專利名稱：一類稀土配合物及其制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技木領(lǐng)域本發(fā)明涉及一類稀土配合物及其制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知；中國是稀土礦藏的貯藏大國，也是稀土化合物的生產(chǎn)大國，每年有大量的初級稀土化合物出口。國內(nèi)外有相當(dāng)數(shù)量的科學(xué)家從事稀土化合物的應(yīng)用研究，目前稀土化合物在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)藥業(yè)中有廣泛用途。研究稀土化合物的新用途對于利用我國豐富的稀土資源、化資源優(yōu)勢為經(jīng)濟優(yōu)勢有相當(dāng)重要的意義！從化學(xué)角度看，稀土元素包括鈧、釔和鑭系共16個元素，由于它們離子電荷相同、半徑接近，所以性質(zhì)非常相似。
隨著人類生存環(huán)境的日益惡化，腫瘤的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，也成為危害人類生命與健康的第二大因素。盡管目前抗腫瘤藥物很多，但多存在毒副作用大、價格昂貴等缺點。稀土元素在人體內(nèi)與體內(nèi)各種生物大分子以配合物的形式結(jié)合，可對多種酶的活性產(chǎn)生影響(譚欽德.生物無機化學(xué)導(dǎo)論.廣東高等教育出版社.1993)。日本科學(xué)家將鈰、銩、镥配合物瞄準(zhǔn)艾滋病毒和癌等目標(biāo)的基因并將其剪斷，研究用稀土配合物治療艾滋病和癌癥(熊鈞.稀土.1993，14(4)；71)。王剛等用纈氮酸-N-荒氨酸鎳與稀士配合物進行抗癌性研究(王剛等.蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版).1995，31(4)；194-196)。稀土配合物作為無機抗腫瘤藥物的前景十分廣闊。
技術(shù)內(nèi)容及其它本發(fā)明的目的在于提供一類稀土配合物及其制備方注和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
一類稀土配合物硝酸一硝酸根.二鄰菲羅啉.三5-氟尿嘧啶合稀土(III)的制備方法，其特征在于用摩爾比為1∶2∶3的稀土硝酸鹽、鄰菲羅啉、5-氟尿嘧啶在無水乙醇中，在加熱到80℃并攪拌下進行反應(yīng)。
本發(fā)明的一類稀士配合物硝酸一硝酸根.二鄰菲羅啉.三5-氟尿嘧啶合稀土(III)的制備方法就是；先將稀土硝酸鹽、5-氟尿嘧啶按1∶3摩爾比放入無水乙醇中，在加熱到80℃并攪拌下讓其溶解完全，再加入2摩爾比的鄰菲羅啉(先用無水乙醇溶解或用固體均可)。很快就有沉淀生成，讓反應(yīng)在上述條件下進行3-5小時。停止反應(yīng)后將反應(yīng)器置于冰箱中放置10小時左右，取出過濾后用無水乙醇洗滌2-3次，干燥后得產(chǎn)品稀土配合物硝酸一硝酸根二鄰菲羅啉三5.氟尿嘧啶合稀土(III)?；瘜W(xué)反應(yīng)方程式如下總共合成了七種稀土配合物，即釔(Y)、鑭(La)、鈰(Ce)、釤(Sm)、釓(Gd)、鏑(Dy)、鉺(Er)配合物。用EDTA直接滴定法測定了產(chǎn)品的稀土百分含量；用DDS-11A型電導(dǎo)率儀測定七種稀士配合物在水中的電導(dǎo)率；由中科院昆明植物研究所用PE-240C型元素分析儀測定七種稀士配合物的碳、氫、氮百分含量。上述實驗數(shù)據(jù)與按[Ln(Phen)2(5.Fu)3(NO3)](NO3)2理論值對比如表1。由中科院昆明植物研究所用Bio-Rad FTS-135型富利葉紅外光譜儀測定了釔、釤、鏑配合物的紅外光譜圖；由昆明貴金屬研究所用NICOLET FT-IR型富利葉紅外光譜儀測定了鑭、鈰、釓、鉺配合物的紅外光譜圖。
由云南師大分析測試中心用日本島津熱分析儀對七種稀士配合物進行了熱分析，表2列出熱分析結(jié)果。由中科院昆明植物研究所用DRX-500型核磁共振儀測定了釓配合物的核磁共娠譜。
表1七種稀土配合物的稀土、碳、氫、氮百分含量，電導(dǎo)率配合物 釔配合物鑭配合物鈰配合物釤配合物釓配合物鏑配合物鉺配合物稀土％理論值 8.6712.9113.01 13.8414.38 14.78 15.15測定值 8.4012.8313.22 13.3314.75 14.47 15.25碳％ 理論值 42.16 40.2040.15 39.7839.52 39.34 39.17測定值 40.13 39.5240.52 39.2239.29 39.11 37.17氫％ 理論值 2.452.37 2.37 2.31 2.30 2.29 2.28測定值 2.402.23 2.17 2.40 2.27 2.28 2.22氮％ 理論值 17.75 16.9216.90 16.7616.64 16.56 16.49測定值 17.66 17.4016.85 17.0817.12 16.91 16.00電導(dǎo)率(MG/cm.mmol)268.7 306.7293.6 267.6242.4 239.8 242.1如表1中電導(dǎo)率可知七種稀土配合物的電導(dǎo)率在239.8-306.7之問，即在235-273之間或接近于273，均可認(rèn)為七種稀十配合物屬1∶2型配合物；由七種稀土配合物的稀土、碳、氫、氮百分含量理論值與測定值對比，可初步認(rèn)為配合物分子式為[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
