專利名稱：啟動(dòng)子核酸；包含其的表達(dá)盒、載體和宿主細(xì)胞；和使用該細(xì)胞表達(dá)基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來自棒桿菌屬細(xì)菌的新的啟動(dòng)子核酸、包含該啟動(dòng)子的表達(dá)盒、包含 該表達(dá)盒的載體、包含該載體的宿主細(xì)胞和使用該宿主細(xì)胞表達(dá)基因的方法。
背景技術(shù)：
棒桿菌類細(xì)菌是用于產(chǎn)生用于許多應(yīng)用的多種化學(xué)物質(zhì)的微生物，所述化學(xué)物質(zhì) 為如動(dòng)物飼料、藥品，和食品，包括L-賴氨酸、L-蘇氨酸，和多種核酸。通過遺傳工程和代 謝工程可以開發(fā)顯示出高生產(chǎn)力的棒桿菌菌株。為了得到顯示出高生產(chǎn)力的棒桿菌菌株， 需要在棒桿菌中表達(dá)涉及多種代謝途徑的基因。為此，必須開發(fā)合適的啟動(dòng)子。通常，在棒桿菌中，基因在內(nèi)在地包括在該基因中的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)(見例 如，Journal of Bacteriology，181 (19)，6188-6191，1999)。同時(shí)，在棒桿菌細(xì)菌中表達(dá) 基因的啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)是未知的，而其他工業(yè)微生物，如大腸桿菌(E. coli)和枯草芽孢 桿菌(Bacillus subtilis)的結(jié)構(gòu)是已知的。因此，已經(jīng)提出了下面的方法用來產(chǎn)生能夠 使基因在棒桿菌細(xì)菌中表達(dá)的啟動(dòng)子。首先，除去耐受抗生素，如氯霉素的基因的啟動(dòng)子 區(qū)。使用合適的限制酶單獨(dú)地切割從棒桿菌細(xì)菌分離的染色體DNA，并將所得片段導(dǎo)入除 去該啟動(dòng)子區(qū)的基因中。然后，所得基因用于轉(zhuǎn)化棒桿菌細(xì)菌以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的菌株并測量 所轉(zhuǎn)化的菌株的抗生素抗性(見 Gene, 102,93-98,1991 ；Microbiology, 142，1297-1309， 1996.)。具體地，已經(jīng)開發(fā)了用于Corynebacterium ammoniagenesis中的非常少數(shù)目 的啟動(dòng)子，Corynebacterium ammoniagenesis是一種已知的生產(chǎn)核酸的微生物。例如， 在大腸桿菌中使用比tac啟動(dòng)子活性高約10%的啟動(dòng)子(見Biotechnol.Lett. 25， 1311-1316,2003.)。然而，當(dāng)它用于基因的大量表達(dá)時(shí)，這種啟動(dòng)子顯示出低效率。美國專 利號5，593，781公開了一種啟動(dòng)子DNA，其從黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)菌株 MJ-233(FERM BP-1497)分離并且具有比tac啟動(dòng)子更高的活性。然而，這種從短桿菌屬分 離的啟動(dòng)子DNA在其他細(xì)菌中不能工作。因此，需要開發(fā)來自通過商業(yè)途徑可獲得的產(chǎn)氨 棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)并且在其他細(xì)菌中具有高活性的啟動(dòng)子序列。因此，本發(fā)明的發(fā)明人在產(chǎn)氨棒桿菌中尋找強(qiáng)啟動(dòng)子序列并且發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的 啟動(dòng)子可以在產(chǎn)氨棒桿菌中以高活性表達(dá)基因。附圖描述

圖1顯示了從產(chǎn)氨棒桿菌細(xì)菌提取的樣品的二維電泳測定的結(jié)果，其中將測定結(jié) 果進(jìn)行銀染并顯影用于鑒定；
圖2圖解了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案產(chǎn)生pll7_gfp的篩選載體的方法；圖3圖解了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案從篩選載體pll7_gfp產(chǎn)生包括啟動(dòng)子序列 PCjl到PCj7的重組載體的方法。發(fā)明詳述技術(shù)問題本發(fā)明提供了在棒桿菌中具有高活性的啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了包括所述啟動(dòng)子的表達(dá)盒和包括該表達(dá)盒的載體。本發(fā)明還提供了包括所述載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了使用所述宿主細(xì)胞表達(dá)基因的方法。技術(shù)解決方案本發(fā)明提供了包含至少一種選自由SEQ ID NO :1到7組成的組的多核苷酸的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子是分離的核酸并且具有啟動(dòng)子活性。這里，術(shù)語 “啟動(dòng)子”指DNA區(qū)，RNA聚合酶結(jié)合該DNA區(qū)以起始基因的轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“tac啟動(dòng)子”指通 過將從大腸桿菌的色氨酸操縱子啟動(dòng)子的-35區(qū)得到的序列與從大腸桿菌的乳糖操縱子 啟動(dòng)子的-10區(qū)得到的序列融合得到的啟動(dòng)子。