專利名稱：通過改變基因拷貝數(shù)制備多肽的方法
背景技術：
用來增加多肽產(chǎn)生的廣泛采用的方法是通過稱為擴增的方法獲得具有編碼多肽的基因的多重拷貝之菌株。
美國專利5578461公開了通過與基因串聯(lián)的一種可擴增的選擇標記基因的同源重組的導入方法，其中，通過在加大量的適當選擇劑存在下培養(yǎng)細胞，可篩選含有與多重拷貝之基因串聯(lián)的一種擴增拷貝的選擇標記基因的細胞。
特定多肽生產(chǎn)的降低可通過破壞、失活或者通過編碼多肽之基因的重組強迫喪失來實現(xiàn)。
本發(fā)明的一個目的是提供制備多肽的新方法。
本發(fā)明還涉及獲得突變細胞的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的一個拷貝之中的基因座處導入親本細胞的基因組，產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
本發(fā)明還涉及獲得突變細胞的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列之外的基因座處導入親本細胞的基因組，產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，所述核酸序列在該核酸序列之5’和3’端含有重復序列，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
本發(fā)明還涉及突變細胞和用于獲得突變細胞的方法。


圖1是pJaL292的限制性酶切圖譜。
圖2是pKS6的限制性酶切圖譜。
圖3是pBANe13的限制性酶切圖譜。
圖4是pBANe6的限制性酶切圖譜。
圖5是pMHan37的限制性酶切圖譜。
圖6是pBANe8的限制性酶切圖譜。
圖7是pSO2的限制性酶切圖譜。
圖8是pSO122的限制性圖譜及來自pSO 122的pDSY81及pDSY82的結構。
圖9是pJaI400的限制性酶切圖譜。
圖10是pMT1935的結構。
圖11是pJaL394的限制性酶切圖譜。
圖12是pMT1931的限制性酶切圖譜。
圖13是pMT1936的限制性酶切圖譜。
圖14是pGAG3的限制性酶切圖譜。
圖15是pJaL389的限制性酶切圖譜。
圖16是pJaL335的限制性酶切圖譜。
圖17是pJaL399的限制性酶切圖譜。
圖18是pDM176的限制性酶切圖譜。
圖19是pHB218的限制性酶切圖譜。
圖20是pSE39的限制性酶切圖譜。
圖21是pDSY153的限制性酶切圖譜。
發(fā)明詳述在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的拷貝之外的基因座處導入親本細胞的基因組，產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的增加不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
術語“基因組”在此定義為一套完整的細胞DNA，包括染色體、人工染色體DNA和染色體外DNA，即自我復制性遺傳元件。
術語“拷貝數(shù)”在此定義為包含于細胞的每個基因組中的基因分子的數(shù)目。
術語“選擇壓力”在此定義為在增加了量的適宜選擇劑存在下培養(yǎng)細胞，所述細胞含有一種表達盒，該表達盒帶有與編碼目標多肽的核酸序列串聯(lián)連接的一種可擴增選擇標記基因，由此使選擇標記基因及串聯(lián)的核酸序列的拷貝數(shù)擴增。
一種“產(chǎn)生更多的多肽”的突變細胞在此定義為與親本細胞相比可從其中回收更多的多肽的細胞。
在第二個實施方案中，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的拷貝之外的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的降低不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
一種“產(chǎn)生更少的多肽”的突變細胞在此定義為與親本細胞相比可從其中回收更少的多肽的細胞。
在第三個實施方案中，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中
(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的一個拷貝之內的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的增加不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
在第四個實施方案中，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的一個拷貝之內的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的降低不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
在第五個實施方案中，本發(fā)明涉及制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列之外的基因座處導入親本細胞的基因組，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，該核酸序列在所述核酸序列之5′和3′端含有重復序列，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
術語“核酸序列的至少兩個串聯(lián)拷貝”在此定義為編碼目的多肽的核酸序列之兩個或多個拷貝，其中核酸序列的拷貝在細胞的基因組中以一個接一個的方式排列，有或沒有間隔序列。當有間隔序列時，間隔序列的長度應當小于10,000bp，優(yōu)選小于5,000bp，更優(yōu)選小于2,000bp，甚至更優(yōu)選小于10,00bp，最優(yōu)選小于100bp。然而，間隔序列可以是任一長度，只要該長度不阻止拷貝數(shù)的增加或降低。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸序列的串聯(lián)拷貝之間無間隔序列存在。
