一種水稻胚乳特異表達啟動子pOsPYL8的制作方法
【技術領域】
[0001]
本發(fā)明涉及植物分子生物學和植物基因工程領域。具體地說，本發(fā)明提供了一種水稻胚乳特異表達啟動子P0SPYL8。
【背景技術】
[0002]
水稻是我國乃至世界上最主要的糧食作物之一。胚乳是稻米的食用部分，其主要成分為淀粉，也包含微量脂肪、蛋白質、纖維素等，為人類提供營養(yǎng)和能量物質。植物生物技術和基因工程的發(fā)展，使得人們能夠定向調控胚乳中淀粉、脂肪或蛋白質等相關合成、代謝基因的表達，實現稻米品質及營養(yǎng)價值的改良。
[0003]在水稻胚乳定向遺傳改良中，利用胚乳特異表達啟動子驅動相關基因的超表達或抑制是一種理想的策略。這一策略在高效調控胚乳組織中相關基因表達的同時，由于胚乳特異表達啟動子結構在其它組織部位不表達，因此，一般不影響其它組織部位的生長發(fā)育。目前，國內外研究工作者已分離了一些水稻胚乳特異性啟動子，但這類啟動子的數量依然有限，特別是胚乳特異性高效表達啟動子更是甚少，難以完全滿足植物基因工程多方面應用的需求。隨著水稻基因組測序完成、各種基因表達譜數據的公開，借助公共數據庫可以篩選到在水稻胚乳組織中特異性高效表達的功能基因。這些胚乳特異表達功能基因的上游DNA序列，為分離鑒定胚乳特異表達的啟動子提供了基礎。
[0004]水稻胚乳特異強表達啟動子的分離對利用基因工程改良水稻稻米品質以及利用水稻胚乳作為生物反應器表達相關重要蛋白產物具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005]
本發(fā)明的目的是提供一種水稻胚乳特異表達啟動子及其應用。該啟動子來源于水稻基因的上游啟動子區(qū)，具有驅動目的基因在水稻胚乳中特異表達的功能。
[0006]本發(fā)明所提供的水稻胚乳特異性啟動子，為下述DNA序列之一:
(1)具有SEQID N0.1所示的DNA序列；
(2)在SEQID N0.1所示序列的基礎上對序列中間片段或堿基進行插入、缺失或替換改變所產生的，并且具有胚乳特異表達啟動子活性的DNA序列；
(3)在SEQID N0.1所示序列的基礎上進行Y -或者:V _缺失所產生的，并且具有胚乳特異表達啟動子活性的DNA序列。
本發(fā)明通過對水稻根、莖、葉、小穗、種子等不同組織部位進行表達譜分析，明確了水稻脫落酸(abscisic acid, ΑΒΑ)受體蛋白基因在種子中特異性高效表達；本發(fā)明進一步通過轉基因水稻植株報告基因表達分析，明確了啟動子可控制目的基因在水稻胚乳組織中特異表達，其在水稻根、莖、葉、小穗、胚等組織部位不表達。本發(fā)明提供的pOsPYL嗚動子可應用于基因工程改良稻米胚乳相關性狀以及在水稻胚乳中特異性表達重組蛋白。
【附圖說明】
[0007]圖1，基因在根、莖、葉、小穗、種子等水稻不同組織部位中的表達模式，采用定量Real-time PCR分析，以水稻Mi識/iii/?基因為內參。
[0008]圖2，植物表達載體pC-p0sPYL8-GUS示意圖，其中，A為T-DNA線性結構示意圖；B為 pC-p0sPYL8-GUS 載體圖。
[0009]圖3，轉pC-p0sPYL8_GUS結構的水稻轉基因植株不同組織部位的⑶S組織化學檢測結果，其中，WT為非轉基因對照植株；p35S-gus為轉化了組成型啟動子P35S的報告基因結構的轉基因植株；pPYL8-gus為轉化了 p0sPYL8驅動的⑶S報告基因結構的轉基因植株。
【具體實施方式】
[0010]
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。以下實施例用于說明本發(fā)明但不限制本發(fā)明的范圍。實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0011]實施例1水稻表達譜數據庫檢索基因表達模式