表2七種稀土配合物的熱分析結(jié)果配合物 釔配合物 鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物取樣量(mg)5.7 5.75.3 4.72 5.39 6.01 5.52一次分解溫度(℃) 237-252 228-243238-252 236-254244-259 236-255 236-250一次失重(％) 35.0823.66 37.7436.94 33.6335.86 26.04一次分解熱峰值(℃)252.1245.4 250.9251.1 259.9251.9 250.0二次分解溫度(℃) 252-670 245-514252-563 254-553259-572 255-610 250-627二次失重(％) 48.5058.24 43.6247.6742.8843.6648.68二次分解熱峰值(℃)594.1492.7 462.0543.7527.2559.7586.0最經(jīng)溫度(℃) 800 949798 888 798.1888.3798失重總量(％) 85.8283.73 83.7285.8076.5379.5574.72配合物的熱分析表明；七種稀土配合物在228-244℃開始分解，798-940℃分解趨于完全，最終殘渣為Ln2O3。差熱曲線上245-259℃和462-594℃左右有兩個較大的放熱峰?？烧J(rèn)為七種稀士配合物為配合物而非混合物。
圖1為釔配合物的紅外光譜圖。
圖2為鑭配合物的紅外光譜圖。
圖3為鈰配合物的紅外光譜圖。
圖4為釤配合物的紅外光譜圖。
圖5為釓配合物的紅外光譜圖。
圖6為鏑配合物的紅外光譜圖。
圖7為餌配合物的紅外光譜圖。
圖8為釓配合物、5.氟尿嘧啶、鄰菲羅淋的13C核磁共振光譜圖。


1；由附圖1-7可總結(jié)出表3。
表3七種稀土配合物的紅外光譜基團 配體、中心離子釔配合物鑭配合物鈰配合物釤配合物釓配合物鏑配合物餌配合物VC2＝O 1730(5-Fu) 1712 1712 1712 172217111721 1711VC4＝O+v C-C1675(5-Fu) 1666 1685 1680 166016851663 1686vC＝N1605(Phen) 1593 1592 1592 159115931592 1593vC＝C1545(Phen) 1508 1518 1517 15011508vN＝ONO3配位 1486 1483 1492 145114901489 1491vNO2配位 1320 1298 1296 130513091318 1322vNO2配位 1033 1030 1029 103010321033 1035vNO 末配位 1383 1384 1384 138313841383 1384σC～H(面外) 851(Phen)843847 845843 845 843 845739(Phen)726731 731726 726 727 728vLn～O419409 416417 418 419 416由表中數(shù)據(jù)可知；七種稀土配合物的紅外光譜是相似的。三種配體的特征吸收峰在譜圖中明顯可見，其中有的吸收峰的位置和強度發(fā)生了變化，同時譜圖中還出現(xiàn)了新的吸收峰，說明稀土離子與三種配體間確實發(fā)生了相互作用。5.氟尿嘧啶的VC2＝O和VC4＝O+vC-C峰在配合物中都發(fā)生了紅移，4-酮基位移較大，很可能與稀士離子配位的是4-酮基上的氧。鄰菲羅啉的σC～H(面外)、vC＝N、vC＝C都發(fā)生了紅移，表明其兩個氮原子參與配位。在配合物譜圖中還出現(xiàn)了表明硝酸根配位的三個吸收峰，另外在配合物譜圖中在415cm-1附近出現(xiàn)了配體沒有的新吸收峰，可歸屬為vLn～O。

2由附圖8(c)可知，由于分子的對稱性，鄰菲羅啉的12個碳原子有6條譜線。在配合物中鄰菲羅啉6條譜線的化學(xué)位移略有變化，可認(rèn)為鄰菲羅啉的兩個氮原子與稀土離子配位所引起。附圖8(b)中譜線可依據(jù)13C-19F之間的偶合來歸屬；C4＝O中的C4與F原子二鍵偶合，在圖上以δ＝157.99為中心的二重峰，2JC-F＝25.74Hz，處于最低場；C2＝O中的C2表現(xiàn)為單峰，δ＝150.12；C5與F原子直接相連，在圖上以δ＝139.90為中心的二重峰，2JC-F＝27.46Hz；C6在最高場，在圖上以δ＝126.27為中心的二重峰，1JC-F＝31.85Hz。而在配合物中，C4峰向高場移動，由于不存在NOF效應(yīng)，報據(jù)各個碳峰強度大小的比較，可能移至δ＝123.46與鄰菲羅啉的C3-C8的譜線重合，化學(xué)位移減小了34.53ppm，這是由于C4＝O同釓離子配位所致，由于氧原子配位，C4＝O具有部分單鍵的特征，C4上的電子密度增大，C4原子屏蔽增加，化學(xué)位移向高場移動，這與紅外光譜分析是一致的。5-氟尿嘧啶其余峰的化學(xué)位移在配合物中變化不大，C2峰與鄰菲羅啉的C2-C9峰重合，C6峰與鄰菲羅啉的C5-C6峰重合。