術語“在核酸序列的5’和3’端的重復序列”在此定義為在編碼目標多肽的核酸序列之5’端和3’端均存在的核苷酸序列。重復序列彼此之間可為同一方向(正向重復)或為相對方向(反向重復)。重復序列可為任一合適的長度，但優(yōu)選約100-約1000bp，更優(yōu)選約100-約500bp，最優(yōu)選約100-約300bp。多肽術語“多肽”它包括肽、寡肽和蛋白質，所以，在本文并不限于特定長度的編碼產(chǎn)物。多肽可以是對細胞而言天然的或異源性多肽。優(yōu)選的是異源多肽。術語“異源多肽”被定義為對所述細胞來說不是天然的多肽。多肽可是野生型多肽或其變體。多肽也可是這樣的重組多肽，其為細胞的天然多肽，其由含有一個或多個對于核酸序列而言為異源的控制序列之核酸序列所編碼，其參與多肽的生產(chǎn)。編碼多肽的核酸序列可以已經(jīng)過如下所述的操作。在術語“異源多肽”的范圍之內，本發(fā)明也包含這樣的對于絲狀真菌細胞而言內源性多肽的重組生產(chǎn)，使得這樣的表達包括使用對于細胞而言非天然的遺傳元件，或使用了經(jīng)操作以在宿主細胞中非天然存在的方式行使功能的天然元件。多肽也可是一種雜合多肽，其含有從至少兩種不同的多肽中獲得的部分或完整多肽序列之組合，其中的一種或多種多肽對細胞而言可為異源的。多肽還包括上述多肽之天然存在的等位基因及基因工程變體。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述多肽是抗體或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或其變體、受體或其部分、調節(jié)蛋白、結構蛋白、報道分子或轉運蛋白質。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，酶是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。
在一個更進一步優(yōu)選的實施方案中，酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶(cutinase)、脫氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、鹵過氧化物酶(haloperoxidase)、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
在另一個更進一步優(yōu)選的實施方案中，多肽是人胰島素或其類似物、人生長激素、人第7因子、紅細胞生成素、或促胰島素(insulinotropin)。編碼異源及重組多肽的核酸序列編碼異源多肽的核酸序列可獲自任何原核、真核或其它來源，如古細菌。為本發(fā)明的目的，術語“獲自”如此處與給定的來源一起所用，是指多肽由該來源產(chǎn)生，或由其中已插入該來源的基因的細胞產(chǎn)生。
在本發(fā)明的方法中，細胞可用于對于細胞而言為天然的多肽的重組生產(chǎn)。天然多肽可重組地產(chǎn)生，如通過將編碼多肽的基因置于不同的啟動子控制之下以增加表達，通過使用信號序列促進目標天然多肽向細胞外的運輸，以及通過增加編碼該細胞天然產(chǎn)生的多肽之基因的拷貝數(shù)。本發(fā)明也包含這種天然多肽的重組生產(chǎn)。
用于分離或克隆編碼多肽的核酸序列的技術是本領域已知的，它們包括從基因組DNA分離，從cDNA制備，或其組合。從這樣的基因組DNA克隆本發(fā)明的核酸序列可這樣進行例如，通過應用熟知的聚合酶鏈反應(PCR)或表達文庫的抗體篩選，檢測具有共享結構特征的克隆化DNA片段。參見例如，Innis等，1990，“PCR方法和應用指南”(PCRA Guideto Methods and Application)，Academic Press，New York?？蓱闷渌怂釘U增方法，例如，連接酶鏈反應(LCR)，連接活化的轉錄(LAT)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。克隆方法可包括含有編碼多肽之核酸序列的目標核酸片段的切割與分離，將片段插入載體分子，將重組載體摻入細胞。核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成來源的或任一組合。
術語“分離的核酸序列”如此處所用是指一種基本上不含其它核酸序列的核酸序列，例如如瓊脂糖凝膠電泳所測定，至少約20％純，優(yōu)選至少約40％純，更優(yōu)選至少約60％純，甚至更優(yōu)選至少約80％純，最優(yōu)選至少約90％純。
可以用多種方法操作編碼異源多肽的分離的核酸序列，以表達多肽。在核酸序列插入載體之前對核酸序列的操作是期望的或必需的，這取決于表達載體。利用克隆方法進行核酸序列修飾的技術為本領域周知。
編碼多肽的核酸序列之修飾對于合成基本上與該多肽相似的多肽可能是必需的。術語與多肽“基本上相似”是指該多肽的非天然存在形式。這些多肽從基因工程角度講，可與從其天然來源分離的多肽不同。例如，可能希望利用諸如定點突變方法合成一種多肽的變體，其中變體在比活性、熱穩(wěn)定性、最適pH等方面不同。類似序列可在編碼該多肽之核酸序列基礎上構建，和/或通過將這樣的核苷酸置換導入，所述置換不會產(chǎn)生由核酸序列編碼的多肽之另一種氨基酸序列，但是其相應于旨在用于產(chǎn)生酶的宿主生物之密碼子偏好；或者通過導入可產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸置換。對于核苷酸置換的一般性描述，如見Ford等，1991，蛋白質表達與純化(Protein Expression and Purification)295-107。
可修飾核酸序列以制備表達盒，其中核酸序列可操作地與一種或多種控制序列連接，該控制序列在適于控制序列的條件下于適當?shù)乃拗骷毎兄笇Ь幋a序列的表達。應理解表達包括參與多肽產(chǎn)生的任一步驟，包括但不限于轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后加工及分泌。
