專利名稱：人造牽引絲蛋白基因及其串聯(lián)方法與表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域。
背景技術：
蜘蛛是一種能夠在同一生物體內(nèi)產(chǎn)生具有不同功能的多種絲的生物，絲的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。蜘蛛牽引絲(dragline silk)是蜘蛛絲的一種，是自然界中集高抗張強度及高彈性于一體的奇特蛋白質(zhì)。因其具備較鋼鐵更強的抗張強度，且其化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)，故將其美譽為“生物鋼蛋白”。除具備高抗張強度與高彈性之外，蜘蛛牽引絲蛋白還兼具了如質(zhì)量輕、耐腐蝕、可生物降解等優(yōu)良特性。因此，牽引絲蛋白在諸如生物醫(yī)學裝置(眼或神經(jīng)外科用縫針線、人造肌腱等)、商業(yè)用途(高強度的包裝材料、纜繩等)以及軍事裝備(防彈衣、降落傘等)等領域具有廣闊的應用前景，是一種被世界普遍看好的生物材料。但由于蜘蛛無法實現(xiàn)人工群飼(因其個體異常兇猛，互相殘食)，且不能像家蠶一般人為控制其產(chǎn)絲，因此很難實現(xiàn)大量收獲天然的蜘蛛牽引絲。
伴隨現(xiàn)代生物技術的不斷發(fā)展，越來越多的分子生物學研究者試圖通過了解這一奇特物質(zhì)的分子基礎，利用基因工程手段實現(xiàn)牽引絲蛋白的人工合成與大量收獲，為在多領域廣泛應用這種“生物鋼蛋白”提供可能。
美國的Hinman與Lewis等研究小組發(fā)現(xiàn)，牽引絲蛋白主要由兩種蛋白質(zhì)核構成Spidroin1與Spidroin2。通過對不同產(chǎn)地、不同品系蜘蛛牽引絲的研究表明，牽引絲蛋白由明顯的氨基酸基序依次串聯(lián)而成，且其所含有的基序種類對應于牽引絲蛋白的物理性質(zhì)。牽引絲蛋白中的氨基酸基序主要有AGR(GGL)，GGQGAGAn，GPGQQ，GPGGY，SGPGSAn等，其中富含丙氨酸的區(qū)域為牽引絲蛋白提供了相當?shù)匿撔?，而含有脯氨酸的區(qū)域則賦予它一定的彈性。鑒于牽引絲蛋白所具有的這種特殊“模塊性”，許多科研人員便試圖利用這種特性，人工構造出滿足要求的“人造牽引絲蛋白”。
技術內(nèi)容本發(fā)明的目的是利用蛋白質(zhì)中氨基酸種類與基因中核苷酸序列間存在對應關系的性質(zhì)以及對密碼子進行優(yōu)化篩選，合成了人造牽引絲蛋白基因，及該人造牽引絲蛋白基因的串聯(lián)方法與表達。
本發(fā)明的核苷酸序列是gaa ttc atg gta ccc ccg ggt ggc tat ggt ccaPro Gly Gly Tyr Gly Proggt cag caa ggc cct tct ggt cca ggc agt gcaGly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Alagca gcc gca gca gcc gca gcc gga ccg gtt cta
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glygag gat atc aag ctt本發(fā)明人造牽引絲蛋白基因的串聯(lián)方法與表達，以pUC18克隆質(zhì)粒為載體，利用二次限制性內(nèi)切酶雙酶切反應及一次連接反應，構建出含有二個DNA單體數(shù)目的串聯(lián)DNA單體二聚物，核苷酸序列測定表明成功實現(xiàn)了二個人造牽引絲蛋白基因DNA單體的串聯(lián)，依此類推，也可以實現(xiàn)多個DNA單體的串聯(lián)，利用限制性內(nèi)切酶雙酶切反應將獲得的不同長度人造牽引絲蛋白基因從pUC18載體中切下，并將之連接至原核表達載體pET-28a中，經(jīng)IPTG誘導，目的基因獲得較好的表達。
1、本發(fā)明得到的“人造牽引絲蛋白基因”完全具備為天然蛛絲蛋白提供高彈性與高抗張強度的氨基酸基序所對應的核苷酸序列；2、本發(fā)明得到的不同長度的“人造牽引絲蛋白基因”可表達不同長度的“人造蛛絲蛋白”；3、本發(fā)明得到的目的基因多拷貝順序串聯(lián)法能夠簡便、快捷的獲得質(zhì)粒載體可容納范圍內(nèi)目的基因任意拷貝數(shù)的順序串聯(lián)片段，由此可獲得相應長度的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物——“人造牽引絲蛋白”，且此蛋白不會由于基因工程的操作過程而引入非牽引絲蛋白所需氨基酸序列，為人工獲得蜘蛛牽引絲蛋白奠定基礎。