已知tac啟動(dòng)子具有高啟動(dòng)子活性。具 有選自SEQ IDNO :1、4、5、6和7的至少一種核酸的啟動(dòng)子在棒桿菌屬細(xì)菌中具有比tac啟 動(dòng)子更高的活性。具體地，具有選自SEQ ID NO :1和4的至少一種核酸的啟動(dòng)子在棒桿菌 屬細(xì)菌中具有比tac啟動(dòng)子高4到10倍的活性。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子除了在棒桿菌屬細(xì)菌中，還在埃希氏菌 (Escherichia)屬細(xì)菌中具有啟動(dòng)子活性。具體地，含有SEQ ID NO :1的啟動(dòng)子甚至在埃 希氏菌屬細(xì)菌中也顯示出比tac啟動(dòng)子高兩倍的啟動(dòng)子活性。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以在其中起作用的細(xì)胞可以是任何棒桿菌屬細(xì)菌。棒桿 菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)和ATCC6871、谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032 和 ATCC13060，等等。然而，谷氨酸棒桿菌屬細(xì) 菌不限于此。本發(fā)明的啟動(dòng)子可以在其中起作用的埃希氏菌屬細(xì)菌的實(shí)例包括大腸桿菌。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子的序列可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過已知的誘 變方法如定向進(jìn)化和位點(diǎn)定向誘變而容易地改變。因此，本發(fā)明的范圍內(nèi)包括與分離的啟 動(dòng)子序列具有例如70%或者更高同源性，優(yōu)選80%或者更高同源性，更優(yōu)選90%或者更高 同源性并且可以在棒桿菌屬細(xì)菌中作為啟動(dòng)子的核酸，所述分離的啟動(dòng)子序列包括至少一 種選自SEQ IDN0. :1到7的核酸。本發(fā)明還提供了表達(dá)盒，其包括可操縱連接編碼序列的啟動(dòng)子。編碼序列可以是 例如完整基因或者編碼基因的預(yù)定區(qū)域的編碼序列。這里，術(shù)語“可操縱連接(operably linked)”指出編碼序列功能地連接啟動(dòng)子，使得啟動(dòng)子序列可以起始或者介導(dǎo)編碼序列的 轉(zhuǎn)錄。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的表達(dá)盒可以還包括可操縱連接啟動(dòng)子序列的5’和3’控制 序列。編碼序列可以是結(jié)合代謝產(chǎn)物，如IMP、GMP、L-賴氨酸和L-蘇氨酸的基因。本發(fā)明還提供了包括根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的表達(dá)盒的載體。這里，載體是不 受限制的，并且可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的載體的實(shí)例 包括 pCR2. 1-T0P0 載體(Invitrogen Inc, USA 生產(chǎn))和 pECCG117 (KFCC-10673)。然而，載體不限于此。包括根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的表達(dá)盒的載體的實(shí)例包括Pll7-cjl-gfp、 ρ 117-cj2-gfp> pi17-cj3_gfp、ρ 117-cj4_gfp、ρ 117-cj5_gfp、pi 17-cj6_gfp 禾口 pll7-cj7-gfp。本發(fā)明還提供了包括按照本發(fā)明的實(shí)施方案的載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以 是棒桿菌屬細(xì)菌或者埃希氏菌屬細(xì)菌，但不限于此。例如，宿主細(xì)胞可以是產(chǎn)氨棒桿菌 CJHB100 (KCCM-10330)或者大腸桿菌。本發(fā)明還提供了通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞表達(dá)異源基因的方法。根據(jù)所選的宿主細(xì)胞， 可以在多種已知的培養(yǎng)基和多種已知的培養(yǎng)條件之一下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。有益效果可操縱連接根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子的基因在大腸桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌中有效表達(dá)。啟 動(dòng)子適于用棒桿菌屬細(xì)菌開發(fā)菌株。包括根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子的表達(dá)盒和包括根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的載體適于在大 腸桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌中有效表達(dá)外源基因。