“表達盒”在本文被定義為一種核酸分子(單鏈或雙鏈的)，它是從天然存在的基因分離的，或者已被修飾以包含核酸的區(qū)段(該區(qū)段以自然界不存在的方式被組合和排列，且包含表達編碼序列所需的全部控制序列)。術語“編碼序列”在本文被定義為被轉錄成mRNA和被翻譯成多肽的序列。基因組編碼序列的邊界一般是通過核糖體結合位點(原核)或通過ATG起始密碼子(真核)(恰好位于mRNA的5′端處開放閱讀框的上游)和轉錄終止子序列(恰好位于mRNA的3′端處開放約讀框的下游)來確定的。編碼序列可包括但不限于DNA、cDNA、RNA和重組核酸序列。
術語“控制序列”在本文被定義為包含對于多肽表達來說必要的或有益的所有組分。每種控制序列可以是對于編碼多肽的核酸序列而言天然的或異源的序列。這樣的控制序列包括但不限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎幼印⑥D錄終止信號和翻譯終止信號?？刂菩蛄锌膳c接頭一起提供，用以引入特異性限制位點，從而促進該控制序列與編碼多肽的核酸序列編碼區(qū)連接。術語“可操作地連接”在本文被定義為一種構型，其中，控制序列被適當?shù)刂糜谙鄬τ贒NA序列的編碼序列的位置，以使該控制序列指導多肽的生產(chǎn)。
控制序列可以是合適的啟動子序列、可被表達該核酸序列的絲狀真菌細胞識別的核酸序列。啟動子序列包含介導多肽表達的轉錄控制序列。所述啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示轉錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜合啟動子，且可得自編碼與宿主細胞同源的或異源的、胞外或胞內多肽的基因。
在細菌宿主細胞中指導表達盒轉錄的合適啟動子實例有如下啟動子大腸桿菌lac操縱子，天藍色鏈霉菌瓊脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢桿菌左聚蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖源淀粉酶基因(amyM)，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penP)，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因，和原核β-內酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，美國國家科學院學報753727-3731)，及tac啟動子(DeBoer等，1983，美國國家科學院學報8021-25)。更多的啟動區(qū)在下面文章中有描述“來源于重組細菌的有用蛋白質”，科學美國人，1980，24274-94；和Sambrook等，1989，出處同前。
用于指導在絲狀真菌宿主細胞中表達盒轉錄的適宜的啟動子例子有得自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根粘菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根粘菌脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、Fusariumoxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶(美國專利4,288,627)，及其突變的、截短的和雜合啟動子。特別優(yōu)選的啟動子是NA2-tpi啟動子(一種得自編碼黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸異構酶基因的啟動子雜合體)。
在酵母宿主中，有用的啟動子獲自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶基因(ENO-I)，釀酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)，釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因。其它可用于酵母宿主細胞的啟動子見Romanos等人，1992，酵母8423-488中所述。在哺乳動物宿主細胞中，有用的啟動子包括病毒啟動子，如來自猿猴病毒40(SV40)，勞氏肉瘤病毒(RSV)，腺病毒，牛乳頭狀瘤病毒(BPV)，及人巨細胞病毒(CMV)。
所述控制序列還可以是合適的轉錄終止子序列，即，一種被宿主細胞識別而終止轉錄的序列。該轉錄終止子序列被可操作地連接到編碼多肽的核酸序列的3′端。在所選宿主細胞中起作用的任一終止子都可被應用于本發(fā)明。
優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細胞的終止子得自編碼下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。
在酵母宿主中，優(yōu)選的終止子獲自編碼如下酶的基因釀酒酵母烯醇化酶基因，釀酒酵母細胞色素C(CYC1)，或釀酒酵母甘油醛3-磷酸脫氫酶基因。其它可用于酵母宿主細胞的啟動子見Romanos等人，1992，酵母8423-488中所述，出處同前。哺乳動物宿主細胞的終止子序列為本領域周知。
所述控制序列還可以是合適的前導序列，即mRNA的非翻譯區(qū)，它對于宿主細胞的翻譯是重要的。該前導序列被可操作地連接到編碼多肽的核酸序列的5′端。在所選宿主細胞中起作用的任何前導序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的用于絲狀真菌宿主細胞的前導序列得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷酸異構酶的基因。
用于酵母宿主細胞中的適當?shù)那皩蛄蝎@自釀酒酵母烯醇化酶基因(ENO-I)，釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因，釀酒酵母α-因子和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛3-磷酸脫氫酶基因(ADH2/GAP)。