本發(fā)明的目的還在于將此類稀土配合物作為一類治療腫瘤有效、低毒而價廉的新藥品。
本發(fā)明用此類稀土配合物研究其體外抗腫瘤活性、急性毒性、小鼠體內(nèi)抗腫瘤活性、人胃癌裸鼠移植瘤體內(nèi)抗腫瘤活性?，F(xiàn)分述如下一、稀土配合物和配體5-氟尿嘧啶的體外抗腫瘤活性(一)實驗材料1.測試樣品鑭、鈰、釔、釤、鏑、鉺、釓七個稀土配合物，其分子量見表4。
表4 7種稀土配合物名稱及分子量配合物 釓配合物 鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物分子量 1025.5 1075.5 1076.6 1087.0 1093.9 1099.1 1103.97種稀土配合物用生理鹽水配成10-2mol/L，然后，再用生理鹽水將受試藥稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L五個濃度。45℃水浴加熱，溶解充分。氟尿嘧啶用生理鹽水配制為10-3mol/L后，用生理鹽水稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7mol/L五個濃度，所有樣品均溶解充分，未見析出。
2.細(xì)胞株K562(人粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株)，CA(人肝癌細(xì)胞株)，SGC-7901(人胃癌細(xì)胞株)，HCT(人結(jié)腸癌細(xì)胞株)，GLC-82(人肺癌細(xì)胞株)。
(二)實驗方法1.改良MTT法將備用的K562細(xì)胞懸液接種于96孔板，90μl/孔。加完細(xì)胞后直接加入受試樣品，每孔10μl。陰性對照為等體積的生理鹽水，陽性對照為氟尿嘧啶。各加藥組及對照組均設(shè)4個平行孔，每塊板設(shè)12個調(diào)零孔(只加完全培養(yǎng)基)。受試樣品的終濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L；氟尿嘧啶的終濃度為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。細(xì)胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中分別孵育48h后，分別加入MTT 5mg/ml，10μl/孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，加入三聯(lián)液[10％SDS-5％異丁醇-0.012ml/L HCL(w/v/v)]，100μl/孔，37℃放置12小時后，用酶標(biāo)儀在570nm、630nm雙波長下測定各孔的OD值(周建軍，1993)。
2.SRB法將備用的BGC-823、CA、HCT、GLC-82細(xì)胞懸液加入96孔板中，90μl/孔。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后加入不同濃度的待測樣品，每孔10μl。陰性對照為等體積的生理鹽水，陽性對照為氟尿嘧啶。加藥組及對照組均設(shè)4個平行孔。每塊板設(shè)12個調(diào)零孔(只加培養(yǎng)基)。樣品及陽性對照的終濃度為10-4，10-5，10-6，10-7，10-8M。在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中分別孵育72h后，分別加入4℃、50％的TCA(三氯乙酸)50μl/孔，加完TCA后，將96孔培養(yǎng)板置于4℃孵育1小時，取出培養(yǎng)板，輕輕傾去板內(nèi)液體。用自來水輕輕沖洗5遍(將自來水由燒杯中輕輕倒入板中，輕晃后，再將水倒去)。置于空氣中風(fēng)干至不見水痕。然后加入配制好的0.4％SRB(用1％乙酸稀釋)，50μl/孔，于室溫下靜置染色30分鐘后，傾去SRB溶液，用1％乙酸沖洗4遍，以除去未與蛋白質(zhì)結(jié)合的染料。置于空氣中風(fēng)干至無水痕后，加入10mM未緩沖Tris溶液150μl/孔(PH＝10，用三蒸水配制)，將染料溶解后，振蕩器上振蕩5分鐘，用570nm波長讀取各孔OD值。
3.數(shù)據(jù)處理細(xì)胞存活率＝加藥孔的OD值/陰性對照孔的OD值；細(xì)胞抑制率＝100％-細(xì)胞存活率。用GWBASIC軟件計算各受試藥的IC50及IC5095％的可信區(qū)間(徐端正.生物統(tǒng)計在藥理學(xué)中的應(yīng)用.科學(xué)出版社.1986，p81-83)。