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以有效表達(dá)外源基因。通過使用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)基因的方法，可以有效表達(dá)外源基因。最佳方式將參考下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于闡明目的，并且 不意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例從不同培養(yǎng)階段的產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)制備細(xì)菌提取物。對細(xì)菌提 取物進(jìn)行二維電泳以發(fā)現(xiàn)其中過表達(dá)的蛋白質(zhì)，然后將其切割以分析肽序列。所得的肽序 列用于鑒定過表達(dá)蛋白質(zhì)的基因。然而，分離啟動(dòng)子區(qū)，并使用啟動(dòng)子區(qū)產(chǎn)生載體。接著， 測量啟動(dòng)子在產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)和大腸桿菌中的活性。實(shí)施例1 培養(yǎng)產(chǎn)氨棒桿菌CJHB 100 (KCCM-10330)并根據(jù)培養(yǎng)階段選擇過表達(dá)蛋 白質(zhì)(1)細(xì)菌的培養(yǎng)在具有糖蜜的粗糖(含有50%葡萄糖和50%果糖的混合物)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn) 氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)。此時(shí)，測量細(xì)胞濃度。在早穩(wěn)定期和穩(wěn)定期收獲培養(yǎng)的產(chǎn) 氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)的樣品。將樣品離心并除去所得的上清液。得到的細(xì)胞沉 淀在崩解緩沖液中裂解以產(chǎn)生約100 μ m細(xì)菌提取物。(2) 二維電泳測定從第(1)部分得到的細(xì)菌提取物用6M尿素、2M硫脲、4% CHAPS和0. 4% DTT稀釋 以得到總體積350 μ 1的混合物。然后，向其中加入7μ 1的IPT緩沖液和3μ 1的溴酚 藍(lán)(BPB)。使用immobiline pH梯度drystrip將所得溶液裝載到再水化盤。再水化盤上的 樣品用2ml覆蓋液覆蓋以防止樣品的蒸發(fā)和尿素的結(jié)晶，然后在室溫下再水化約24小時(shí)。使用等電聚焦裝置(MultiphorII =Amersham Bioscience, USA.生產(chǎn))將再水化 的條帶凝膠(strip gel)進(jìn)行等電聚焦在20°C 0-100V進(jìn)行1小時(shí)，300V進(jìn)行1小時(shí)，600V 進(jìn)行1小時(shí)，和在8000V下進(jìn)行預(yù)定的時(shí)間，該時(shí)間經(jīng)調(diào)節(jié)以進(jìn)行聚焦43-97kVhr(pH 4-7 43. 4kVhr, pH 4. 5-5. 5，ρΗ5· 5-6. 7 :97kVhr)。 當(dāng)?shù)入娋劢雇瓿蓵r(shí)，各自的條帶凝膠在含有20mM Tris_HCl、6M尿素、2 % SDS、 20%甘油、2. 5%丙烯酰胺和5mM TBP的pH 8. 8溶液中平衡15分鐘。將各自平衡的條帶裝 載到二維凝膠(9-16%濃度梯度)中然后用含有0.5%具有低沸點(diǎn)的瓊脂和0. 001% BPB的 SDS溶液密封。在100V下電泳約19小時(shí)。 電泳完成后，將凝膠在45 %甲醇溶液和5 %乙酸溶液中固定。用蒸餾水洗滌乙酸1 小時(shí)。將凝膠用0.02%硫代硫酸鈉敏化2分鐘并用蒸餾水洗滌。然后，將凝膠與0.1%硝 酸銀反應(yīng)20分鐘并用蒸餾水洗滌。反應(yīng)產(chǎn)物用含有2% (w/v)碳酸鈉和0.04% (ν/ν)甲 醛的溶液顯影。當(dāng)斑點(diǎn)具有出現(xiàn)的希望的強(qiáng)度時(shí)，用乙酸中止反應(yīng)。凝膠用蒸餾水洗滌 并在4°C下保存在密封的塑料袋中。當(dāng)使用考馬斯染色時(shí)，當(dāng)電泳完成后，用30%甲醇溶液和10%乙酸溶液固定凝膠 1小時(shí)，用蒸餾水洗滌，用膠體考馬斯亮藍(lán)G-250染色24小時(shí)，然后用10%甲醇溶液和7% 乙酸溶液漂白4小時(shí)。(3)基于斑點(diǎn)，制備用于質(zhì)譜的肽樣品使用已知方法(Shevchenkoet al. Anal. Chem.，68 (5)，850-8，1996.)的改進(jìn)版從
