靶向人前列腺特異性膜抗原的j591微抗體和雙抗體的制作方法
【專利說明】靶向人前列腺特異性膜抗原的J591微抗體和雙抗體
[0001] 本申請是申請日為2010年12月2日、申請?zhí)枮?01080062988. 4、題為"靶向人前 列腺特異性膜抗原的J591微抗體和雙抗體"的專利申請的分案申請。
[0002] 關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明
[0003] 本發(fā)明是以政府資助在由國家癌癥研究所（NCI)給予的合約編號 HHSN261200900051C下進行的。政府擁有本發(fā)明的一定權(quán)利。
[0004] 優(yōu)先權(quán)要求
[0005] 本申請要求享有2009年12月2日提交的美國臨時申請?zhí)?1/266, 134的權(quán)益，在 此將其主題引入作為參考，如其在本文中被完整描述。
[0006] 背景
[0007] 抗體工程的進展已能開發(fā)具有不同藥物動力學(xué)和結(jié)合性質(zhì)的特征的多種抗體片 段（Wuetal2005、Wuetal2008、Wuetal2009)。微抗體是特征在于分子量（~80kD) 比全長抗體小同時保持對抗原的二價結(jié)合特性的抗體形式（Huetal1996)。由于其較小的 尺寸，微抗體的特征在于從系統(tǒng)的更快清除和靶向腫瘤組織時的增強滲透。在強靶向結(jié)合 迅速清除的能力下，微抗體是可用于診斷成像的優(yōu)化抗體形式（Wuetal2005)。自從發(fā)現(xiàn) 了抗腫瘤相關(guān)革E標(biāo)（tumorassociatedtarget)CEA的第一個微抗體，已開發(fā)了許多用于臨 床前診斷成像的抗不同癌靶標(biāo)的微抗體，包括乳腺癌中的人表皮生長因子受體-2 (HER2)、 非何杰金氏淋巴瘤中的B-淋巴細(xì)胞抗原CD20和前列腺癌中的前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA) (Huetal1996、Leytonetal2008、01afsenetal2004、01afsenetal2009)。例如， 已在臨床中評價123I標(biāo)記的CEA微抗體以用于通過SPECT使結(jié)直腸癌患者成像，并且已用 111In-DOTA標(biāo)記的微抗體進行了類似的研究（Wongetal2004)。新成像劑的開發(fā)對于用 現(xiàn)有技術(shù)成像不佳的特定癌癥如前列腺癌的診斷、控制和治療是尤為至關(guān)重要的。
[0008] 需要開發(fā)全部癌癥類型的成像劑從而能夠靶向、分期和監(jiān)測疾病?，F(xiàn)有的前列腺 癌診斷成像的方法仍相對不準(zhǔn)確。對于2006年評估的234, 460例新病例和27, 350例死亡， 需要能夠準(zhǔn)確診斷、分期和監(jiān)測前列腺癌癥的成像劑（Olsonetal2007)。
[0009] 前列腺特異性膜抗原（PSM)--與前列腺癌有關(guān)的細(xì)胞表面生物標(biāo)記（Slovin 2005)，是具有谷氨酸羧肽酶活性的單通道II型跨膜蛋白，雖然對PSM的功能性作用并不 十分了解（Olsonetal2007)。PSMA的表達(dá)在前列腺之外的正常組織，包括腦、小腸、肝、 近端腎小管和唾液腺中相對有限（Olsonetal2007)。
[0010] 前列腺癌中的PSM表達(dá)隨腫瘤的侵占性而增加，并在高級腫瘤、轉(zhuǎn)移性損傷和不 依賴于雄激素的疾病中最尚（Olsonetal2007)。因此，PSMA是癌癥生物標(biāo)記 成像 劑靶向的良好侯選物。PSMA表達(dá)也在多種非前列腺實體腫瘤的新血管系統(tǒng)中上調(diào)，該非前 列腺實體腫瘤包括肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌和胰腺癌以及肉瘤和黑素瘤（01sonet al2007)〇
[0011]已開發(fā)了靶向PSM的全長抗體，其中一些處于臨床前和臨床發(fā)展的不同階段(Olsonetal2007)。PSMA最初由鼠抗體（mAb) 7E11 限定，該鼠抗體（mAb) 7E1UI^ljPSMA 的胞內(nèi)表位（Olsonetal2007)。后來7EllmAb發(fā)展為FDA批準(zhǔn)的SPECT成像劑，稱為 Prostascint，用于在軟組織中檢測和成像前列腺癌（Olsonetal2007)。但是，由于7E11 識別胞內(nèi)表位，Prostascint是相對弱的成像劑，其被限于檢測壞死的腫瘤組織（Olsonet al2007)。Prostascint具有全長抗體的藥物動力學(xué)性質(zhì)，在注射與成像之間也需要長的 時間（Olsonetal2007)。此外，Prostascint是引起強免疫應(yīng)答的鼠抗體，阻燒多次給藥 (Olsonetal2007)〇