所述控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，即一種這樣的序列其被可操作地連接到所述核酸序列的3′端，并且當轉錄時，它被宿主細胞作為一個信號識別而添加聚腺苷殘基到轉錄的mRNA。在所選宿主細胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本發(fā)明。
優(yōu)選的聚腺苷酸化序列得自編碼下列酶的基因米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α葡糖苷酶。
對于酵母宿主細胞有用的聚腺苷酸化序列如Guo和Sherman 1995，分子細胞生物學155983-5990所述。對于哺乳動物宿主細胞的聚腺苷酸化序列是本領域人員周知的。
所述控制序列還可以是信號肽編碼區(qū)，它編碼與所述多肽的氨基端連接的氨基酸序列，所述多肽指導編碼多肽進入細胞的分泌途徑。所述核酸序列的編碼序列的5′端可天然包含一個信號肽編碼區(qū)，所述編碼區(qū)符合翻譯讀框地與編碼分泌型多肽的編碼區(qū)段天然連接。所述編碼序列的5′端也可能包含相對于該編碼序列而言外源的信號肽編碼區(qū)。如果所述編碼序列通常不含信號肽編碼區(qū)，所述外源信號肽編碼區(qū)可能是需要的?；蛘?，該外源信號肽編碼區(qū)也可能僅僅替代天然信號肽編碼區(qū)，以使多肽的分泌增加。信號肽編碼區(qū)可得自曲霉屬的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因、根毛霉屬(Rhizomucor)的脂酶或蛋白酶基因、釀酒酵母α-因子基因、芽孢桿菌屬的淀粉酶或蛋白酶基因或牛前原凝乳酶基因。然而，任何指導表達的多肽進入所選宿主細胞分泌途徑的信號肽編碼區(qū)均可用于本發(fā)明。
在細菌宿主中有效的信號肽編碼區(qū)是來源于以下基因的信號肽編碼區(qū)芽孢桿菌NCIB 11837的產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶基因，地衣芽孢桿菌枯草蛋白酶基因，地衣芽孢桿菌β-內酰胺酶基因，嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT，nprS，nprM)，或枯草芽孢桿菌prsA基因。更多的信號肽描述可見Simonen和Palva，1993，微生物學評論57109-137。
用于絲狀真菌宿主細胞的有效的信號肽編碼區(qū)是獲自以下基因的信號肽編碼區(qū)米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐質霉(Humicola lanuginosa)纖維素酶基因或柔毛腐質霉脂酶基因。
酵母宿主細胞的有用信號肽還可獲自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉化酶。其它可用于酵母宿主細胞的信號肽見Romanos等人所述，1992，出處同前。
所述控制序列還可能是一個前肽編碼區(qū)，它編碼位于多肽的氨基端的氨基酸序列。生成的多肽被稱為“酶原”(proenzyme)或“多肽原”[或在某些情況下被稱為“酶原”(zymogen)]。多肽原一般是無活性的，可通過多肽原之前肽的催化分裂或自催化分裂，而從該多肽原轉化為成熟的活性多肽。前肽編碼區(qū)可得自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因(aprE)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶基因(nprT)、釀酒酵母α-因子、米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO95/33836)。
如果信號肽區(qū)和前肽區(qū)二者都存在于多肽的氨基端，那么，前肽區(qū)位于鄰近多肽的氨基端，信號肽區(qū)則位于鄰近前肽區(qū)的氨基端。
所述編碼多肽的表達盒還可能包括一個或多個其它核酸序列，這些核酸序列編碼一個或多個對于指導多肽的表達有益的因子，例如，轉錄激活因子(諸如反式作用因子)、伴侶分子和加工蛋白酶。在所選宿主細胞中起作用的任一因子都可應用于本發(fā)明。編碼一個或多個這些因子的核酸不必與編碼異源多肽的核酸序列串聯(lián)。
轉錄激活物是一種激活編碼多肽的核酸序列轉錄的蛋白質(Kudla等，1990，EMBO Journal 91355-1364；Jarai和Buxton，1994，當代遺傳學(Current Genetics)262238-244；Verdier.1990，酵母6271-297)。編碼激活物的核酸序列可從編碼以下的基因中獲得嗜熱脂肪芽孢桿菌NprA(nprA)，釀酒酵母血紅素激活物蛋白質1(hap1)，釀酒酵母半乳糖代謝蛋白質4(gal4)，構巢曲霉氨調節(jié)蛋白質(areA)，米曲霉α-淀粉酶激活物(amyR)。更進一步的例子見Verdier.1990，出處同前，和MacKenzie等，1993，普通微生物學雜志(Journal of GeneralMicrobiology)1392295-2307。
陪伴分子是幫助另一多肽正確折疊的蛋白質(Hard等，1994，TIBS1920-25Bergeron等，1994，TIBS 19124-128Demolder等，1994，生物工程雜志(Journal of Biotechnology)32179-189；Craig，1993，科學，2601902-1903；Gething和Sambrook，1992，自然，35533-45；Puig和Gilbert.1994，生物化學雜志(Journal of Biological Chemistry)2697764-7771；Wang和Tsou，1993，The FASEB Journal 71515-11157；Robinson等，1994.Bio/Technology 1381-384；Jacobs等，1993，分子微生物學(Molecular Microbiology)8957-966)。編碼陪伴分子的核酸序列可獲自編碼如下的基因枯草芽孢桿菌GroE蛋白質、枯草芽孢桿菌PrsA、米曲霉蛋白質二硫化物異構酶、釀酒酵母鈣聯(lián)結蛋白，釀酒酵母BiP/GRP78和釀酒酵母Hsp70。進一步的例子參見Gething和Sambrook，1992出處同前，和Hard等人，1994出處同前。