斑點(diǎn)分離肽。首先，從第(2)部分制備的凝膠切除蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，用30mM鐵氰化鉀和IOOmM硫代 硫酸鈉的1 1比例的120μ 1混合溶液漂白，并用蒸餾水洗滌，然后用120μ 1 50%乙腈 /25mM碳酸氫銨(pH 7. 8)洗滌10分鐘。所得產(chǎn)物與50 μ 1 100%乙腈反應(yīng)直到白色出現(xiàn) 約5分鐘，然后真空干燥。向干燥的斑點(diǎn)加入10 μ 1 二維電泳級的胰蛋白酶(0. 02 μ g/ μ 1)然后在冰水反應(yīng) 45分鐘。然后，向反應(yīng)產(chǎn)物加入50mM碳酸氫銨緩沖液(pH 7. 8)并在37。C反應(yīng)12-14小時(shí)。 所得產(chǎn)物在10 μ 1 0.5% TFA和50%乙腈中用超聲波處理3次10分鐘以提取肽。(4)質(zhì)譜法通過HPLC-MS/MS分析如上述提取肽。用1100系列HPLC系統(tǒng)(Agilient Inc, USA 生產(chǎn))和 Finnigan LCQ DECA 離子阱質(zhì)譜裝置(ThermoQuest，USA 生產(chǎn))進(jìn)行 HPLC-MS/MS， 在該裝置上安裝納噴霧離子化源。用C18顯微探針反相柱進(jìn)行HPLC，并以線性梯度(流速 =1μ 1/分鐘)提供0. 甲酸(溶劑Α)和90% (ν/ν)乙腈和0. 甲酸的溶液(溶劑 B)以分離肽。使用納噴霧電離(NSI)(噴霧電壓1. 8kV ；毛細(xì)管溫度200°C ；毛細(xì)管電壓34V ； 管透鏡偏移40V ；和電子倍增器-60V)進(jìn)行肽檢測3次。以圖心模式(centroid mode)得 到測量。得到400-2000Da的完整MS掃描后，將閾值設(shè)置為1 X IO5計(jì)數(shù)并通過高分辨率局 部放大掃描分離最強(qiáng)的離子。然后，進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離(CID)MS/MS。使用TurboQuest軟件 (Thermo Finnigan Inc，USA生產(chǎn))鑒定不編碼的CID光譜的序列。SEQUEST搜索的結(jié)果通 過互相關(guān)和ΔΟι(Δ歸一化相關(guān))鑒定。使用Q-star Pulsar LC MS/MS (Applied Biosystems Inc，USA 生產(chǎn))證實(shí)和鑒定 肽的氨基酸序列。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了 50種蛋白質(zhì)，并選擇了 50種蛋白質(zhì)的7種過表達(dá)的蛋白質(zhì)。圖1顯 示了從產(chǎn)氨棒桿菌提取的樣品的二維電泳分析的結(jié)果，其中將測定結(jié)果銀染并顯影用于鑒定。在圖1中，鑒定了通過CJl到CJ7表示的7種過表達(dá)的斑點(diǎn)。這些7種過表達(dá)的蛋 白質(zhì)的功能在表1中指出。通過將肽的序列與NCBI gene bank數(shù)據(jù)庫中所含的氨基酸序 列比較，鑒定了這些蛋白質(zhì)的功能。表 1 從7種過表達(dá)的蛋白質(zhì)推定基因序列并分析以選擇啟動(dòng)子區(qū)。結(jié)果，推定從對應(yīng) 于CJl到CJ7表示的蛋白質(zhì)的基因序列分離的SEQ ID NO :1到7的寡核苷酸具有啟動(dòng)子活 性。實(shí)施例2 制備具有啟動(dòng)子序列的重組載體pll7_cjl 7_qfp和在產(chǎn)氨棒桿菌中 啟動(dòng)子活性的證實(shí)(1)從產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100的基因組擴(kuò)增啟動(dòng)子序列使用Eikmann等人(Gene，102,93-98,1991)提出的方法，從培育1天的25ml產(chǎn)氨 棒桿菌CJHB100培養(yǎng)物分離500yg染色體DNA。分離的染色體DNA用作模板。使用引物 組(SEQ ID NOS :10 和 11、12 和13、14 和 15、16 和 17、18 和 19、20 和 21、和 22 和 23)進(jìn)行 PCR,分別在94°C，在55°C，在72°C，30秒，重復(fù)30次以擴(kuò)增CJl到CJ7的啟動(dòng)子。結(jié)果，擴(kuò) 增了各自的啟動(dòng)子序列pcjl到pcj7。(2)制備篩選載體首先，使用pGFuv載體(Clontech Inc，USA生產(chǎn))作為模板并使用SEQ ID NOS 8 和9作為引物分別在94°C 30秒、55°C 30秒、和72°C 1分鐘進(jìn)行PCR。在每個(gè)溫度下進(jìn)行PCR 30次。結(jié)果，擴(kuò)增不包括啟動(dòng)子區(qū)的綠色熒光蛋白(GFP)基因。然后，將所得的不包含啟動(dòng) 子區(qū)的GFP基因克隆到pCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen，USA生產(chǎn))中，其然后通過PstI和 EcoRI 切割并導(dǎo)入 pECCG117(KFCC-10673/KFCC-10674)的 PstI 和 EcoRI 位點(diǎn)中，pECCG117 是穿梭載體并且可以在大腸桿菌和棒桿菌細(xì)菌中表達(dá)。結(jié)果用作篩選載體(Pll7_gfp)來 分離啟動(dòng)子。圖2圖解了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，產(chǎn)生pll7-gfp的篩選載體的方法。(3)導(dǎo)入啟動(dòng)子序列到篩選載體中和在產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100中鑒定啟動(dòng)子活性將部分(2)中得到的篩選載體用KpnI/EcoRV的限制酶切割，然后連接到通過相同 的限制酶切割的PCjl到pcj7的啟動(dòng)子序列中以產(chǎn)生pll7-cjl-7-gfp的重組載體，其中 pcjl到pcj7的寡核苷酸從產(chǎn)氨棒桿菌CJHB 100分離并且具有假定的啟動(dòng)子活性，將所述 寡核苷酸連接到GFP。圖3圖解了從根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的篩選載體pll7-gfp產(chǎn)生包括 SEQ. IDNOS :pcjl到pcj7的重組載體的方法。