專(zhuān)利名稱：可溶性sars病毒核衣殼蛋白的表達(dá)和純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及在宿主細(xì)胞中可溶性SARS病毒核衣殼蛋白(SARS Nucleocapsid protein)的表達(dá)和純化。
背景技術(shù)：
自2002年底至2003年初，一種被稱為“非典型肺炎(severe acuterespiratory syndrome，SARS)”的病例在我國(guó)廣東省被首次發(fā)現(xiàn)，隨后在世界30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)爆發(fā)，SARS在我國(guó)內(nèi)地的北京、山西、內(nèi)蒙等25個(gè)省市自治區(qū)“肆意橫行”，對(duì)我國(guó)人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。SARS是一種傳染性強(qiáng)、生存強(qiáng)、致死率高的新型病毒，截止到2003年5月19日，全球累計(jì)報(bào)告病例已達(dá)7864人，死亡病例643人。SARS已被世界公認(rèn)為人類(lèi)的共同敵人。SARS爆發(fā)后，引起了各國(guó)政府和研究機(jī)構(gòu)的高度重視，世界衛(wèi)生組織(WHO)已派遣技術(shù)人員前往疫區(qū)指導(dǎo)防治工作，各國(guó)科研人員緊密合作，共同尋找SARS的病原體和防治方法。經(jīng)過(guò)多國(guó)科研人員的努力，終于發(fā)現(xiàn)SARS冠狀病毒(Coronavirus)是SARS感染、病人發(fā)病和致死的元兇。SARS病毒的全基因組已分別被加拿大、美國(guó)和中國(guó)的科學(xué)家測(cè)定，這對(duì)于研究SARS病毒的致病機(jī)理以設(shè)計(jì)抗SARS藥物具有重要意義。
核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，簡(jiǎn)稱N蛋白)是冠狀病毒(Coronavirus)的一種重要結(jié)構(gòu)蛋白。在成熟的病毒顆粒中，N蛋白和RNA結(jié)合位于病毒顆粒的核心。N蛋白在冠狀病毒的生理過(guò)程中有兩個(gè)方面的作用1、在病毒包裝的過(guò)程中和病毒RNA結(jié)合并與M蛋白(small membrane protein)相互作用使病毒RNA和N蛋白復(fù)合體被包裹進(jìn)病毒衣殼中。2、在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中與mRNA有相互作用，可能影響病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。在前一個(gè)過(guò)程中，存在一個(gè)N蛋白和病毒RNA相互識(shí)別的過(guò)程。N蛋白只會(huì)和完整的病毒RNA結(jié)合，也只有這樣的復(fù)合體才會(huì)被M蛋白包裹起來(lái)。一般認(rèn)為，N蛋白通過(guò)識(shí)別病毒RNA中一個(gè)CDS-orflab 3’端的一段核酸序列(packagingsignal)來(lái)區(qū)別完整的病毒RNA和RNA片斷。在鼠肝炎病毒(murine hepatitisvirus)中的研究表明packaging signal位于病毒RNA 20304-20364的位置，長(zhǎng)為69nt。對(duì)鼠肝炎病毒N蛋白的研究表明，N蛋白存在三個(gè)保守的區(qū)域(domain)，位于第二個(gè)區(qū)域中的一段序列(177-231)具有RNA結(jié)合活性，序列中存在SRXX的特征序列。因此N蛋白對(duì)于病毒基因組RNA特征性序列的識(shí)別及其與其他結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用，對(duì)于病毒粒子的準(zhǔn)確組裝有著重要意義。
SARS冠狀病毒N蛋白是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)區(qū)第二大編碼蛋白，長(zhǎng)度為423個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)50種N蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析，這50種N蛋白分成三枝，而SARS的N蛋白并不屬于這三枝，因此從由N蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)中可以看出SARS在進(jìn)化上是一個(gè)特殊的病毒。通過(guò)對(duì)SARS病毒(SARS virus)、人冠狀病毒229E(Human coronavirus 229E)、鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus)、牛冠狀病毒(Bovine coronavirus)、鳥(niǎo)感染性支氣管炎病毒(Avian infectiousbronchitis Virus)的N蛋白的氨基酸序列比對(duì)，盡管N蛋白整體氨基酸同源性很低，但是存在兩個(gè)保守氨基酸集中的區(qū)域，其生物學(xué)意義不明。經(jīng)同源比較發(fā)現(xiàn)SARS病毒N蛋白的178-205aa位，也就是在第一個(gè)保守氨基酸集中區(qū)域的末尾，存在一個(gè)SRXX富集區(qū)，而鼠肝炎病毒的相應(yīng)區(qū)域正好是其RNA結(jié)合區(qū)，因而推測(cè)該區(qū)域有可能是SARS病毒N蛋白的RNA結(jié)合區(qū)的一部分。