4、本發(fā)明得到的目的基因多拷貝順序串聯(lián)法能夠在保證不改變閱讀框、不摻入無關氨基酸序列的前提下實現(xiàn)待串聯(lián)肽段的核酸序列的定量、順序串聯(lián)，為實現(xiàn)不同蛋白的融合表達提供可能。


圖1是本發(fā)明陽性重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切鑒定反應1％瓊脂糖電泳結果。1DNA標準分子量λEcoI14I；9DNA標準分子量DL-2000；2~8pUC18-S2至pUC18-S8陽性重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切反應結果。
圖2是本發(fā)明不同數(shù)目DNA單體多聚物在大腸桿菌中表達情況的15％SDS-PAGE電泳圖。1陰性對照；4低分子量蛋白質(zhì)標準物；其余泳道從左至右分別為DNA單體二聚物至DNA單體八聚物在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達情況。
圖3本發(fā)明目的基因二拷貝串聯(lián)策略示意圖。
具體實施例方式1.“人造牽引絲蛋白基因”的合成與克隆1.1引物合成CAG231F1cggaattcat ggtacccccg ggtggctatg gtccaggtcagcaaggcccttctggtccaggcagtgcagcagCAG231R1cgaagcttga tatcctctag aaccggtccg gctgcggctgctgcggctgctgcactgcctggacca1.1聚合酶鏈式反應在PCR管中分別加入CAG231F1(0.01 OD/μl)5μl，CAG231R1(0.01 OD/μl)5μl，10×TaKaRa LA Buffer 10μl，dNTP Mixture 16μl，H2O 63μl。
94℃保溫5min后，在10min內(nèi)冷卻至55℃，加入TaKaRa LA Taq酶1μl后，保溫5min，72℃保溫5min。此反應液為DNA延伸液。此DNA延伸液進行乙醇沉淀后，溶于100μl TE Buffer中。所獲得的雙鏈DNA分子即為“人造牽引絲蛋白基因”。
1.2限制性內(nèi)切酶酶切反應在微量離心管中分別加入DNA延伸液20μl，10×Buffer10μl，EcoR I 3μl，Hind III 3μl，加水補至100μl。
37℃保溫1hr，經(jīng)乙醇沉淀后溶解于20μl TE緩沖液(pH8.0，10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA，下同)中，此片段為待插入片段。
1.3連接反應在微量離心管中分別加入待插入片段2μl，pUC18(EcoR I與Hind III雙酶切)1μl，Ligation Solution I 5μl，H2O 2μl。
16℃保溫30min，連接液全量轉化至E.coli JM109感受態(tài)細胞中。重組質(zhì)粒命名為pUC18-S1。
1.4DNA序列測定對重組質(zhì)粒pUC18-S1進行核苷酸序列測定，測序結果同預期結果完全相符。
1.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(氯化鈣法)以無菌接種環(huán)刮取凍存于-70℃冰箱的大腸桿菌菌種，劃線接種于不含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)16hr左右。挑取單一菌落，接種到100ml LB培養(yǎng)基中，37℃ 250rpm振搖培養(yǎng)約3hr(OD600＝0.4~0.6)；冰浴5min后，在無菌條件下將細菌培養(yǎng)液轉移到無菌并以冰預冷的250ml聚丙烯離心管中(以下操作均需無菌)，冰浴10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；4℃ 5000~6000rpm離心10min，棄上清，以10ml冰預冷的100mmol/L CaCl2溶液充分重懸沉淀，冰浴15~30min，4℃6000rpm離心10min，棄上清，再以10ml冰預冷的100mmol/L CaCl2溶液充分重懸沉淀；冰浴15~30min，4℃6000rpm離心10min，棄上清；最后以2ml冰預冷的、含15％(v/v)甘油的75mmol/LCaCl2溶液重懸沉淀，用無菌吸頭將感受態(tài)細胞分裝于無菌微量離心管中，每管200μl；標明菌株、體積和日期，置-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2.