(三)實驗結(jié)果7種稀土配合物對K562、CA、GLC-82、SGC-7901、HCT細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見表5-9表5 7種稀土配合物對K562細(xì)胞增殖的IC50值配合物 釓配合物鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-FuIC50(M) 6.80×10-98.63×10-82.85×10-64.99×10-63.64×10-65.85×10-62.05×10-73.92×10-5IC50(μg/ml)0.008 0.11 3.91 5.25 4.80 6.81 0.26 5.10表6 7種稀土配合物對CA細(xì)胞增殖的IC50值配合物 釓配合物 鑭配合物 鈰配合物釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-FuIC50(M) 1.66×10-74.53×10-71.56×10-78.38×10-83.03×10-75.92×10-73.53×10-86.76×10-6IC50(μg/ml)0.20 0.57 0.210.08 0.40 0.69 0.2040.88表7 7種稀土配合物對SGC-7901細(xì)胞增殖的IC50值配合物 釓配合物 鑭配合物 鈰配合物 釤配合物釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-FuIC50(M) 7.83×10-89.06×10-85.76×10-73.44×10-73.34×10-85.04×10-81.16×10-74.74×10-6IC50(μg/ml)0.090.11 0.79 0.36 0.44 0.06 0.15 0.62表8 7種稀土配合物對HCT細(xì)胞增殖的IC50值配合物 釓配合物鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-FuIC50(M) 3.70×10-96.37×10-94.89×10-92.42×10-72.25×10-87.83×10-81.55×10-84.77×10-6IC50(μg/ml)0.004 0.008 0.0070.25 0.03 0.09 0.02 0.006表9 7種稀土配合物對GLC-82細(xì)胞增殖的IC50值配合物 釓配合物鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-FuIC50(M) 3.05×10-89.12×10-83.26×10-84.27×10-81.76×10-84.29×10-85.70×10-89.37×10-7IC50(μg/ml)0.04 0.11 0.04 0.04 0.02 0.05 0.07 0.12由表4-8可知七種稀土配合物在受試濃度(10-8～10-4M)對K562、CA、SGC-7901、HCT、GLC-82細(xì)胞株增殖的IC50值均＜7μg/ml，按照化合物IC50＜10μg/ml即認(rèn)為對腫瘤細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用(新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編.中華人民共和國衛(wèi)生部藥政局.1993p137-139)，可認(rèn)為七種稀土配合物對K562、CA、SGC-7901、HCT、GLC-82細(xì)胞株增殖有較強的抑制作用；而其中七種稀土配合物對CA、SGC-7901、HCT、GLC-82細(xì)胞株增殖的IC50值＜1μg/ml，可認(rèn)為七種稀土配合物對CA、SGC-7901、HCT、GLC-82細(xì)胞株增殖有很強的抑制作用。
二、稀土配合物和配體5-氟尿嘧啶的急性毒性(一)實驗材料1.動物健康正常的ICR小鼠，體重18-22克，雌雄各半，由昆明醫(yī)學(xué)院云南省天然藥物藥理重點實驗室動物室提供。
2.受試藥品七種稀土配合物及5-氟尿嘧啶用無菌生理鹽水配制成所需濃度，按0.2ml/10g體重注射。
(二)實驗方法將體重18-22克的ICR小鼠(雌雄各半)禁食6小時后稱重，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，隨機分為4-6組，每組10只，分別按0.2ml/10g體重進行腹腔注射給藥，給藥后觀察至第14天后處死小鼠。觀察指標(biāo)主要有小鼠的死亡、中樞神經(jīng)、植物神經(jīng)、呼吸、胃腸、心血管、生殖、皮膚、毛發(fā)等反應(yīng)。
(三)實驗結(jié)果1.動物死亡情況①死亡時間詳見表10
表10七種稀土配合物致小鼠死亡時間配合物 釓配合物 鑭配合物 鈰配合物 釤配合物 釓配合物 鏑配合物 鉺配合物 5-Fu最早死亡時間 2天 5分鐘10分鐘 15分鐘 40分鐘 15分鐘 5分鐘5天最晚死亡時間 5天 10分鐘 13天 2小時10天 9天 11天 12天②死亡動物解剖皮膚粘膜、心、肝、肺、脾、腸均未見肉眼可見病變，無胃腸脹氣。③中毒表現(xiàn)呼吸急促，癱軟無力，活動減少、精神差、嗜睡、站立不穩(wěn)，其中雄鼠睪丸腫脹。④死亡統(tǒng)計結(jié)果見表11-18表11釔配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)8.5 170 10 5 57.2 144 10 3 76.12 122.4 10 1 95.22 104.4 10 0 104.44 88.810 0 10表12鑭配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計(經(jīng)腹腔注射給藥組)有效量對數(shù)劑量動物數(shù) 死亡率其它中間數(shù)據(jù)mg/kg Xnpp2204 2.3096 10 0.9 0.81 Xm＝2.3096142.8 2.1547 10 0.1 0.01 i＝0.1549100 2.00 10 00701.8451 10 00∑p＝1.0 ∑p2＝0.82注表11中LD50的計算方法為LD50的綜合計算方法。