另外研究還發(fā)現(xiàn)，在N蛋白373-389位附近，存在一個(gè)賴氨酸富集區(qū)(KKKKTDEAQPLPQRQKK/KTFPPTEPKKDKKKKTD)，該區(qū)域符合核轉(zhuǎn)移信號(hào)的基本特征。這一特征的生物學(xué)意義尚不能確定，既有可能是N蛋白核病毒RNA相互作用的證據(jù)，也可能意味著N蛋白能轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入宿主細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮某種核蛋白的作用。上述推測(cè)，還有待更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。
因此，在體外大量表達(dá)和純化可溶性SARS病毒N蛋白以探索其重要的生物學(xué)功能將具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本發(fā)明者經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所積累的獨(dú)特相關(guān)技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，在宿主細(xì)胞中成功表達(dá)和純化了可溶性SARS病毒N蛋白，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供可溶性SARS病毒N蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)方法。
本發(fā)明的還有一個(gè)目的是提供SARS病毒N蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面提供可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的表達(dá)質(zhì)粒N-pQE30，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，分類(lèi)名稱為大腸桿菌M15/pQE30-SARS-N，保藏日2003年5月30日，保藏號(hào)CCTCC No.M203046。
本發(fā)明的另一個(gè)方面提供用質(zhì)粒N-pQE30轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
本發(fā)明的再一個(gè)方面提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步驟1)采用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫(kù)中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；2)用pQE30載體構(gòu)建SARS病毒N蛋白表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N；3)將pQE30-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的還有一個(gè)方面提供可溶性SARS病毒N蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括細(xì)胞裂解、裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1所示為可溶性SARS病毒N蛋白表達(dá)質(zhì)粒(N-pQE30)構(gòu)建示意圖。
圖2所示為SARS病毒N蛋白PCR產(chǎn)物DNA電泳分析圖譜。
圖3所示為克隆產(chǎn)物的PCR鑒定圖。
圖4所示為克隆產(chǎn)物的酶切鑒定圖。
圖5所示為N-pQE30測(cè)序報(bào)告。
圖6所示為SARS病毒N蛋白純化產(chǎn)物蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺電泳分析圖譜。圖中，M為標(biāo)記物(Marker)；E2，含咪唑的N蛋白粗提物；E3-E6為經(jīng)分子篩純化后的N蛋白。
圖7所示為SARS病毒N蛋白純化產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用總離子流圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 SARS病毒N蛋白表達(dá)質(zhì)粒(N-pQE30)的構(gòu)建利用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫(kù)中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(基因序列依據(jù)TRO2)，按圖1所示，構(gòu)建表達(dá)可溶性的SARS病毒N蛋白的表達(dá)質(zhì)粒(N-pQE30)。
1)設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增N蛋白的序列引物序列FW5’ATTAGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCA 3’RV5’TTAAGTCGACTGCCTGAGTTGAATCAGCAGA 3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)模板2μl；10×緩沖液(PyrobesTMbuffer)10μl；dNTP(2.5mM)8μl；FW4μl；RV4μl；高保真DNA聚合酶(pyrobest DNA polymerase)1μl；水71μl。