通過 van der Rest 等人(Appl. Microbiol. Biotechnol.，52，541-545，1999)介紹 的方法將得到的重組載體導(dǎo)入容易轉(zhuǎn)化的產(chǎn)氨棒桿菌CJHB 100(KCCM-10330)中。將所得轉(zhuǎn)化的菌株涂布含有10 μ g/ml卡那霉素的CM培養(yǎng)基(1 %蛋白胨，1 %肉湯，0. 25 %氯化鈉， 酵母提取物，100mg/ml腺嘌呤，100mg/ml鳥嘌呤，2%瓊脂(pH 7. 2))上并在32°C培養(yǎng)3 天。從菌落篩選顯示生長的活菌株。然后，將對篩選的菌株用紫外線照射并選擇發(fā)出熒光 的菌株。發(fā)出熒光的菌株的篩選表明pcjl到pcj7的啟動(dòng)子在棒桿菌細(xì)菌中顯示出啟動(dòng)子 活性。同時(shí)，定量測量啟動(dòng)子活性。將pll7-cjl-7-gfp的重組載體導(dǎo)入產(chǎn)氨棒桿菌 CJHBlOO (KCCM-10330)中并以與上述相同的方式培養(yǎng)。離心培養(yǎng)物得到細(xì)菌沉淀。然后， 將細(xì)菌沉淀懸浮在蛋白質(zhì)提取緩沖液(PBS中l(wèi)mMEDTA，3%甘油，triton-X-100溶液， pH-7. 5)并通過超聲處理裂解。將裂解物離心并分離含有細(xì)菌提取物的所得上層溶液。通 過Bradford測定法測量細(xì)菌提取物中含有的蛋白質(zhì)的量。隨后，使用Laure Gory等人 (FEMSMicrobiology Letters 194，127-133，2001)描述的方法向等于上述細(xì)菌提取物的量 的細(xì)菌提取物照射488nm光，并使用LS-50B分光光度計(jì)(Perkin-Elmer)測量發(fā)射的光以 發(fā)現(xiàn)GFP基因的表達(dá)程度并且發(fā)現(xiàn)具有511nm的波長。結(jié)果在表2中顯示。如表2中所示，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子指導(dǎo)GFP基 因的有效表達(dá)。更具體地，PCjl和pcj4的啟動(dòng)子與其他啟動(dòng)子相比顯示出最高的效率。表 2 實(shí)施例3 比較tac啟動(dòng)子和根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子在產(chǎn)氨棒桿菌中的 活性在本實(shí)驗(yàn)中，比較了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子和常用于產(chǎn)氨棒桿菌中的tac 啟動(dòng)子的活性。(1)制備含有tac啟動(dòng)子和組合的GFP基因的載體首先，使用pKK223-2載體(Pharmacia Biotech, USA生產(chǎn))作為模板并使用SEQ ID NOS :24和25作為引物以與實(shí)施例1中相同的方式進(jìn)行PCR以擴(kuò)增tac啟動(dòng)子序列。將 擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆到PCR2. 1-T0P0載體(Invitrogen，USA)中。接著，將得到的tac啟動(dòng)子序 列用KpnI和EcoRV的限制酶切割并連接到用相同限制酶切割的pll7_gfp以得到重組的表 達(dá)載體(pll7-tac-gfp·)。將重組載體以與實(shí)施例1中相同的方式轉(zhuǎn)化產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100，并測量GFP基因 的活性。將由于tac啟動(dòng)子的GFP基因的活性與由于根據(jù)實(shí)施例2選擇的啟動(dòng)子的GFP基 因的活性進(jìn)行比較。結(jié)果在表3中顯示。表3 如表3中所示，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子有效表達(dá)GFP基因。此 外，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的啟動(dòng)子在產(chǎn)氨棒桿菌中的活性與tac啟動(dòng)子在產(chǎn)氨棒桿菌中的活性比較時(shí)，pcjUpcj4.pcj5.pcj6和pcj7啟動(dòng)子比tac啟動(dòng)子顯示出更高的強(qiáng)度。 具體地，pcjl和pcj4的啟動(dòng)子顯示出10倍于tac啟動(dòng)子活性。實(shí)施例4 在大腸桿菌中證實(shí)根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子的活性證實(shí)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子除了在棒桿菌細(xì)菌中外還在大腸桿菌中顯示 出活性。將大腸桿菌用在實(shí)施例1和2中使用的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。通過與實(shí)施例1中相同的方式測量GFP基因的活性確定根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟 動(dòng)子是否能夠在大腸桿菌中有效表達(dá)GFP。參考載體是含有tac啟動(dòng)子的pll7-taC-gfp重 組載體。表4顯示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子在大腸桿菌中的啟動(dòng)子活性。