表13鈰配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)8 160101006.4 128101005.12 102.4 101004.10 82 107 33.28 65.6 105 5表14釤配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)10 200 10 6 47.8 156 10 2 86.08 121.610 0 104.74 94.8 10 0 10表15釓配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)11.43 228.610 7 38 160 10 3 75.6 112 10 1 93.92 78.4 10 0 10表16鏑配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)14280 10 10 010.5 210 10 10 07.88 157.610 645.91 118.210 010表17鉺配合物急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計試藥濃度mg/ml 試藥劑量mg/kg 受試動物數(shù)(只) 死亡動物數(shù)(只) 存活動物數(shù)(只)11.43 228.610 828 160 10 555.6 112 10 643.92 78.4 10 010表18 5-FU急性毒性的動物死亡情況統(tǒng)計劑量g/kg 對數(shù)劑量(X) 動物數(shù)(只) 動物死亡數(shù)(只) 死亡率(％) 幾率單位(Y)0.5202.7210101007.7650.3642.5610101007.0750.2552.41106 605.1730.1782.25105 505.0000.1252.10103 304.5340.0871.94100 0 2.811
2.存活動物情況存活動物五官未觀察到異常分泌物，動物糞便未見異常。
3.LD50、LD10的計算用改進的BIiss法(機率單位加權(quán)回歸法)程序進行計算。
(四)結(jié)論經(jīng)計算7種稀土配合物的LD50和LD10及其95％可信范圍，見表19。
表19 7種稀土配合物的LD50和LD10及其95％可信范圍

從以上結(jié)果可以看出七種稀土配合物與5-氟尿嘧啶相比，LD50大于5-氟尿嘧啶的有三個(釔、釤、釓)；LD10大于5-氟尿嘧啶的有五個(鑭、釔、釤、鏑、釓)，表明稀士配合物藥物的毒性明顯降低，安全范圍有所擴大。
三、稀土配合物和配體5-氟尿嘧啶的體內(nèi)抗腫瘤活性(一)實驗材料1.實驗動物ICR小鼠動物，18～22克，清潔級，由云南省天然藥物藥理重點實驗室動室提供，合格證號云動管字第0001486號。
2.腫瘤細(xì)胞株小鼠肉瘤細(xì)胞株(S180)和小鼠肝癌(HAC)，從上海藥物研究所引種后本室傳代保存。
3.主要試劑與設(shè)備5-氟尿嘧啶由上海華聯(lián)制藥公司生產(chǎn)。
0.9％生理鹽水注射液(0.9％NS)，云南昆明南疆制藥廠生產(chǎn)，批號20011101(二)實驗方法1.樣品的配制稱取適量的5-氟尿嘧啶，用無菌的0.9％生理鹽水，90℃助溶，配制為需要的濃度；稱取適量的七種稀土配合物，用無菌的0.9％生理鹽水，902助溶，配制為需要的濃度(1/4的LD10)，樣品溶解良好，未見析出。
2.七種稀土配合物體內(nèi)抗腫瘤活性及對荷肉瘤(S180)、肝癌(HAC)小鼠的毒性用接種肉瘤細(xì)胞株(S180)和肝癌(HAC)后6～7天，腫瘤生長良好的小鼠，取其瘤細(xì)胞用無菌的0.9％生理鹽水調(diào)成8×106個細(xì)胞/ml濃度的瘤細(xì)胞懸液，接種于小鼠右側(cè)腋部皮下(0.2ml/每只)經(jīng)腹腔注射(i.p)按0.1ml/I0g體重給藥，連續(xù)給藥七天，停藥后24小時處死動物，稱體重、瘤重、肝重、脾重、腎重及胸腺重(新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編，1993)。
(三)結(jié)果處理腫瘤抑制率(％)＝(陰性對照平均瘤重-治療組平均瘤重)/陰性對照平均瘤重×100％數(shù)據(jù)處理用華西醫(yī)科大學(xué)揚樹勤教授主編的《中國醫(yī)學(xué)百科全書.醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)》(第二版)統(tǒng)計軟件包中方差分析比較各組結(jié)果。