反應(yīng)條件95℃ 8分鐘；(95℃ 1分鐘；60℃ 1分鐘；72℃ 2分鐘)30循環(huán)；72℃ 10分鐘。
圖2所示為SARS病毒N蛋白PCR產(chǎn)物DNA電泳分析圖譜。
2)將N的PCR產(chǎn)物克隆到pQE30載體上N的PCR產(chǎn)物和pQE30分別用BamHI和SalI酶切(實(shí)驗(yàn)方法參照《分子克隆》第二版)；用試劑盒(華舜公司)回收酶切產(chǎn)物(回收N的PCR酶切產(chǎn)物近1300bp；pQE30酶切產(chǎn)物近3.5kb)；用T4DNA連接酶連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞M15；挑選正確的克隆(PCR篩選和酶切鑒定)。
PCR鑒定利用N蛋白的特異性引物篩選正確的克隆。正確的克隆應(yīng)擴(kuò)增出近1300bp的片段(實(shí)驗(yàn)方法和以上PCR反應(yīng)的方法一致)。結(jié)果，在克隆產(chǎn)物的PCR鑒定圖(圖3)上顯示有正確的克隆。
酶切鑒定(實(shí)驗(yàn)方法參照《分子克隆》第二版)HindIII在基因內(nèi)部353bp，在載體上也有一個(gè)HindIII的酶切位點(diǎn)，正確的克隆應(yīng)切出一條900bp左右的片段。經(jīng)進(jìn)一步酶切鑒定結(jié)果顯示，確實(shí)有正確的克隆(見(jiàn)圖4)。
DNA測(cè)序報(bào)告N-pQE30表達(dá)載體測(cè)序報(bào)告如圖5所示，N-pQE30DNA測(cè)序結(jié)果和N蛋白原DNA序列比較，第1125位(以N蛋白原序列的序列號(hào)為準(zhǔn))的G，在所測(cè)的11號(hào)克隆中相應(yīng)處為A，這個(gè)堿基位于密碼子的第三位，并不影響氨基酸編碼。
實(shí)施例2 可溶性SARS病毒N蛋白的表達(dá)將N-pQE30質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌M15中，IPTG(濃度0.8mM)誘導(dǎo)，氨芐西林和卡那霉素為雙抗生素，溫度30℃，表達(dá)時(shí)間10小時(shí)。在上述表達(dá)條件下，6升LB培養(yǎng)基經(jīng)4℃、4000rpm離心30分鐘后，將得到的18克細(xì)菌沉淀物以每份3克分裝，-80℃保存。
實(shí)施例3 表達(dá)產(chǎn)物的純化在4℃下，將3克細(xì)菌沉淀物懸浮于15mL裂解緩沖溶液(50mMTris-HCl，pH＝8.0，300mM NaCl，1mM EDTA，1mM PMSF)中，超聲波破碎(超聲強(qiáng)度200～300W；超聲環(huán)境冰水混合物；總超聲時(shí)間15分鐘，每超聲1.5分鐘間隙1分鐘)。經(jīng)4℃、15,000rpm超速離心1小時(shí)后，棄去沉淀物。將得到的14mL上清液在4℃下透析(透析緩沖液PBS，10mM咪唑)過(guò)夜后，用NTA-Ni柱(Pharmacia公司產(chǎn)品)純化蛋白，其中洗滌緩沖液為，PBS+60mM咪唑；洗脫緩沖液為，PBS+500mM咪唑。將得到的10mL蛋白粗提物經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)FPLC(Pharmacia公司產(chǎn)品)分子篩進(jìn)一步純化得到純SARS病毒N蛋白(如圖6所示)。
實(shí)施例4 SARS病毒N蛋白質(zhì)譜檢測(cè)1)N蛋白序列MRGSHHHHHH GSSDNGPQSN QRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPK QRRPQGLPNN60TASWFTALTQ HGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGD GKMKELSPRW120YFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGT RNPNNNAATVLQLPQGTTLP180
KGFYAEGSRG GSQASSRSSS RSRGNSRNST PGSSRGNSPA RMASGGGETA LALLLLDRLN 240QLESKVSGKG QQQQGQTVTK KSAAEASKKP RQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGD300QDLIRQGTDY KHWPQIAQFA PSASAFFGMS RIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKD360NVILLNKHID AYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQ 420NSMSGASADS TQAGRPAAKL N4412)N蛋白的酶解(膠內(nèi)酶解)A.切下考馬斯蘭染色膠帶，置于離心管中，用30％ACN/100mM NH4HCO3脫色至膠帶呈無(wú)色透明狀。
B.棄去上清，加入100mM的NH4HCO3(pH8.3)，平衡5分鐘。
C.棄去上清，加入ACN脫水3分鐘。
D.棄去上清，冷凍干燥。
E.將干燥好的膠用50mM NH4HCO3浸潤(rùn)，加入胰蛋白酶至酶物比為1∶30(W/W)；輕輕渦旋混合。
F.35℃保溫，反應(yīng)過(guò)夜。
G.吸出上清，置于另一離心管1。
H.用60％ACN(0.1％TFA)提取肽段三次，提取液與前一次的上清合并置于離心管。