轉化將適量連接產(chǎn)物加入200μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min；42℃水浴熱沖擊90s，冰浴冷卻5min；加入200μl 37℃預熱的LB培養(yǎng)基，37℃150rpm振搖培養(yǎng)50min；取培養(yǎng)液涂布于含適量抗生素(Amp 50μg/ml)的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)14~16h后，出現(xiàn)轉化菌落。
3.質(zhì)粒的提取4.1質(zhì)粒的小量制備(堿裂解法)挑取單個轉化菌落，接種到2ml含50μg/ml Amp的LB培養(yǎng)液(下同)中，37℃250rpm振搖培養(yǎng)12~16h；將1.5ml細菌培養(yǎng)物轉移至微量離心管中，12000rpm離心30s，棄上清。以200μl冰預冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖；25mmol/L Tris·Cl，pH8.0；10mmol/LEDTA，pH8.0)重懸沉淀，加入200μl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入200μl用冰預冷的溶液III(3molKAc，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，4℃12000rpm離心10min，取上清，分別用等體積的飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)、氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次；加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，-20℃靜置10min，4℃12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌抽干。以20μl含終濃度20μg/ml RNA酶(無DNA酶)的TE(pH8.0)溶解沉淀，并于37℃水浴中孵育30min去除RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.2質(zhì)粒的大量制備與純化將含有目的質(zhì)粒的細菌接種于100ml LB培養(yǎng)液中，37℃250rpm振搖培養(yǎng)16~18h；冰浴10min，4000rpm×15min收集獲得細菌培養(yǎng)物沉淀，棄上清，倒置離心管使上清全部流盡；將細菌沉淀重懸于4ml冰預冷的STE中；按上述方法離心，以收集細菌細胞；將所得沉淀重懸于4ml冰預冷的溶液I中，旋渦振蕩(務必要使細菌在溶液I中完全分散)；加入400μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml，pH8.0，當pH低于8.0時，溶菌酶不能有效工作)；加入8ml溶液II(新鮮配制)，蓋緊管口，緩緩的旋轉離心管數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，冰浴放置5~10min(應確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液II接觸，不要振蕩)；加入6ml冰預冷的溶液III，蓋緊管口，緩緩的旋轉離心管數(shù)次以使細菌裂解物分散均勻，冰浴10min；4℃4000rpm×15min，利用4層紗布將上清過濾轉移到一新50ml離心管中；加入12ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10min以上；室溫下，≥5000rpm×15min(如在4℃離心，鹽也會發(fā)生沉淀)；70％乙醇洗滌沉淀；小心棄去上清，倒置離心管以使所有液體流出，以3ml