植物/??基因家族是一類脫落酸(abscisic acid，ABA)受體蛋白基因，它編碼的蛋白與ΑΒΑ結合并介導ΑΒΑ信號途徑。不同植物PYLs基因可在植物不同組織部位中組成性表達或特異性表達。在水稻中，基因家族存在12個同源基因。通過分析水稻表達譜數據庫(http://ricexpr0.dna.affrc.g0.jp/)發(fā)現，OsPYLS (genbank 序列號:0s06g0527800)只在水稻胚乳中高效表達，而在其它組織器官中基本不表達。
[0012]實施例2熒光定量PCR (Real-time PCR)分析水稻不同組織部位中的表達模式
利用Trizol (Invitrogen公司)分別提取水稻品種日本晴的根、莖、葉、小穗、種子等不同組織部位的總RNA，實驗步驟參照Invitrogen公司的Trizol使用說明書；Trizol法獲得總RNA后，利用DNasel (TAKARA公司)在37 °(:條件下消化所提取的總RNA，以充分降解樣品中可能存在的基因組DNA ;隨后，進一步以氣仿/異戊醇(24:1)抽提純化總RNA。
[0013]取不同組織部位提取的總RNA (?1 yg)，用Thermo#K1622試劑盒(Thermo公司)反轉錄成單鏈的cDNA (具體步驟參照Thermo#K1622試劑盒說明書)；以所獲得的cDNA為模板，對基因在水稻不同組織部位中的表達模式進行熒光定量PCR分析。其中，OsPYLS^ 因的特異引物為 q0sPYL8 +:5 ' -CGGGAGGAAGAGATGGAGTA-3 '，q0sPYL84?: 5' -GGCTGATCAAACCTCCTCAC-3';內參基因 Mi識的引物序列為 qUb1-F:5' -cagcagcggctcatctt-3'，qUb1-R:5' -gcttcttgggcttggtgta-3'。分析平臺是ABI 公司的 PRISMTM 7500 Sequence Detector。采用 TAKARA 公司的 SYBR Premix Ex TaqTMCTliRNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa Code:DDR820)進行PCR擴增及檢測，反應體系為20 μ L:SYBR Premix Ex TaqTM (2X ) 10 yL，引物 F和 R (10 μ M)各 0.4 μ L，R0X ReferenceDye II (50X)0.4 μ L, cDNA 1 μ L，ddH20補足體積至20 yL。每個樣本進行三次生物學重復。實施例結果表明，基因水稻種子中高效表達，而在根、莖、葉、小穗等其它組織中幾乎檢測不到表達(附圖1)。
[0014]實施例3水稻啟動子的克隆
基于genbank公共數據庫中基因的上游啟動區(qū)序列，設計并合成了特異性引物 p0sPYL8-F: 5 ' -GTTTCATGTTAGGTTTGTCCGC-3 ' ， p0sPYL8_R:5丨-CTCCGGTACACAGTAGCAGCAG-3丨，以水稻品種日本晴的基因組DNA為模版，進行PCR擴增。PCR 反應體系為 50yL:TaKaRa LA Taq 酶(5 U/yL)0.5 yL，2XLA PCR Buffer II 5yL (含 MgCl2)，dNTP (2.5 mM) 8 yL，引物 F/R (10 μΜ)各 1 yL, DNA 2 yL，ddH20 補齊至 50 μ L，擴增程序為:94 °C，5min; 94°C 30min，60°C 30S，72°C 2.5min，共 30 個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。PCR擴增獲得了一條2055 bp的條帶。進一步以DNA回收試劑盒(DP209，天根公司)從瓊脂糖凝膠中回收擴增條帶，并進行測序，獲得了序列為SEQ IDN0.1所示的DNA片段，其為因翻譯起始位點(ATG)的上游2055 bp區(qū)段。