J.濃縮至15μ1，進(jìn)行LC-MS檢測(cè)。
3)N蛋白液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析HPLC儀采用Agilent HP1100質(zhì)譜儀LCQ Deca ion-trap質(zhì)譜儀(Finnigan公司)液相柱C830×2.1mmID，Tum(AQUAPORE，RP-300)流動(dòng)相AH2O(0.1％HCOOH)，BACN(0.1％HCOOH)
時(shí)間(分鐘) A B0 95％ 5％2 95％ 5％15 85％ 15％35 50％ 50％45 5％ 95％47 5％ 95％53 95％ 5％60 95％ 5％質(zhì)譜電噴霧電離電壓(ESI voltage)5KV毛細(xì)管電壓(capillary voltage)3V毛細(xì)管溫度(capillary temperature)220℃鞘氣(sheat gas)流速40arb輔助氣(Aux gas)流速3arb覆蓋率202/441＝45.81％N蛋白酶解后液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)分析結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 N蛋白經(jīng)酶解后所得肽段及相關(guān)信息

產(chǎn)業(yè)上利用的可能性利用本發(fā)明可在宿主細(xì)胞中獲得大量的可溶性SARS病毒N蛋白(如，在大腸桿菌中，每升LB培養(yǎng)基可生產(chǎn)15毫克N蛋白)，利用NTA-Ni柱層析和分子篩提純方法即可得到純化的蛋白。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單、蛋白純度高等特點(diǎn)。
利用本發(fā)明得到的SARS病毒N蛋白可用于1)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面的研究A.培養(yǎng)SARS病毒N蛋白晶體，通過(guò)X-射線晶體衍射技術(shù)解析SARS病毒N蛋白晶體結(jié)構(gòu)；B.開(kāi)展NMR研究，以探求SARS病毒N蛋白溶液狀態(tài)下的三維結(jié)構(gòu)。
2)與人體重要蛋白相互作用研究利用本發(fā)明得到的SARS病毒N蛋白以及生物物理技術(shù)可開(kāi)展與人體重要蛋白(如免疫系統(tǒng))相互作用研究，以探索SARS病毒感染人體正常細(xì)胞的途徑，為抗SARS藥物設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
3)SARS診斷抗體研究利用本發(fā)明得到的SARS病毒N蛋白與其他生物工程技術(shù)相結(jié)合，可開(kāi)展SARS診斷抗體研究。
序列表CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACAAAACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGA GGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
權(quán)利要求
1.可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號(hào)CCTCC No.M203046。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)質(zhì)粒，含有如下序列CTCGAGAAATCATAAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATAGATTCAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCTCTGATAATGGACCCCAATCAAACCAACGTAGTGCCCCCCGCATTACATTTGGTGGACCCACAGATTCAACTGACAATAACCAGAATGGAGGACGCAATGGGGCAAGGCCAAAACAGCGCCGACCCCAAGGTTTACCCAATAATACTGCGTCTTGGTTCACAGCTCTCACTCAGCATGGCAAGGAGGAACTTAGATTCCCTCGAGGCCAGGGCGTTCCAATCAACACCAATAGTGGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCCGACGAGTTCGTGGTGGTGACGGCAAAATGAAAGAGCTCAGCCCCAGATGGTACTTCTATTACCTAGGAACTGGCCCAGAAGCTTCACTTCCCTACGGCGCTAACAAAGAAGGCATCGTATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCCAAAGACCACATTGGCACCCGCAATCCTAATAACAATGCTGCCA CCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGCTTCTACGCAGAGGGAAGCAGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGCTCCTCATCACGTAGTCGCGGTAATTCAAGAAATTCAACTCCTGGCAGCAGTAGGGGAAATTCTCCTGCTCGAATGGCTAGCGGAGGTGGTGAAACTGCCCTCGCGCTATTGCTGCTAGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAGTTTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCATCTAAAAAGCCTCGCCAAAAACGTACTGCCACA4AACAGTACAACGTCACTCAAGCATTTGGGAGACGTGGTCCAGAACAA4CCCAAGGAAATTTCGGGGACCAAGACCTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCTCCAAGTGCCTCTGCATTCTTTGGAATGTCACGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACATGGCTGACTTATCATGGAGCCATTAAATTGGATGACAAAGATCCACAATTCAAAGACAACGTCATACTGCTGAACAAGCACATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAAAAAACTGATGAAGCTCAGCCTTTGCCGCAGAGACAAAAGAAGCAGCCCACTGTGACTCTTCTTCCTGCGGCTGACATGGATGATTTCTCCAGACAACTTCAAAATTCCATGAGTGGAGCTTCTGCTGATTCAACTCAGGCAGTCGACCTGCAGCCAAGCTTAATTAGCTGAGCTTGGACTCCTGTTGATAGATCCAGTAATGACCTCAGAACTCCATCTGGATTTGTTCAGAACGCTCGGTTGCCGCCGGGCGTTTTTTATTGGTGAGAATCCAAGCTAGCTTGGCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTTCGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACGATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGGTTTATTGAGAATTGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATATGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAGTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGGGTAATGACTCTCTAGCTTGAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCCTCTAGAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAC
3.一種用權(quán)利要求1所述表達(dá)質(zhì)粒N-pQE30轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
6.在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括以下步驟1)用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫(kù)中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段；2)用pQE30載體構(gòu)建SARS病毒N蛋白表達(dá)質(zhì)粒pQE30-N；3)將pQE30-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。
7.可溶性SARS病毒N蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括將細(xì)胞裂解液透析、NTA-Ni柱層析和分子篩純化。
全文摘要
本發(fā)明提供可在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的表達(dá)質(zhì)粒N－pQE30(保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2003年5月30日，保藏號(hào)CCTCC No.M203046)。還提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)可溶性SARS病毒N蛋白的方法，包括采用PCR技術(shù)從SARS病毒cDNA文庫(kù)中獲得SARS病毒N蛋白DNA片段(TRO2)；用pQE30載體構(gòu)建SARS病毒N蛋白表達(dá)質(zhì)粒pQE30－N；和將pQE30－N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于宿主細(xì)胞中，并在宿主細(xì)胞中表達(dá)。進(jìn)一步提供可溶性SARS病毒N蛋白表達(dá)產(chǎn)物的純化方法，包括將細(xì)胞裂解液進(jìn)行透析、NTA－Ni柱層析和分子篩純化。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單、得到的蛋白純度高。
文檔編號(hào)C07K14/165GK1472318SQ0312907
公開(kāi)日2004年2月4日 申請(qǐng)日期2003年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月2日
發(fā)明者沈旭, 蔣華良, 陳克勤, 陳靜, 沈建華, 羅小民, 陳凱先, 莊賢韓, 沈 旭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所, 上海先導(dǎo)藥業(yè)有限公司, 上海單抗制藥技術(shù)有限公司