(四)結(jié)果1.七個配合物對小鼠肉瘤(S180)、小鼠肝癌(HAC)生長的影響根據(jù)七種稀土配合物和5-氟尿嘧啶的急性毒性實驗結(jié)果，采用七種稀土配合物及5-氟尿嘧啶劑量為1/4 LD10給藥濃度，對七種稀士配合物及5-氟尿嘧啶進行了小鼠肉瘤(S180)、肝癌(HAC)腹腔注射的抗腫瘤實驗，實驗結(jié)果見表19、20。
表19七種稀土配合物對小鼠肉瘤細(xì)胞株(S180)生長的影響劑量動物數(shù)實驗前后體重瘤重(克)樣品 g.kg-1/d開始 最后 體重差(X±s) 抑制率(％)(X±s) 抑制率(％)0.9％NS ---2016 4.22+2.43 --- 1.43±0.78 ---5-氟尿嘧啶 0.0234 1010 0.5±1.68. 48.80.56±0.27#69.1釔配合物0.281010 2.46±3.06.16.50.66±0.32#79.42鑭配合物0.326 108 3.83±1.95.18.71.49±0.40#69.77鈰配合物0.0158 109 1.10±3.49.15.90.59±0.20#61.63釤配合物0.031 1010 0.55±2.70.9.280.35±0.22#78.79釓配合物0.025 1010 0.15±2.36.19.65 0.45±0.23##68.75鏑配合物0.025 1010 0.53±2.39.17.95 0.35±0.21###45.9鉺配合物0.024 1010 1.16±2.37.16.07 0.53±0.36#67.88注與陰性對照組比p＜0.01與陽性對照組比#p＜0.05##p＜0.01###p＜0.05
表20七種稀土配合物對小鼠肝癌(HAC)生長的影響劑量動物數(shù)實驗前后體重瘤重(克)樣品 g.kg-1/d 開始 最后體重差(X+s) 抑制率(％) (X±s) 抑制率(％)0.9％NS --- 2019 4.16±2.43 --- 1.81±0.40#---5-氟尿嘧啶 0.0234 1010 0.5±1.68. 48.8 0.56±0.27#69.1釔配合物0.28 1010 1.59±3.06.17.1 0.66±0.32#63.6鑭配合物0.326109 2.21±1.95.19.5 1.07±0.24#40.9鈰配合物0.0158 1010 2.52±3.49.14.6 0.59±0.20#67.4釤配合物0.0311010 1.93±2.70.9.75 0.56±0.24#68.8釓配合物0.0251010 2.21±2.36.23.170.64±0.13##64.4鏑配合物0.0251010 3.32±2.39.21.950.98±0.47###45.9鉺配合物0.0241010 3.09±2.37.13.0 0.91±0.32#49.2注與陰性對照組比p＜0.01與陽性對照組比#p＜0.05##p＜0.01###p＜0.05由表18、19可見，與陰性對照組0.9％NS相比，七種稀土配合物對小鼠肉瘤(S180)生長的抑制率為45.9～79.4％(p＜0.01)；對小鼠肝癌(HAC)生長的抑制率為40.9～68.8％(p＜0.01)。其中鈰、釔、釤、釓四種配合物的抑制率均大于60％，與陽性對照組的抑制率相近；鑭、鏑、鉺三個配合物的抑制率在40～50％之間。鈰、釔、釤、鉺、釓五個配合物對小鼠肝癌生長的抑制率與陽性對照組5-氟尿嘧啶在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。2.七種稀土配合物對荷瘤小鼠多個臟器的影響在濃度為1/4LD10時，七種稀土配合物及5-氟尿嘧啶對荷肝癌小鼠肝臟、脾臟、腎臟及胸腺重量的影響詳見表21、22。
表21七種稀土配合物對荷瘤小鼠肝臟和脾臟重量的影響劑量動物數(shù)肝重(克)脾重(克)樣品g.kg-1/d開始 最后 X±SD 抑制率(％) X±SD 抑制率(％)0.9％NS --- 20191.77±0.32--- 0.41±0.13---5-氟尿嘧啶 0.0234 10101.43±0.18*19.2 0.21±0.08*48.8釔配合物0.28 10101.66±0.236.78 0.34±0.1317.1鑭配合物0.326109 1.55±0.2312.4 0.33±0.1319.5鈰配合物0.0158 10101.63±0.267.91 0.35±0.098 14.6釤配合物0.03110101.65±0.306.78 0.37±0.129.75釓配合物0.02510101.55±0.1912.4 0.32±0.081 23.17鏑配合物0.02510101.60±0.239.60 0.32±0.082 21.95鉺配合物0.02410101.47±0.31**16.9 0.36±0.1313.0注與陰性對照組比*p＜0.01**p＜0.05