TE(pH8.0)溶解沉淀；加入3ml冰預冷的LiCl(5mol/L)溶液充分混勻，室溫放置5min以上；4℃10,000rpm×10min；將上清轉移到一新50ml離心管中，加入6ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10min以上；室溫下，10,000rpm×10min，小心棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干；加入400μl含RNase TE(pH8.0)溶解質(zhì)粒DNA，37℃水浴除去RNA；加入400μl含13％(w/v)PEG8000的1.6M NaCl，充分混勻，靜置過夜；4℃12,000rpm×10min，小心棄去上清；加入400μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，用等體積酚、酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)各抽提一次(12,000rpm×10min，取上層水相)；上層水相移入一新的1.5ml離心管中，加入0.1倍體積3M NaAC(pH5.2)及2倍體積冷無水乙醇，混勻后-20℃靜置10min以上；4℃12,000rpm×10min，棄上清，沉淀用70％冷乙醇洗滌并抽干，核酸沉淀溶于80μl TE(pH8.0)中，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.3質(zhì)粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對照，用TZK-800Z型紫外可見分光光度計測定波長260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。OD260＝1相當于含質(zhì)粒大約50μg/ml，雙鏈DNA純品的OD260/OD280值為1.8，如樣品OD260/OD280值明顯低于1.8，則可能有蛋白質(zhì)或酚污染，需進一步純化。
4.瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(0.045mol/L Tris-硼酸，0.001mol/LEDTA)配0.8-1.2％(w/v)瓊脂糖凝膠溶液，加熱至瓊脂糖完全溶解后，加溴化乙錠(EB 10mg/ml)至終濃度0.5μg/ml；混勻倒入封固好的膠模中，插入相應的梳子，梳子距底板1.0mm左右，待凝膠完全凝固，小心移去梳子，將凝膠放入裝有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中，取適量DNA樣品在封口膜上與適量體積加樣緩沖液(0.25％溴酚藍、0.25％二甲苯青FF、40％蔗糖)混勻，用微量加樣器將樣品加到梳孔中，以5v/cm的電壓電泳，當溴酚藍電泳至適當位置，在長波紫外燈下觀察結果和拍照。
5.限制性內(nèi)切酶酶切反應6.1單酶切反應將1.0μg質(zhì)粒DNA與適量水混勻，使其總體積為18μl，加入2-3單位限制性內(nèi)切酶及1μl相應的10×限制性內(nèi)切酶反應緩沖液，輕彈管壁混勻并離心，置最適反應溫度水浴2～3h，瓊脂糖凝膠電泳檢查。對大量質(zhì)粒DNA的酶切反應，相應擴大限制性內(nèi)切酶用量和反應體積，取少量反應液電泳檢查，完全酶切后，-20℃保存，以備進一步鑒定或回收片段之用。
6.2雙酶切反應選擇反應活性等于或接近100％的同一緩沖系統(tǒng)進行雙酶切反應，若溫度或緩沖系統(tǒng)不同，則按先低溫后高溫，先低鹽后高鹽的順序進行；或第一酶切完成后，酚∶氯仿(24∶1)抽提，乙醇沉淀后，再進行第二酶切反應。
6.DNA片段的回收將酶切完全的、含目的DNA片段的溶液與上樣緩沖液混合，加入適當濃度的瓊脂糖凝膠板中電泳至目的DNA片段完全分離。電泳結束后用潔凈的刀片在長波紫外燈下切下含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，放入一1.5ml的微量離心管中。選用北京鼎國生物公司生產(chǎn)的從凝膠中回收DNA試劑盒回收DNA片段。