加工蛋白酶是切割肽原以產(chǎn)生成熟的生物化學活性多肽之蛋白酶(Enderlin和Ogrydziak，1994，酵母1067-79；Fuller等，1989，美國國家科學院院報，861434-1438；Julius等，1984，細胞，371075-1089；Julius等，1983，細胞，32839-852；美國專利No.5,702,934)。編碼加工蛋白酶的核酸序列可獲自編碼如下的基因釀酒酵母二肽酰氨肽酶、釀酒酵母Kex2、Yarrowia lipolytica二堿基(dibasic)加工內切蛋白酶(xpr6)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)金屬蛋白酶(p45基因)。
還可能希望添加調節(jié)序列，該調節(jié)序列能調節(jié)與宿主細胞的生長相關的多肽的表達。調節(jié)系統(tǒng)的實例有響應化學刺激物或物理刺激物(包括調節(jié)化合物的存在)而引起基因表達的開啟或關閉的那些。原核系統(tǒng)中的調節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、trp操縱子系統(tǒng)。酵母中，可使用ADH2系統(tǒng)活GAL1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可使用TAKA α淀粉酶啟動子、黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子作為調節(jié)序列。調節(jié)序列的其它實例有能使基因擴增的那些。在真核系統(tǒng)中包括在氨甲蝶呤存在下擴增的二氫葉酸還原酶，以及用重金屬擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況下，編碼異源多肽的核酸序列將可操作地與該調節(jié)序列連接。
上述各種核酸序列和控制序列可被連接在一起而產(chǎn)生可能包含一個或多個合適的限制位點的重組表達載體，所述限制位點可供在這樣的位點插入或替代編碼多肽的核酸序列。所述核酸序列也可通過將該序列或上述包含該序列的表達盒插入用于表達的合適載體中來表達。在產(chǎn)生重組表達載體時，編碼序列處于該載體中，使得該編碼序列與用于表達和合適的控制序列可操作地連接。
所述重組表達載體可以是任何載體(例如質?；虿《?，該載體可以方便地經(jīng)歷DNA重組操作而且能引起編碼多肽的核酸序列表達。該載體的選擇一般將取決于該載體與該載體被引入的宿主細胞的相容性。該載體可以是線形質?；蜷]合環(huán)狀質粒。該載體可以是自主復制型載體，即，一種作為染色體外的實體存在的載體，它的復制獨立于染色體復制，例如質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。所述載體可包含保障自主復制的任何方法?；蛘?，該載體也可以是這樣的載體當引入宿主細胞時，它被整合入基因組并與其所整合入的染色體一起復制。所述載體系統(tǒng)可以是單一的載體或質粒，或者是兩種或多種載體或質粒，它們共同包含將待導入宿主細胞基因組的全部DNA，或者是一種轉座子。
所述載體優(yōu)選包含一種或多種允許容易地選擇轉化的細胞之選擇性標記。一種選擇性標記是一種基因，它的產(chǎn)物可提供殺生物劑抗性或病毒抗性、對重金屬的抗性、營養(yǎng)缺陷體的原養(yǎng)型等。細菌可選擇性標記的例子是枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性，如氨芐青霉素抗性(amp)、卡那霉素抗性(kan)、氯霉素抗性(cam)、或四環(huán)素抗性(tet)的標記。用于哺乳動物細胞的適宜標記是二氫葉酸還原酶(dfhr)、潮霉素磷酸轉移酶(hygB)、氨基糖苷磷酸轉移酶II及腐草霉素抗性基因。適于酵母宿主細胞中的標記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于絲狀真菌宿主細胞中的選擇性標記可選自包括但不限于下組的物質amdS(乙酰胺酶)、argB(鳥氨酸氨基甲酰轉移酶)、bar(phosphinothricin乙酰轉移酶)、hygB(潮霉素磷酸轉移酶)、niaD(硝酸還原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脫羧酶)、sC(硫酸腺苷酸轉移酶)和trpC(鄰氨基苯甲酸合酶)，以及得自其它種的等同物。
所述載體優(yōu)選包含這樣的元件，即，該元件允許所述載體整合入宿主細胞基因組或所述載體在該細胞中獨立于該細胞的基因組而自主復制。
就整合入宿主細胞的基因組來說，所述載體可能依靠編碼多肽的核酸序列或者該載體的任何其它(通過同源重組或非同源重組將該載體穩(wěn)定整合入基因組的)元件?；蛘?，該載體也可能包含用于指導通過同源重組整合入宿主細胞基因組的另外的核酸序列。該另外的核酸序列能使載體整合入染色體的準確位置上的基因組。為了增大準確位置上整合的可能性，整合性元件應優(yōu)選包含足夠量的核酸，例如至少100～10,000個堿基對，優(yōu)選至少400～10,000個堿基對，最優(yōu)選至少800～10,000個堿基對，它們與相應的靶序列是高度同源的，從而提高同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件還可以是非編碼的或編碼的核酸序列。另一方面，所述載體可通過非同源重組被整合入宿主細胞的基因組。
就自主復制來說，所述載體可進一步包含一種復制起點，它能使該載體在所述絲狀真菌細胞中自主復制。細菌來源的復制起點例子是允許在大腸桿菌中復制的質粒pBR322、pUC19、pACYCl77和pACYC 184及允許在芽孢桿菌屬中復制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的復制起點。在酵母宿主中所用的復制起點是2μ復制起點、ARS1、ARS4、ARS1與CEN3的復制起點組合、及ARS4與CEN6的組合。復制起點可是一個具有使其在宿主細胞中的功能為溫度敏感型的突變的復制起點(見如，Ehrlich，1978，美國國家科學院院報751433)。