表22七種稀土配合物對荷瘤小鼠胸腺和腎臟重量的影響劑量動物數(shù)胸腺(克)腎重(克)樣品 g.kg-1/d 開始 最后X±SD 抑制率(％)X±SD抑制率(％)0.9％NS ---2019 0.06±0.02 --- 0.29±0.048---5-氟尿嘧啶 0.0234 1010 0.027±0.009*55.0 0.28±0.0343.45釔配合物0.28 1010 0.048+0.018 20.0 0.30±0.0380鑭配合物0.326 109 0.033±0.011**45.0 0.271±0.045 6.55鈰配合物0.0158 1010 0.036±0.02**40.0 0.27±0.0206.90釤配合物0.031 1010 0.046±0.01723.3 0.31±0.0520釓配合物0.025 1010 0.047±0.01218.3 0.31±0.0340鏑配合物0.025 1010 0.049±0.02621.7 0.31±0.0470鉺配合物0.024 1010 0.032±0.01446.7 0.27±0.0566.89注與陰性對照組比*p＜0.01**p＜0.05由表21、22可見，與陰性對照組(0.9％Ns)相比，七種稀土配合物可使小鼠肝臟重量減輕6.8～16.9％，但在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)；而配體5-氟尿嘧啶可使小鼠肝臟重量減輕19.2％，有顯著差異(p＜0.01)。
七種稀土配合物可使小鼠脾臟重量減輕9.8～23.2％，但在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)，而5-氟尿嘧啶可使小鼠脾臟重量減輕48.8％，有顯著差異(p＜0.01)。
七種稀土配合物使小鼠胸腺重量減輕18.3～46.7％，但鈰、釔、釤、鏑、釓等五個配合物在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)，而5-氟尿嘧啶使小鼠胸腺重量減輕為55.0％，有顯著差異(p＜0.01)。
七種稀土配合物使小鼠腎臟重量減輕0.0～6.9％，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)，5-氟尿嘧啶使小鼠腎臟重量減輕3.5％，在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)。
(五)結(jié)論七種稀土配合物在劑量為1/4LD10時，對荷肝癌(HAC)小鼠經(jīng)腹腔注射給藥。七種稀土配合物及5-氟尿嘧啶對腫瘤生長的抑制率在40.9～69.1％，與陰性對照組(0.9％N.S)相比有顯著性差異(p＜0.01)；與5-氟尿嘧啶相比，鈰、釕、釤、鏑、釓等五個稀土配合物對腫瘤生長的抑制率無顯著性差異(p＞0.05)。上述結(jié)果表明，在1/4LD10劑量時，七種稀土配合物對小鼠肝癌(HAC)生長具有顯著的抑制作用，且鈰、釔、釤、鏑、釓五種稀土配合物對小鼠肝癌(HAC)生長的抑制作用與5-氟尿嘧啶相近(p＞0.05)。
研究還表明，七種稀土配合物對小鼠肝癌(HAC)的體內(nèi)生長均具有明顯抑制作用，并且對各臟器重量減輕的影響均比5-氟尿嘧啶小，表明它們的毒性比5-氟尿嘧啶小。其中釤、釓的抗癌活性與5-氟尿嘧啶相當(dāng)，而毒性小于5-氟尿嘧啶。此外釔、鈰的活性也與5-氟尿嘧啶相當(dāng)，而毒性較小。
得到七種稀土配合物對小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的ED50值，結(jié)合七種稀土配合物的急性毒性LD50值，計算出七種稀土配合物對小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的治療指數(shù)TI值(TI＝LD50/ED50)，見表23表23七種稀土配合物對小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC的治療指數(shù)TI值S180HAC樣品 LD50(mg/Kg) ED50(mg/Kg)TI LD50(mg/Kg) ED50(mg/Kg) TI釔配合物 185.7427.85 6.67185.7424.077.72鑭配合物 170.7518.66 9.15170.7529.265.84鈰配合物 92.31 24.40 3.7892.31 23.963.85釤配合物 203.2327.81 7.31203.2326.727.60釓配合物 204.5725.45 8.04204.5732.406.31鏑配合物 146.3919.48 7.51146.3940.513.61鉺配合物 171.4925.87 6.63171.4928.935.93由表中TI值可知釓、釔、釤、鑭配合物對小鼠肉瘤S180和小鼠移植性肝癌HAC有較強的抑制作用和較安全，綜合其它因素從中選出釔、釤配合物作為下一步研究樣品。
四、稀土配合物在荷瘤裸鼠體內(nèi)的抗瘤效應(yīng)(一)材料與方法1樣品釔、釤配合物2動物BalB/C，nu/nu裸鼠，購自中科院上海藥物所，鼠7-8周，體重18～20g，雌性，共30只。
3瘤種人胃癌BGC-823細(xì)胞株為從中國科學(xué)院上海藥物所引種后，在我室長期傳代保存。
4樣品溶液的配制稱取一定量樣品，加入生理鹽水，干80℃水浴加熱助溶1-1.5小時，此為高劑量。再取高劑量溶液的1/2，加入相同體積的生理鹽水，即為低劑量。