將切取的含DNA片段的凝膠(100-300mg)搗碎，按重量比1∶3(DNA片段∶溶液B)加入溶液B；50℃水浴10min，直至膠完全溶化，其間漩渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化。如果體積大于500μl，可適當增加溶膠時間，若此時溶液變紅，可加15μlNaAc；將溶液置于離心柱中，靜止1-2min，大于8,000rpm，離心30～60sec。若一次加不完，可分兩次離心；倒掉液體，加入500μl溶液C(用時乙醇1∶1稀釋)于離心柱中，大于8,000rpm，離心30～60sec，倒掉液體；用溶液C(用時乙醇1∶1稀釋)500μl再洗一遍，大于8,000rpm離心30～60sec；15,000rpm再次離心30～60sec，摔干剩余液體；將離心柱置于新的離心管中，加入50℃預熱的溶液D30~50μl，混勻，靜止2min，15,000rpm離心60sec。管底即DNA；將DNA貯存于-20℃。
7.外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應8.1粘端連接取0.5μg回收的載體DNA，加3~5倍摩爾量的外源DNA片段，2μl5×連接緩沖液加水定容至10μl，最后加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻并離心，16℃連接1~4h，取7μl連接反應液轉化E.coli感受態(tài)JM109細胞(具體轉化方法詳見實施方法3)。
8.1平端連接取0.1μg平末端去磷后的載體DNA，加5~8倍量的平端目的DNA片段，3μl 5×連接緩沖液，加水定容至15μl混勻后，加入1Weiss單位T4DNA連接酶，混勻離心，14℃連接20~24h。取8μl連接反應液轉化E.coli感受態(tài)細胞(具體轉化方法詳見實施方法3)。
9.目的基因二拷貝的串聯(lián)9.1第一次限制性酶切反應用限制性內(nèi)切酶EcoR V(識別位點為GATATC，產(chǎn)物為平端)與AgeI(識別位點為ACCGGT，產(chǎn)物為5′突出粘末端)對重組質(zhì)粒pUC18-S1進行限制性內(nèi)切酶雙酶切消化反應，其產(chǎn)物為兩種DNA片段，長度分別為2.8kb(pUC18載體-S1)與11bp(部分接頭DNA片段)?；厥臻L度約為2.8kb的DNA片段，該片段兩端分別為EcoRV酶切產(chǎn)生的平末端，及AgeI酶切產(chǎn)生的5突出粘末端。
9.2第二次限制性酶切反應用限制性內(nèi)切酶EcoR V與XmaI(識別位點為CCCGGG，產(chǎn)物為5′突出粘末端，與AgeI酶切后產(chǎn)生的5′突出粘末端同尾，二者可通過反向互補配對進行連接，但連接后產(chǎn)生的序列卻不能被二者中的任何一個所識別、切割)對重組質(zhì)粒pUC18-S1進行限制性內(nèi)切酶雙酶切消化反應，其產(chǎn)物也為兩種DNA片段，長度分別為2.7kb的pUC18載體片段與0.1kb(S1)的小片段?；厥蛰^小的DNA片段，該片段一端為EcoR V酶切產(chǎn)生的平末端，而另一端為Xma I酶切產(chǎn)生的5突出粘末端，該末端與Age I酶切產(chǎn)生的5突出粘末端可以通過堿基互補配對原則而實現(xiàn)互補連接，而連接產(chǎn)物卻不能再被AgeI或Xma I識別、切割。
9.3連接反應將9.1中獲得的2.8kb DNA片段(pUC18-S1)與9.2中獲得的長約0.1kb的DNA片段(S1)在T4 DNA連接酶的作用下，16℃過夜連接，重組質(zhì)粒即為pUC18-S2。該質(zhì)粒是以pUC18為載體，順序插入兩拷貝的DNA單體，其所編碼的氨基酸序列恰好為2個肽基序的順序串聯(lián)，且沒有摻入無關氨基酸殘基。
10.目的基因多拷貝的串聯(lián)10.1第一次限制性酶切反應用限制性內(nèi)切酶EcoR V(識別位點為GATATC)與Age I(識別位點為ACCGGT)對重組質(zhì)粒pUC18-Sn進行限制性內(nèi)切酶雙酶切消化反應，其產(chǎn)物為兩種DNA片段pUC18-Sn的長片段與11bp的小片段?；厥彰盖挟a(chǎn)物中DNA大片段(pUC18-Sn)，該片段兩端分別為EcoRV酶切產(chǎn)生的平末端，及Age I酶切產(chǎn)生的5突出粘末端。其核苷酸序列為pUC18與DNA單體n聚物的重組體。