用于連接本文描述的因子而構建重組表達載體的方法是本領域技術人員熟知的(參見例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，“分子克隆，實驗手冊”，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。細胞本發(fā)明方法可用任何含有編碼目標多肽的核酸序列之細胞，包括原核細胞如細菌，或真核細胞如哺乳動物、昆蟲、植物和真菌細胞。細胞可為野生型或突變細胞。例如，突變細胞可是經(jīng)歷傳統(tǒng)誘變或遺傳操作的細胞。此外，細胞可為重組細胞，包括編碼如此處定義的異源多肽之核酸序列，其有益地用于異源多肽之重組生產(chǎn)。
有用的原核細胞是細菌細胞如，革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬的細胞，如嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、Bacillus lautus、遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)?；蜴溍咕鷮俚募毎鐪\青紫鏈霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)，或是革蘭氏陰性細菌，如大腸桿菌及假單胞菌屬的種(Pseudomonas sp.)。
在一個優(yōu)選實施方案中，細胞是真菌細胞?！罢婢比绱颂幩冒ㄗ幽揖T(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和接合菌門(Zygomycota)(Hawksworth等，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版所述，1995，CABinternational.University Press，Cambridge，UK)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，出處同前中所述，171頁)以及所有有絲分裂孢子型(mitosporic)真菌(Hawksworth等，1995出處同前)。代表性的子囊菌門包括例如，鏈孢菌屬(Neurospora)，真青霉屬(Eupenicillium＝青霉屬(Penicillium))，裸孢殼屬(Emericella，＝曲霉屬)，散囊菌屬(Eurotium，＝曲霉屬)以及真酵母。擔子菌門的代表性組包括蘑菇，銹菌屬及黑粉菌屬。壺菌門的代表性組包括如異水霉屬(Allomyces)，小芽枝霉屬(Blastocladiella)，雕蝕菌屬(Coelomomyces)和水生真菌。卵菌門的代表性組包括如水霉屬(Saprolegniomycetous)水生真菌(水霉)如綿霉屬(Achlya)。有絲分裂孢子型真菌包括鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬、假絲酵母屬(Candida)和青霉屬。結合菌門的代表性組包括毛霉菌屬(Mucor)、和根霉屬(Rhizopus)。
在一個優(yōu)選實施方案中，真菌細胞是酵母細胞。此處所用“酵母”包括產(chǎn)子囊酵母(內孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔子孢子囊酵母和屬于半知真菌的酵母(Blastomycetes)。產(chǎn)子囊酵母可分為蝕精霉科(Spermophthoraceae)和酵母科(Saccharomycetaceae)。后者包括四個亞科裂殖酵母亞科(Schizosaccharomycoideae，如裂殖酵母屬的種(Schizosaccharomyces))、拿遜酵母亞科(Nadsonioideae)、油脂酵母亞科(Lipomycoideae)和酵母亞科(Saccharomycoideae，如克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)的種)。產(chǎn)擔子孢子囊酵母包括線狀黑粉菌屬(Filobasidiella)、Filobasidium、白冬孢酵母屬(Leucosporidim)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)和鎖擲酵母屬(Sporidiobolus)。屬于半知真菌的酵母分為兩個科，擲孢酵母科(Sporobolomycetaceae，如布勒擲孢酵母屬(Bullera)和擲孢酵母屬(Sporobolomyces)的種)和隱球酵母科(Cryptococcaceae，如假絲酵母屬(Candida)的種)。由于酵母的分類在將來可能改變，對于本發(fā)明，可將酵母如酵母生物學及活性(Skinner等，1980，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述定義。酵母的生物學及酵母遺傳學操作為本領域公知。(見如酵母生物化學及遺傳學(Biochemistry and Genetics of Yeast)，Bacil，M.，Horecker，B.J.及Stopani，A.O.M.編第2版，1987；酵母(The Yeasts)，(Rose，A.H.，和Harrison，J.S.編)第2版，1987；及酵母屬酵母的分子生物學(TheMolecular Biology of the Yeas Saccharomyces)，Strathern等，編1981)。
在一個優(yōu)選實施方案中，酵母細胞是假絲酵母屬、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬、或Yarrowia屬的菌株。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是卡爾酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克魯維酵母(Saccharomyces kluyveri)、諾地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)細胞。在另一最優(yōu)選的實施方案中，酵母細胞是Yarrowia lipolytica細胞。