表 4 如表4中所示，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子在大腸桿菌中有效表達(dá)GFP基 因。更具體地，PCjl啟動(dòng)子在棒桿菌細(xì)菌和大腸桿菌中都顯示出高活性。實(shí)施例5 =IPTG對根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子活性的影響公知tac啟動(dòng)子是代表性啟動(dòng)子，通過該啟動(dòng)子，在大腸桿菌中可以通過IPTG(異 丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)基因表達(dá)。換句話說，在大腸桿菌中，tac啟動(dòng)子表達(dá)的 基因的量根據(jù)存在或不存在IPTG而變。在本實(shí)驗(yàn)中，測量了 IPTG對根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子對GFP基因表達(dá)的影 響。為此，將含有比pll7-cjl-gfp的其他啟動(dòng)子有更高活性的pcjl啟動(dòng)子的重組載體以 實(shí)施例1和2中相同的方式導(dǎo)入大腸桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌CJHB100 (KCCM-10330)中，并測量 由此表達(dá)的GFP基因的量。參照物是含有tac啟動(dòng)子的pll7-taC-gfp重組載體。結(jié)果在 表5中顯示。表 5 如表5中所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的啟動(dòng)子在大腸桿菌和產(chǎn)氨棒桿菌中比tac 啟動(dòng)子更有效地表達(dá)GFP基因，不考慮IPTG的存在。向pECCG117 中插入上述實(shí)施例中得到的 pCJl、pCJ2、pCJ3、pCJ4、pCJ5、pCJ6 和PCJ7的啟動(dòng)子。所得的載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5。將所得轉(zhuǎn)化體根據(jù)布達(dá)佩斯條約在2004年11月16日保藏在國際保藏組織韓國微生物培養(yǎng)中心(KCCM)中(保藏 號KCCM-10611、KCCM-10612、KCCM-10613、KCCM-10614、KCCM-10615、KCCM-10616 禾口 KCCM-10617)。
涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis) 涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis) 涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis) 涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis)A.以下做出的指示涉及在說明書第77段頁第14-19行(注:中文說明書第Jl 頁)中提及的保藏的微生物或其它生物材料
B.保藏鑒定
更多的保藏在附頁上鑒定口
保藏機(jī)構(gòu)名稱
韓國微生物保藏中心(KCCM)
保藏機(jī)構(gòu)地址Q包括郵政編碼和國家)
保藏円期
2004年11月16円
C.另外的指示(如果不適用留空)該信息在附頁上繼續(xù)口
D.做出指示的指定局、如果其指示不是針對所有指定局)
E.指示的單獨(dú)說明(如果不適用留空)
以下所列指示以后將提交給國際局(規(guī)定指示例如“保藏登記號”的一般性質(zhì))
僅供受理局使用 □該頁與| 丨際申請一起收到
僅供國際局使用 □該頁被國際局接收-
授權(quán)官員
授權(quán)官員
申請人或代理機(jī)構(gòu)文件參考
國際申請?zhí)柹婕氨２氐奈⑸锘蚱渌锊牧系闹甘?PCT細(xì)則13bis) 涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis) 涉及保藏的微生物或其它生物材料的指示(PCT細(xì)則13bis) 序列表<110>CJ 株式會社<120>來自棒桿菌屬細(xì)菌的新的啟動(dòng)子核酸、包含該啟動(dòng)子的表達(dá)盒和包含該表 達(dá)盒的載體、包含該載體的宿主細(xì)胞和使用該細(xì)胞表達(dá)基因的方法<130>PN05941<160>24<170>KopatentIn 1. 71<210>1<211>301<212>DNA<213> /^M^ff · (Corynebacterium ammoniagenes) CJHB100<400>1cBccgcgggc ttattccatt acatggaatg accaggaatg gcagggaatg cgacgaaatt60gactgtgtcg ggagcttctg atccgatgct gccaaccagg agagaaaata atgacatgtg 120caggcacgct ggtgagctgg agatttatga tctcaagtac cttttttctt gcactcgagg 180gggctgagtg ccagaatggt tgctgacacc aggttgaggt tggtacacac tcaccaatcc 240tgccgtcgcg ggcgcctgcg tggaacataa accttgagtg aaacccaatc taggagatta 3000126]a3010127]<210>20128]<211>2850129]<212>DNA0130]<213> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000131]<400>20132]aattccaccagacgttgttt