-上游序列，外顯子1，內(nèi)含子1和外顯子2的5’端非重復(fù)序列組成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物對(duì)從H-chain BAC擴(kuò)增獲得；輕鏈結(jié)合位點(diǎn)(簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)BS)由包含Cys-c20(C-端的倒數(shù)第20個(gè)氨基酸)的絲心蛋白重鏈基因的3’端和包含重鏈基因多聚腺嘌呤化信號(hào)序列的3’端下游序列組成，它是用含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)的LBS-f(79027-79043)(5’-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3’)和含有一個(gè)SalI位點(diǎn)的LBS-r(79359-79335)(5’-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3’)從H-chainBAC擴(kuò)增獲得；EGFP基因是用含有一個(gè)XbaI位點(diǎn)的pEGFP-f(5’-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3’)和含有一個(gè)BamHI位點(diǎn)的pEGFP-r(5’-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’)從pBS-A3EGFP質(zhì)粒擴(kuò)增獲得，上面的PCR擴(kuò)增條件是94℃預(yù)變性5分鐘，5個(gè)94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分30秒的循環(huán)，然后是25個(gè)94℃1分鐘，55℃1分鐘；和72℃1分30秒的循環(huán)，接下來是72℃7分鐘和4℃保存；然后是這些擴(kuò)增元件按照下面的方法克隆進(jìn)pSLfa1180fa(下面簡(jiǎn)稱為pSL)穿梭載體①克隆LBS片段進(jìn)pSL穿梭載體獲得pSL-LBS質(zhì)粒；②克隆EGFP片段進(jìn)pSL-LBS質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒；③克隆Fib-H P1片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1質(zhì)粒，而克隆Fib-H P3片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質(zhì)粒；④克隆外顯子2的5’端非重復(fù)序列片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP質(zhì)粒獲得pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2質(zhì)粒，然后再克隆絲心蛋白重鏈基因5’-上游序列和外顯子1的片段進(jìn)pSL-LBS-EGFP+5’-Exon2質(zhì)粒而獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H2質(zhì)粒；最后，把獲得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質(zhì)粒的重組部分克隆進(jìn)pBac[3XP3-DsRedaf]載體，獲得重組注射載體pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)轉(zhuǎn)基因家蠶的獲得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作輔助質(zhì)粒產(chǎn)生轉(zhuǎn)位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit(Qiagen)試劑盒純化注射質(zhì)粒DNA，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法進(jìn)行家蠶胚胎顯微注射，注射后的蠶卵用無(wú)毒膠封口，在25℃條件下，進(jìn)行催青直到孵化，飼養(yǎng)孵化出來的蟻蠶，將當(dāng)代(G0)的蠶蛾進(jìn)行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體；最后，獲得的轉(zhuǎn)基因個(gè)體飼養(yǎng)、傳代，并進(jìn)行表達(dá)的檢測(cè)和表達(dá)效率的測(cè)量。
全文摘要
一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子大量表達(dá)外源蛋白的方法，突破轉(zhuǎn)基因蠶中被表達(dá)的外源蛋白在絲心蛋白中的含量低的難點(diǎn)，首次開發(fā)和利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)基因家蠶大量表達(dá)外源表達(dá)蛋白，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用輕鏈蛋白和fhx啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因家蠶絲腺里產(chǎn)生外源蛋白的含量，達(dá)到16％左右。解決這一瓶頸，創(chuàng)造真正實(shí)用的家蠶絲腺生物反應(yīng)器，可拓寬家蠶的應(yīng)用領(lǐng)域，保持蠶絲產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。利用該方法，通過大量飼養(yǎng)目的轉(zhuǎn)基因家蠶，可以簡(jiǎn)單地收獲轉(zhuǎn)基因家蠶蠶繭而大量獲得目的外源蛋白。
文檔編號(hào)A01K67/00GK1912116SQ20061005444
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者趙愛春, 夏慶友, 魯成, 向仲懷 申請(qǐng)人:西南大學(xué)