[0015]實施例4植物表達載體pC-p0sPYL8_GUS的構建
為了驗證/^/??前啟動子活性，進一步構建了 p0sPYL8關6K5報告基因的植物表達載體。所用基礎載體pCXGUS-P (genbank序列號:FJ905224)包含一個6K5報告基因。6K5報告基因的上游，具有兩個ZcM位點，經ZcM酶切后，可產生兩個3' -T末端，能克隆兩端帶有A末端的PCR片段。
[0016]以pCXGUS-PAfcM為載體骨架，與實施例3獲得的啟動子片段進行連接，轉化DH5 α感受態(tài)，進一步酶切鑒定、測序驗證獲得了融合的植物表達載體，命名為pC-p0sPYL8-GUS。所構建載體如附圖2所示。
[0017]實施例5轉基因水稻植株培育及⑶S表達檢測
采用電激法將pC-p0sPYL8-GUS轉化到農桿菌LBA4404，進一步以攜帶pC-p0sPYL8_GUS的農桿菌侵染水稻品種日本晴的愈傷組織，進行遺傳轉化，并最終篩選、獲得轉基因水稻T。植株。
[0018]將轉pC-p0sPYL8-GUS的水稻材料種植于溫室內(氣溫30°C，光照12小時以上)，同時種植陰性植株(非轉基因野生型日本晴)和陽性植株(轉化了一個組成型啟動子/^仍驅動6K5報告基因表達結構p35S-gus的轉基因植株)。取生長正常植株的根、莖、葉、小穗及種子等組織材料，按Jefferson (1987)的方法，將待測樣品浸入⑶S染色液中，37°C保溫2小時，用75%乙醇對葉片、莖等綠色組織進行脫色處理，顯微鏡下觀察并拍照記錄⑶S的染色結果。
[0019]實施例的結果表明，轉pC-p0sPYL8-GUS植株的胚乳部位能夠明顯檢測到⑶S染色，其根、莖、葉、小穗、胚等組織部位均無⑶S染色(附圖3)，說明啟動子能驅動目的基因在水稻胚乳中特異性高效表達。在對照試驗中，非轉基因植株的所有組織部位均無⑶S染色，轉p35S-gus植株的各個組織部位中均能觀察到⑶S染色(附圖3)。
【主權項】
1.一種水稻胚乳特異表達啟動子，其特征在于:來源于水稻基因的上游啟動子區(qū)，為下述DNA序列之一: (1)具有SEQID N0.1所示的DNA序列； (2)在SEQID N0.1所示序列基礎上對序列中間片段或堿基進行插入、缺失或替換改變所產生，并且具有胚乳特異表達啟動子活性的DNA序列； (3)在SEQID N0.1所示序列基礎上進行5'-或者3'-缺失所產生，并且具有胚乳特異表達啟動子活性的DNA序列。2.一種含有權利要求1所述的水稻胚乳特異表達啟動子的植物表達載體。3.如權利要求1所述的水稻胚乳特異表達啟動子在水稻培育上的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻胚乳特異表達啟動子pOsPYL8，提供了一個水稻脫落酸（abscisic？acid，ABA）受體蛋白基因<i>OsPYL8</i>上游序列的啟動子，命名為<i>pOsPYL8</i>啟動子。本發(fā)明通過水稻不同組織部位表達譜分析及轉基因植株報告基因表達分析，證實<i>pOsPYL8</i>啟動子可特異性地驅動目的基因在水稻胚乳組織中表達。本發(fā)明提供的<i>pOsPYL8</i>啟動子可應用于基因工程改良稻米胚乳相關性狀及在胚乳中表達重組蛋白。
【IPC分類】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/82
【公開號】CN105420242
【申請?zhí)枴緾N201610017291
【發(fā)明人】陳松彪, 陳子強, 王 鋒, 陳在杰
【申請人】福建省農業(yè)科學院生物技術研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月12日