agtaagtgcc cgaattctcg gttggtgcag ttgcttttcg600133]atgaatgggagaacctcgaa tacttccgcg tctctacttt ccggtacgtg ccacacagag1200134]cagagcaatcggtggaagag cacgacagat tagtagcgct tatcgaagcc caggcagaag1800135]atttctacatcgaatcccaa gcccgcaacc accgcctgac aaccgcaacg acctaccgcc2400136]aacgtttaaattccgaaaat catcacgaag aacaaggagt gcaca2850137]<210>30138]<211>2910139]<212>DNA0140]<213> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000141]<400>30142]gctgcctacatctggacttc tgacctgaag cgctcccaca acttcgcgca aaacgttgaa600143]gccggcatggtctggttgaa ctccaacaac gtccgtgacc tgcgcacccc attcggtggc1200144]gtcaaggcatccggtctggg gcatgagggc ggctaccgct ccattgactt ctacaccgac1800145]caacaggccgtacacatcaa cttaggcgaa gtccacaacc cagtcttcgg caagcaaacc2400146]aactaattctccctcatcca cactcccctt ttaacctcac taggagtcat c2910147]<210>40148]<211>3120149]<212>DNA0150]<213> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000151]<400>40152]actgggagggtaggggtcac gctgaattag caggtcacat cctgttgctt gagctggccg600153]ttaccctcctaggatccgag atgattcttg tagaggacta acgtccgcac aaatcttccg1200154]cgggatgctcaaatcaccct tagctggttt gaaaaatccg tggcataaat ctaggatcgt1800155]gtaactggcacgaaaagaaa gcgtcatcgg cgcttgggaa catcttttta agatattcct2400156]caagtgccgtgacatctgtc aaccccgtgg ctgcgagagt cgtagtcaca atgaagtcca3000157]ggaggacataca3120158]<210>50159]<211>2490160]<212>DNA0161]<213> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000162]<400>50163]tcggacatatacggatttac ctgctgcaat cgcgccggcc cttgctcgaa attgcgtgaa600164]ttttagtctg attgtgttgg aatatccgca gaatgtgtgg gtttgctttt ataaatctgc1200165]gcagtgtagg gaacctcggtactatcggca gtgtcggaga aacttcctcg atataaatct1800166]ttgaagtaattctcccaggcaatagcttttgacgtactccgcttcccaactttttaggag2400167]acaactacc2490168]<210>60169]<211>3320170]<212>DNA0171]<213> 產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000172]<400>60173]ggcttcatcgtcgtctttgatccgatgcgagtccattaacccaaactccttaaagcccgt600174]aaaacgggggtattccaacacggttatccacagtttaaccgttattcgggggtaatccta1200175]acccaaatcattacggaaactccaatctggctcacaatatcctccatgattctagggaca1800176]cccaatcaggtgcacccgcttcctgcgacaacgagtcaaactcggcaaagccctcaacct2400177]gtcggtctag3.3. 3. 3. 3. 3.CCgCCCggtCtagtgttgtggtgtacactaacgataaacc3000178]aacaaagttgtctattaagaggaggccatttc3320179]<210>70180]<211>3180181]<212>DNA0182]〈213>產(chǎn)氛棒If菌(Corynebacterium ammoniagenes) CJHB1000183]<400>70184]agaaacatcccagcgctactaatagggagcgttgaccttccttccacggaccggtaatcg600185]gagtgcctaaaaccgcatgcggcttaggctccaagataggttctgcgcggccgggtaatg1200186]catcttctttagcaacaagttgaggggtaggtgcaaataagaacgacatagaaatcgtct1800187]cctttctgtttttaatcaacatacaccaccacctaaaaattccccgaccagcaagttcac2400188]agtattcgggcacaatatcgttgccaaaatattgtttcggaatatcatgggatacgtacc3000189]caacgaaaggaaacactc3180190]<210>80191]<211>310192]<212>DNA0193]〈213〉人工序列0194]〈220〉0195]〈223〉引物0196]〈400>80197]acgcgatatcatgagtaaaggagaagatctt310198]<210>90199]<211>310200]<212>DNA0201]〈213〉人工序列0202]〈220〉0203]〈223〉引物