在另一優(yōu)選實施方案中，真菌細胞是絲狀真菌細胞?！敖z狀真菌”包括所有真菌門(Eumycota)及卵菌門(Oomycota)分類中的全部絲狀形式(如Hawksworth等，1995，出處同前)。絲狀真菌的一般特征為菌絲體壁由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖及其它復合多糖組成。營養(yǎng)性生長是通過菌絲伸長，且碳源代謝是需氧型。相反，酵母的營養(yǎng)性生長如釀酒酵母是通過單核菌體的出芽，且碳源代謝可以是發(fā)酵型。在一個更優(yōu)選的實施方案中，絲狀真菌細胞是如下，但不限于此的屬的種支頂孢屬(Acremonium)、曲霉屬、鐮孢屬(Fusarium)、腐質霉屬(Humicola)毛霉屬(Mucor)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、脈孢菌屬(Neurospora)、青霉屬(Penicillium)、柱霉屬(Scytalidium)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium及木霉屬(Trichoderma)菌株。
在更優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌是支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬細胞。
在最優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉(Aspergillus oryzae)細胞。在另一優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌細胞是桿孢狀鐮孢(Fusarium bactridioides)、Fusariumcerealis、Fusarium crookwellense、大刀鐮孢(Fusarium culmorum)、禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、并孢鐮孢(Fusarium heterosporum)、合歡木鐮孢(Fusarium negundi)、尖鐮孢(Fusarium oxysporum)、多枝鐮孢(Fusarium reticulatum)、粉紅鐮孢(Fusarium roseum)、接骨木鐮孢(Fusarium sambucinum)、膚色鐮孢(Fusarium sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides、Fusarium venenatum細胞。在另一優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌細胞是Humicola insolens、柔毛腐質霉、米黑毛霉(Mucormiehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)、產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpurogenum)或Thielavia terrestris細胞。在另一優(yōu)選實施方案中，絲狀真菌細胞是Trichoderma harzianum、康寧木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或綠色木霉(Trichoderma viride)細胞。
有用的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、Hela細胞、幼豚鼠腎細胞(BHK)、COS細胞或任一數(shù)量的可得永生化細胞，如獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。核酸構建體在本發(fā)明的方法中，將核酸構建體在這樣的基因座中導入親本細胞的基因組中，所述基因座不在編碼目標多肽的核酸序列之中?；蛘?，將核酸構建體在這樣的基因座中導入親本細胞，所述基因座位于核酸序列之串聯(lián)拷貝的一個中，或者位于含有重復序列的核酸序列中。
核酸構建體可為單鏈或雙鏈的任一核酸分子，其可為合成DNA，從天然基因分離的或經(jīng)過修飾以含有這樣的核酸區(qū)段，所述區(qū)段以不會天然存在的方式結合且并列。核酸構建體可為線性或環(huán)狀。此外，核酸構建體可含于載體中，可為限制性酶切割的線性化片段，或可為PCR擴增的線性片段。
核酸構建體可含有任意大小的任何核酸序列。在一個實施方案中，核酸構建體長度為約10-20000bp之間；優(yōu)選長度約100-15000bp，更優(yōu)選長度約500-15000bp，甚至更優(yōu)選長度約1000-15000bp，最優(yōu)選長度約1000-10000bp。
核酸構建體可作為兩個或更多的分離片段導入細胞。在使用兩個片段的情況中，兩個片段在一個片段的3’端及另一個的5’端共有足夠長的核酸序列同源性(重疊)，以使兩個片段一經(jīng)導入細胞即可經(jīng)歷同源重組，形成單一片段。然后產(chǎn)物片段成為適于與細胞序列重組的形式?？墒褂脙蓚€以上的片段，這些片段經(jīng)設計使得其相互之間經(jīng)歷同源重組，最終形成適于與細胞序列重組的形式。
應當知曉，兩個或更多的核酸構建體可以用本發(fā)明的方法以環(huán)狀或線性的形式被導入細胞，其中片段不含有如上述的重疊區(qū)。本領域周知，對于有些生物，多種構建體向細胞的導入可導致其整合于同一基因座。
核酸構建體可含有編碼或非編碼DNA序列。編碼序列如此處定義。
在一個優(yōu)選實施方案中，核酸構建體含有選擇性標記。所述選擇性標記的實例如前面所述。
在一個優(yōu)選實施方案中，構建體僅含有載體序列或是含有與選擇性標記結合的載體序列，包括含有復制起點的載體序列，如大腸桿菌載體序列(如pUCI9，pBR322或pBluescript)。例如一種含有復制起點的大腸桿菌載體，由于大腸桿菌的復制起點可促進整合后從宿主基因組中回收構建體。用限制性內切酶消化基因組DNA后可從宿主基因組中回收構建體，隨后是連接回收的構建體并轉化大腸桿菌。