10.2第二次限制性酶切反應用限制性內(nèi)切酶EcoR V與Xma I對重組質(zhì)粒pUC18-Sm進行限制性內(nèi)切酶雙酶切消化反應，其產(chǎn)物也為兩種DNA片段，長度分別為pUC18載體片段(2.7kb)與DNA單體m聚物，長度約為m×0.1kb?；厥辗禽d體片段，該片段一端為EcoR V酶切產(chǎn)生的平末端，而另一端為Xma I酶切產(chǎn)生的5突出粘末端。
10.3連接反應將10.1中獲得的DNA片段(Age I-pUC18-Sn-EcoR V)與10.2中獲得的DNA片段(XmaI-Sm-EcoR V)在T4 DNA連接酶的作用下，16℃過夜連接，重組質(zhì)粒為pUC18-S(n+m)。該質(zhì)粒是以pUC18為載體，順序插入m+n個拷貝數(shù)的DNA單體，其所編碼的氨基酸序列恰好為m+n個肽基序的順序串聯(lián)，且沒有摻入無關氨基酸。通過這種方法便很容易得到預期拷貝數(shù)目的基因的順序串聯(lián)。
11.重組質(zhì)粒的鑒定11.1限制性內(nèi)切酶雙酶切反應鑒定將經(jīng)過電泳篩選出的可疑陽性克隆質(zhì)粒進行EcoR I和HindIII雙酶切反應，同時做陰性克隆質(zhì)粒的酶切對照。酶切反應體系為待鑒定質(zhì)粒5μl，10×H buffer 2μl，EcoR I，1μl HindIII 1μl，ddH2O 1μl，總體積10μl。
37℃恒溫水浴2小時，1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察電泳結果，陽性重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和HindIII雙酶切反應產(chǎn)物中應該存在兩條DNA帶，一條為pUC18載體帶(長約2.7kb)，另一條為目的帶，長度約為實現(xiàn)串聯(lián)的DNA單體數(shù)目×0.1kb。陰性對照質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物中只能見一條pUC18載體帶。
從圖1中可以清楚的看到，pUC18-S2至pUC18-S8重組質(zhì)粒EcoRI和HindIII雙酶切反應結果中都出現(xiàn)了兩條帶載體帶與插入片段帶。其中載體帶均為pUC18載體，而插入片段則分別為S2至S8，各插入片段之間呈現(xiàn)出非常好的梯度關系，每相鄰兩個泳道的插入片段之間相差恰好一個DNA單體的長度(約為0.1kb)。
11.2重組質(zhì)粒的PCR鑒定將經(jīng)過雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行PCR鑒定，以陰性質(zhì)粒為對照。PCR反應體系為MgCl2(25mmol/l)2.0μl，10×PCR Buffer(Mg2+Free)2.0μl，Distilled water 12.5μl，Taq(1U/μl)1.0μl，Primer1(10pmol/μl)0.5μl，Primer2(10pmol/μl) 0.5μl，待鑒定質(zhì)粒0.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，總體積20.0μlPCR反應條件為94℃30s，55℃30s，72℃120s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。反應結束后用1％的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定。紫外燈下觀察電泳結果，陽性重組質(zhì)粒中可見有特異性擴增條帶，而陰性對照質(zhì)粒中則沒有。
12.目的基因的原核表達12.1原核表達載體的構建及轉化將pUC18-Sn重組克隆載體和原核表達載體pET-28a分別用EcoRI和HindIII兩種限制性內(nèi)切酶進行雙酶切反應，分別將酶切產(chǎn)物中的Sn插入片段與pET-28a載體片段進行DNA回收(DNA回收方法詳見實施方法7)。將回收的Sn片段和pET-28a載體片段進行定向連接(外源DNA片段與質(zhì)粒載體的連接反應詳見實施方法8)。連接產(chǎn)物轉化至E.coli感受態(tài)細胞JM109中(轉化方法詳見實施3)。將經(jīng)過鑒定的陽性重組質(zhì)粒再次轉化至E.coli感受態(tài)細胞BL21(DE3)中。