<400>9aaaactgcag ttatttgtag agctcatcca t31<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>10cggggtacca ccgcgggctt attccattac at 32<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>11acgcgatatc ttaatctcct agattgggtt tc 32<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>12cggggtacca attccaccag acgttgttta gta 33<210>13<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>13acgcgatatc tgtgcactcc ttgttcttcg tg 32<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
19
<223> 引物<400>14cggggtaccg ctgcctacat ctgggcttct gac 33<210>15<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>15acgcgatatc gatgactcct agtgaggtta a31<210>16<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>16cggggtacca ctgggagggt aggggtcac29<210>17<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>17acgcgatatc tgtatgtcct cctggacttc30<210>18<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>18cggggtacct cggacatata cggatttacc tg 32<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列
<220><223> 引物<400>19acgcgatatc gttgtctcct aaaaagttgg g 31<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>20cggggtaccg gcttcatcgt cgtct25<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>21acgcgatatc tggcctcct cttaatagac30<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>22cggggtacca gaaacatccc agcgctacta ata 33<210>23<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223> 引物<400>23acgcgatatc agtgtttcct ttcgttggg 29<210>24<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220><223> 引物<400>24cggggyaccc ggagcttatc gactgcacg 29
權(quán)利要求
啟動(dòng)子，其由SEQ ID NO5的多核苷酸組成。
2.表達(dá)盒，其包含權(quán)利要求1的啟動(dòng)子并且可操縱連接編碼序列。
3.載體，其包含權(quán)利要求2的表達(dá)盒。
4.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求3的載體。
5.權(quán)利要求4的宿主細(xì)胞，其是屬于棒桿菌屬(Corynebacterium)或埃希氏菌屬 (Escherichia)的細(xì)菌細(xì)胞。
6.表達(dá)異源基因的方法，其包括培養(yǎng)權(quán)利要求4或者權(quán)利要求5的宿主細(xì)胞。
全文摘要
提供了包括至少一種選自由SEQ ID NO1到7組成的組的多核苷酸的啟動(dòng)子、包括該啟動(dòng)子的表達(dá)盒、包括該表達(dá)盒的載體、包括該載體的宿主細(xì)胞，和使用該宿主細(xì)胞表達(dá)基因的方法。
文檔編號C12P21/00GK101892223SQ20091026608
公開日2010年11月24日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者崔惠真, 強(qiáng)泰善, 樸英薰, 李源植, 李真浩, 沈栽益, 金顯洙, 黃水淵 申請人:Cj第一制糖株式會社