[0012] 另一種革E向PSMA的全長抗體--J591，被發(fā)現(xiàn)，并隨后去免疫（deimmunize)，去 免疫的形式稱為huJ591(Liuetal1997，Banderetal2003)。去免疫的huJ591是抗人PSMA抗體，其識別和結(jié)合PSMA的胞外表位（Banderetal2003)。huJ591抗體正被開發(fā)為 針對前列腺癌的潛在放射免疫治療劑。在I期試驗中，用發(fā)射T的同位素銦111和镥177 標(biāo)記的DOTA結(jié)合的huJ591抗體證實了優(yōu)良地靶向轉(zhuǎn)移部位、無免疫原性，并且良好地耐受 多次給藥（Banderetal2003、Milowskyetal2004、Banderetal2005、Olsonetal 2007)。除前列腺癌外，111In-DOTAhuJ591的I期研究證實了特異性靶向晚期實體腫瘤的腫 瘤新血管系統(tǒng)（Milowskyetal2007)。
[0013] 概述
[0014] 在一個實施方式中，提供了結(jié)合PSM的微抗體（minibody)。根據(jù)該實施方式， 微抗體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含能夠結(jié)合前列腺特異性膜抗原 (PSM)的scFv序列、人工鉸合（鉸鏈）序列和人IgGlCH3序列。微抗體單體還可包含N 端信號序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時能分泌微抗體。
[0015] 本文所述微抗體scFv包含通過連接序列連接至輕鏈可變區(qū)（VL)的重鏈可變區(qū) ⑶)。一方面，scFv為VHVL方向，以使VH在VL的上游。具有這種scFv的微抗體單體可具 有包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:2的核苷酸序列。另一方面，scFv為VLVH方向，以使VL在 VH的上游。
[0016] 微抗體單體可由細(xì)胞表達(dá)。在這種實施方式中，由細(xì)胞表達(dá)的CysDB單體可包含 氨基酸序列SEQIDN0:10 或SEQIDN0:11。
[0017] 在另一實施方式中，提供了結(jié)合PSMA的Cys-雙抗體（diabody) (CysDB)。根據(jù)該 實施方式，CysDB單體由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列自N端至C端包含能夠結(jié)合PSM的 scFv序列和半胱氨酸尾。CysDB還可包括N端信號序列，從而在細(xì)胞中表達(dá)時能分泌微抗 體。
[0018] 本文所述的CysDBscFv包含通過連接序列連接至輕鏈可變區(qū)（VL)的重鏈可變區(qū) (V?。一方面，scFv為VHVL方向，以使VH在VL的上游。具有這種scFv的CysDB單體可具 有包含SEQIDN0:6或SEQIDN0:7的核苷酸序列。另一方面，scFv為VLVH方向，以使VL在 VH的上游。具有這種scFv的CysDB單體可具有包含SEQIDN0:8或SEQIDN0:9的核苷酸序 列。
[0019] CysDB可由細(xì)胞表達(dá)。在一些實施方式中，由細(xì)胞表達(dá)的CysDB可包含氨基酸序列 SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或SEQIDN0:15。
[0020] 在另一實施方式中，提供了診斷個體中與PSM表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法。該方法包 括向患有或疑患與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌癥的個體給予結(jié)合于（綴合于）診斷劑的抗PSMA微 抗體或cys-雙抗體；使個體暴露于成像方法以在體內(nèi)顯現(xiàn)被標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體； 和當(dāng)標(biāo)記的微抗體或cys-雙抗體定位于腫瘤部位時，確定個體患有與PSMA表達(dá)有關(guān)的癌 癥。
[0021] 在另一實施方式中，提供了治療個體中與PSM表達(dá)有關(guān)的癌癥的方法。該方法包 括向個體給予治療有效量的藥物組合物，該組合物包含抗PSM微抗體或抗PSMcys-雙抗 體。一方面，抗PSMA微抗體或抗PSMAcyS-雙抗體結(jié)合至治療劑。