5給藥方案及給藥次數(shù)1)釔、釤配合物的動物給藥劑量依據(jù)其LD10值，以1/2 LD10為高劑量，1/4 LD10為低劑量，具體數(shù)據(jù)為釔配合物，高劑量濃度為56mg/Kg，低劑量濃度為28mg/Kg；釤配合物，高劑量濃度為62mg/Kg，低劑量濃度為31mg/Kg。
2)陽性對照藥5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業(yè)有限公司(0.25g/10ml)，批號010403。
3)陰性對照藥生理鹽水，昆明南疆制藥廠，批號200209091。
5-氟尿嘧啶、生理鹽水及樣品均經(jīng)腹腔注射(i.p)，按0.1ml/10g體重給藥，每周3次。
6實驗方法a細(xì)胞懸液接種法將體外培養(yǎng)的BGC-823細(xì)胞懸液接種于2只裸鼠右背部皮下，每只0.2mL。觀察裸鼠接種腫瘤細(xì)胞后，腫瘤形成情況。待腫瘤長出后，傳代。
b初代移植；當(dāng)接種的人胃癌組織長出2周時，在嚴(yán)格無菌條件下，取得瘤塊，置于RPMI1640培養(yǎng)基中，用剪子剪成1mm×1mm×1mm大小的腫瘤組織塊。用組織勻漿器將腫瘤組織磨碎，過200目尼龍網(wǎng)，制成細(xì)胞懸液。用1ml注射器將細(xì)胞懸液接種于2只裸鼠右背部皮下，每只0.2mL傳代移植；c傳代移植當(dāng)接種的初代移植人胃癌組織長出2周時，按初代移植的方法再傳兩代。
d分組將第三代的人胃癌組織按初代移植的方法接種于30只裸鼠背部皮下，10～16天有腫瘤生長出來。待其腫瘤長至30～100mm3時，按瘤大小將其分為6組陽性對照組(氟尿嘧啶組)、陰性對照組(生理鹽水組)、釔高劑量組、釔低劑量組、釤高劑量組、釤低劑量組。每周2，4，7給藥，連續(xù)給藥4周。停藥后24小時處死動物，稱體重、瘤重。
7結(jié)果處理；計算各組平均瘤重，按下公式求出腫瘤抑制率后用(醫(yī)百醫(yī)統(tǒng)·統(tǒng)計軟件包)(PEMS)中的方差分析進行統(tǒng)計學(xué)處理。
腫瘤抑制率(％)＝(空白對照平均瘤重-治療組平均瘤重)/空白對照平均瘤重×100％(二)結(jié)果釔配合物對人胃癌(GBC-823)生長的抑制作用見表24；釤配合物對人胃癌(GBC-823)生長的抑制作用見表25。
表24釔配合物對人胃癌(BGC-823)生長的抑制作用動物數(shù)平均體重(克)瘤重(克) 抑制率分組開始 結(jié)束開始最后X±SD (％)N.S陰性對照組 5 5 18.718.01.09±0.18 ～氟尿嘧啶陽性對照組 5 5 18.918.50.11±0.04*69.72釔高劑量組 5 5 18.718.40.09±0.04*71.56釔低劑量組 5 5 18.220.50.13±0.08*66.06注*，與N.S陰性對照組相比較，p＜0.01表25釤配合物對人胃癌(BGC-823)生長的抑制作用動物數(shù)平均體重(克)瘤重(克) 抑制率分組 開始 結(jié)束開始最后 X±SD (％)N.S陰性對照組 55 18.718.0 1.09±0.18 ～氟尿嘧啶陽性對照組 55 18.918.5 0.11±0.04*69.72釤高劑量組 55 18.318.9 0.07±0.03*80.74釤低劑量組 55 18.818.4 0.29±0.15*64.22
注*，與N.S陰性對照組相比較，p＜0.01(三)結(jié)論由上述結(jié)果可以看出，釔、釤配合物對荷人胃癌(BGC-823)裸鼠移植瘤的生長有較強的抑制作用。
本發(fā)明的有益效果在于利用我國豐富的稀土資源，合成了一類新型的，具有抗腫瘤活性的稀土配合物[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
本發(fā)明的另一個有益效果在于上述研究表明此類稀土配合物在上述實驗條件下，與配體5-氟尿嘧啶相比抗腫瘤活性更高而且更為安全。
權(quán)利要求
1.一類稀土配合物，其特征在于配合物是硝酸一硝酸根二鄰菲羅啉三5-氟尿嘧啶合稀土(III)，其分子通式為[Ln(Phen)2(5-Fu)3(NO3)](NO3)2。
2.一類稀土配合物硝酸一硝酸根二鄰菲羅啉三5-氟尿嘧啶合稀土(III)的制備方法，其特征在于用摩爾比為1∶2∶3的稀土硝酸鹽、鄰菲羅啉、5-氟尿嘧啶在無水乙醇中，在加熱到80℃并攪拌下進行反應(yīng)。
3.一類稀土配合物硝酸一硝酸根二鄰菲羅啉三5-氟尿嘧啶合稀土(III)，在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類可用作抗腫瘤藥品的新型稀土配合物，更具體地說，涉及一類稀土配合物及制備方法和在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明用稀土硝酸鹽、鄰菲羅啉、5－氟尿嘧啶按1∶2∶3比例，以無水乙醇為溶劑，在80℃、攪拌下反應(yīng)，生成通式為[Ln(Phen)
文檔編號C07F5/00GK1458156SQ0312842
公開日2003年11月26日 申請日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月24日
發(fā)明者鐘文遠(yuǎn), 李瑪琳, 胡智興, 陳順方, 紀(jì)舒昱, 周軼平 申請人:鐘文遠(yuǎn)