12.2目的基因在原核細胞中的表達將鑒定好的陽性表達菌株pET28a(+)-Sn-BL21(DE3)接種于5ml含適當抗生素(Kan 50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。次日，將此培養(yǎng)液按0.1％的量接種于5ml含適當抗生素(Kan50μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.4～1(大約3hr)，加IPTG至終濃度為1mmol/L進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)3～4hr，冰浴5min，離心收菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 12.3表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析工程菌誘導完畢后，取1ml菌液以12000rpm室溫離心2min，收集菌體。加入100μl ddH2O，渦旋振蕩混勻后加入25μl 5×SDS凝膠加樣緩沖液，繼續(xù)混合20sec。樣品經(jīng)沸水浴處理5min后于室溫12000rpm離心3min，取15～25μl上清進行電泳。當染料處于積層膠中時電泳電壓為70V；當染料電泳出積層膠后電泳電壓升到160V，直到染料電泳出分離膠為止。
電泳結束后用考馬斯亮藍R-250染色液染色，脫色液脫色。
從圖2中可以清楚的看到DNA單體二聚物至DNA單體八聚物在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了較好的表達。相鄰兩個泳道的表達產(chǎn)物之間相差恰好一個肽基序的長度(分子量約為2.2kDa)。
權利要求
1.一種人造牽引絲蛋白基因，其核苷酸序列是gaa ttc atg gta ccc ccg ggt ggc tat ggt ccaPro Gly Gly Tyr Gly Proggt cag caa ggc cct tct ggt cca ggc agt gcaGly Gln Gln Gly Pro Ser Gly Pro Gly Ser Alagca gcc gca gca gcc gca gcc gga ccg gtt ctaAla Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glygag gat atc aag ctt
2.一種人造牽引絲蛋白基因的串聯(lián)方法與表達，其特征在于以pUC18克隆質(zhì)粒為載體，利用二次限制性內(nèi)切酶雙酶切反應及一次連接反應，構建出含有二個DNA單體數(shù)目的串聯(lián)DNA單體二聚物，核苷酸序列測定表明成功實現(xiàn)了二個人造牽引絲蛋白基因DNA單體的串聯(lián)，依此類推，也可以實現(xiàn)多個DNA單體的串聯(lián)，利用限制性內(nèi)切酶雙酶切反應將獲得的不同長度人造牽引絲蛋白基因從pUC18載體中切下，并將之連接至原核表達載體pET-28a中，經(jīng)IPTG誘導，目的基因獲得較好的表達。
全文摘要
一種人造牽引絲蛋白基因及人造牽引絲蛋白基因的串聯(lián)方法與表達，屬于生物技術領域。本發(fā)明的目的是利用蛋白質(zhì)中氨基酸種類與基因中核苷酸序列間存在對應關系的性質(zhì)以及對密碼子進行優(yōu)化篩選，合成了人造牽引絲蛋白基因，及該人造牽引絲蛋白基因的串聯(lián)方法與表達。本發(fā)明得到的人造牽引絲蛋白基因具備高彈性與高抗張強度。不同長度的人造牽引絲蛋白基因可表達不同長度的人造蛛絲蛋白。目的基因多拷貝順序串聯(lián)法能夠簡便、快捷的獲得質(zhì)粒載體可容納范圍內(nèi)目的基因任意拷貝數(shù)的順序串聯(lián)片段，并且在保證不改變閱讀框、不摻入無關氨基酸序列的前提下實現(xiàn)待串聯(lián)肽段的核酸序列的定量、順序串聯(lián)，為實現(xiàn)不同蛋白的融合表達提供可能。
文檔編號C07H21/04GK1566133SQ0312762
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月10日 優(yōu)先權日2003年7月10日
發(fā)明者馬鶴雯, 張永亮, 張立樹, 張玉靜, 鄭偉 申請人:中國人民解放軍軍需大學