[0022] 個體中與PSM表達(dá)有關(guān)的癌癥可以是肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌、肝癌、膀胱 癌、胰腺癌或黑素瘤。
[0023] 可用于上述方法的微抗體可以是本文所述任何適當(dāng)?shù)奈⒖贵w，或可包含 SEQIDN0:10或SEQIDN0:11?？捎糜谏鲜龇椒ǖ腸ys-雙抗體可以是本文所述任何適當(dāng)?shù)奈?抗體，或可包含SEQIDN0:12、SEQIDN0:13、SEQIDN0:14 或SEQIDN0:15。
[0024] 附圖簡述
[0025] 圖IA是J591微抗體的示意圖。該圖顯示了以VHVL方向結(jié)合目標(biāo)PSMA的微抗體。
[0026] 圖IB是VHVL方向J591微抗體的表達(dá)構(gòu)建物的示意圖。SP=信號肽，VH-重鏈 可變區(qū)，VL-輕鏈可變區(qū)，L-18氨基酸連接體，H./E-人工鉸鏈/延伸，CH3來自人IgGl。
[0027]圖 2 是去免疫（第 3 行；SEQIDNO:5;SEQIDNO:I9)、鼠（第 2 行；SEQIDNO:4; SEQIDNO: 18)和人復(fù)合（第1行；SEQIDNO:3;SEQIDNO: 17)J591V區(qū)氨基酸序列之間 的比較。沿HC行（第1行）突出的殘基表示HC與鼠V區(qū)之間的差異。沿去免疫行（第 3行）突出的殘基表示最初去免疫過程導(dǎo)致的去免疫V區(qū)與鼠V區(qū)之間的差異。兩個星表 示通過去免疫被引入的兩個脯氨酸。
[0028] 圖3是J591人復(fù)合VHVL微抗體核苷酸序列（SEQIDNO:1)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基 酸序列（SEQIDN0:10)。
[0029] 圖4是J591 2PVHVL微抗體核苷酸序列（SEQIDNO: 2)和經(jīng)翻譯的相應(yīng)氨基酸 序列（SEQIDN0:11)。
[0030] 圖5是cys-雙抗體（CysDB)的示意圖⑷、VLVH方向CysDB的表達(dá)構(gòu)建物的示意 圖⑶和VHVL方向CysDB的表達(dá)構(gòu)建物的示意圖（C)JS=信號序列，VH=重鏈可變區(qū)，VL =輕鏈可變區(qū)，L連接體（可以是5或8個氨基酸），GGS=半胱氨酸尾部（Gly-Gly-Cys)。
[0031] 圖6是J591cys-雙抗體（CysDB)VH-5-VL核苷酸序列（SEQIDN0:6)和經(jīng)翻譯 的相應(yīng)氨基酸序列（SEQIDNO: 12)。
[0032] 圖7是J591cys-雙抗體（CysDB)VH-8-VL核苷酸序列（SEQIDN0:7)和經(jīng)翻譯 的相應(yīng)氨基酸序列（SEQIDNO: 13)。
[0033] 圖8是J591cys-雙抗體（CysDB)VL-5-VH核苷酸序列（SEQIDN0:8)和經(jīng)翻譯 的相應(yīng)氨基酸序列（SEQIDNO: 14)。
[0034] 圖9是J591cys-雙抗體（CysDB)VL-8-VH核苷酸序列（SEQIDN0:9)和經(jīng)翻譯 的相應(yīng)氨基酸序列（SEQIDNO: 15)。
[0035]圖10是A、B、C形式的pcDNA3.l/myc-His(_)的載體圖譜。來自Invitrogen Corp.的這種表達(dá)載體的特征在于用于哺乳動物表達(dá)的CMV啟動子和用于選擇的新霉素抗 性。
[0036] 圖11是確定CH0-K1細(xì)胞表達(dá)J591微抗體的代表性免疫印跡分析。第1泳道相應(yīng) 于分子量標(biāo)記樣本，第2泳道相應(yīng)于空白載體樣本，第3泳道相應(yīng)于陽性對照微抗體樣本， 第4泳道相應(yīng)于J591HCVLVH樣本，第5泳道相應(yīng)于J591HCVHVL樣本，第6泳道相應(yīng)于 J591 2PVLVH樣本，第7泳道相應(yīng)于J591 2PVHVL樣本。
[0037] 圖12A-D是表示J591微抗體的流式細(xì)胞計量分析的圖。柱狀圖將細(xì)胞計數(shù)相對 于PE信號（FL2-H)作圖。圖12A顯示了表示J591HCVLVH微抗體的流式細(xì)胞計量分析的 圖，圖12B顯示了表示J591HCVHVL微抗體的流式細(xì)胞計量分析的圖，圖12C顯示了表示 J591 2PVLVH微抗體的流式細(xì)胞計量分析的圖，圖12D顯示了表示J591 2PVHVL微抗體的 流式細(xì)胞計量分析的圖。
[0038] 圖13是純化的J591微抗體的SDS-PAGE分析。純化的J591微抗體蛋白在非還 原條件（第1列）和還原條件（第2列）下被裝載于SDS-PAGE凝膠上。凝膠用GelCode Blue(Pierce，ThermoScientific)染色。微抗體以1/5稀釋，以裝載于凝膠上。
[0039] 圖14是純化的J591微抗體的尺寸排阻層析（SEC)分析。該圖將220nmUV吸光 度（mAU)相對于時間（min)作圖。4ygJ591微抗體被裝載于TSK-GELSuperSW3000柱 上。使蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品也在柱上單獨運行以提供參照。聚集體相對于微抗體蛋白（在 此被標(biāo)記為單體）的百分比通過計算曲線下的面積確定。
[0040] 圖15通過ELISA示例了J591微抗體蛋白結(jié)合PSMA。以Iyg/ml的純化重組PSMA 蛋白包被96孔ELISA板。將純化的J591微抗體蛋白（1，?）以2yg/ml的初始濃度引入， 并由第三稀釋液連續(xù)稀釋10倍。對陰性對照微抗體（2, )進行同樣的稀釋。樣本各稀釋 重復(fù)三次進行，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。最初溫育后，用結(jié)合堿性磷酸酶的山羊抗人IgG(Fc 特異的）抗體檢測結(jié)合的微抗體，并將其用PNPP溶液顯像。在405nm下檢測吸光度。
[0041 ] 圖16A-D是表示流式細(xì)胞計量分析的圖，示例了J591微抗體結(jié)合PSMA+細(xì)胞系。 所有柱狀圖將細(xì)胞計數(shù)相對于PE信號（FL2-H)作圖。對J591微抗體蛋白和陰性對照微抗 體（1)均以20yg/ml測試其結(jié)合PSM+細(xì)胞系LNCaP(A和B)和CWR22rvl(C和D)。細(xì)胞 隨后用二級抗人IgG(Fe特異的）-PE結(jié)合的抗體染色。IXIO5個細(xì)胞/點和以5, 000事件 /點進行分析。（A)J591微抗體（2)結(jié)合LNCaP細(xì)胞（B)J591-D0TA微抗體（2)結(jié)合LNCaP 細(xì)胞（C)J591微抗體（2)結(jié)合CWR細(xì)胞（D)J591-D0TA微抗體（2)結(jié)合CWR細(xì)胞。
[0042] 圖17是顯示J591微抗體在LNCaP細(xì)胞中內(nèi)化的代表性圖像。將LNCaP細(xì)胞在12 孔板中聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上鋪平。生長2天后，將細(xì)胞在4°C下預(yù)冷30分鐘，然 后用一級抗體或微抗體在4°C下溫育30分鐘。在最初溫育后的所示時間點，將細(xì)胞固定， 透化，并用二級抗人IgG-Alexa488染色。同時將蓋玻片置于載玻片上，并在封固介質(zhì)中用 DAPI復(fù)染。用63X油浸沒透鏡在LeicaSP2-1P-FCS共焦顯微鏡上觀察載玻片。
[0043] 圖18是顯示J591微抗體在CWR22rvl細(xì)胞中內(nèi)化的代表性圖像。將CWR22rvl細(xì) 胞在12孔板中聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上鋪平。生長2天后，將細(xì)胞在4°C下預(yù)冷30分 鐘，然后用一級抗體或微抗體在4°C下溫育30分鐘。在最初溫育后的所示時間點，將細(xì)胞固 定，透化，并用二級抗人IgG-Alexa488染色。同時將蓋玻片置于載玻片上，并在封固介質(zhì) 中用DAPI復(fù)染。用63X油浸沒透鏡在LeicaSP2-1P-FCS共焦顯微鏡上觀察載玻片。
[0044] 圖19是示例131I標(biāo)記的J591微抗體和111In-DOTA標(biāo)記的J591微抗體的細(xì)胞相關(guān) 放射活性的獲取和保留的圖。細(xì)胞相關(guān)放射活性在結(jié)合CWR22rvl細(xì)胞時隨時間的獲取和 保留。細(xì)胞膜、細(xì)胞溶胞產(chǎn)物（內(nèi)化）和所有（膜+內(nèi)化）部分的放射活性表示為每分鐘 的計數(shù)（cpm)。在實驗前一天將CWR22rvl細(xì)胞接種于24孔板中，5XIO5個細(xì)胞/孔。將 細(xì)胞在4°C下預(yù)冷，然后用過量（A) 131I標(biāo)記的J591微抗體或（B) 111In-DOTA標(biāo)記的J591微 抗體溫育。在每個時間點，去除含有放射標(biāo)記微抗體的上清液，用酸性甘氨酸緩沖液清除 細(xì)胞以得到膜部分，并溶解細(xì)胞。各時間點進行三次。Y-條表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。