在另一個優(yōu)選實施方案中，核酸構建體不含有多肽或其部分的核酸序列之編碼序列。在一個優(yōu)選實施方案中，核酸構建體含有與編碼多肽的核酸序列不同源的序列，以阻止構建體整合或破壞核酸序列。
優(yōu)選地，核酸構建體與編碼目標多肽的核酸序列的同源性不超過40％，優(yōu)選地不超過30％，更優(yōu)選地不超過20％，甚至更優(yōu)選地不超過10％，最優(yōu)選地無同源性。為本發(fā)明之目的，兩個核酸序列的同源性這樣測定通過Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman，1983，美國國家科學院院報，80726-730)測定的，即應用LASERGENETM MEGALIGNTM軟件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)，采用同一性表和下列序列多重對比參數(shù)間隙罰(gap penalty)為10，并且間隙長度罰(gap length penalty)為10。成對對比參數(shù)為Ktuple＝3，間隙罰＝3，窗(windows)＝20。
在另一優(yōu)選實施方案中，核酸構建體含有至少一個多肽或其部分的核酸序列之拷貝。在另一優(yōu)選實施方案中，核酸構建體含有與編碼多肽之核酸序列同源的序列。
當含有一個或多個編碼目標多肽之核酸序列拷貝的核酸構建體導入細胞，拷貝數(shù)的增加大于導入構建體之前細胞內核酸序列拷貝數(shù)與導入細胞中的構建體內的核酸序列拷貝數(shù)之和?；蛘?，當含有一個或多個編碼目標多肽之核酸序列的拷貝之核酸構建體導入細胞，拷貝數(shù)的減少大于導入構建體之前細胞內核酸序列拷貝數(shù)與導入細胞中的構建體內的核酸序列拷貝數(shù)之和。但是，可能需要以例如獨特性限制酶位點的方法標記包含于構建體內的核酸，使得可鑒定實際上整合入細胞基因組的構建體之序列拷貝數(shù)。
在另一優(yōu)選實施方案中，核酸構建體含有可轉移元件，即轉座子。一個轉座子是一種DNA分離片段，其可自身插入同一細胞的其它DNA序列中的不同位點。轉移過程中必須的蛋白質在轉座子中編碼。轉座子的末端通常是相同但是為彼此相反的方向。
在一個優(yōu)選實施方案中，核酸構建體可含有一種或多種控制序列，如啟動子自身或與選擇性標記一起，其中控制序列經(jīng)整合不與編碼目標多肽的核酸序列可操作地連接。這類控制序列可為啟動子、信號序列、原肽序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化序列、增強子序列和衰減子序列和內含子剪接位點序列。每一控制序列對細胞或編碼多肽的序列而言可為天然的或異源的。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體含有除了啟動子之外的控制序列。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體不含有控制序列。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體是pDSY82、pDSY112、pMT1612、pMT1936、pLRF2、pDSY153或pHB218。核酸構建體導入細胞可通過本領域周知的多種物理或化學方法將核酸構建體導入細胞，包括但不限于轉染或轉導、電穿孔、顯微注射、微顆粒轟擊、堿鹽或原生質體介導的轉化。
核酸構建體向細菌宿主細胞的導入可例如，通過原生質體轉化(見如，Chang和Cohen，1979，分子普通遺傳學(Molecular GeneralGenetics)，168111-115)，利用感受態(tài)細胞(見如，Young和Spizizin，1961，細菌學雜志(Journal of Bacteriology)，81823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，分子生物學雜志(Journal of MolecularBiology)，56209-221)，通過電穿孔(見如，Shigekawa和Dower，1988.生物技術(Biotechniques)，6742-751)，或通過偶聯(lián)(見如，Koehler和Thorne，1987，細菌學雜志，1695771-5278)等方法實現(xiàn)。
用于轉化曲霉屬細胞的適當方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，美國國家科學院院報811470-1474。用于轉化鐮孢屬細胞的適當方法描述于Malardier等，1989，基因78147-156，和WO 96/00787。
可利用Becker和Guarente，酵母遺傳學及分子生物學指南(Guide toYeast Genetics and Molecular Biology)，酶學方法(Methods ofEnymology)，194182-187；Ito等，1983，細菌學雜志，153163；及Hinnen等，1978，美國國家科學院院報，751920中所述轉化酵母。
可利用Graham和Van der Eb，1978，病毒學，52546中磷酸鈣沉淀法直接攝取轉化哺乳動物細胞。也可使用其它本領域已知的方法如電穿孔。
當核酸構建體為載體時，取決于所選細胞通過同源和/或非同源重組隨機發(fā)生整合入細胞基因組。
核酸構建體通過限制酶介導的整合(REMI)可導入親本細胞，REMI這種方法描述于Schiestl和Petes，1991，美國國家科學院院報，887585-7589，這種方法是將用限制性酶消化的質粒DNA與限制性酶一起導入細胞，隨后導致質粒DNA常常在由附加限制性酶限定的位點處整合入基因組。REMI的優(yōu)點在于其可產(chǎn)生這樣的突變，即突變的分子基礎可被容易的鑒別。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體以環(huán)狀分子的形式導入親本細胞。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體以載體的一部分的形式導入親本細胞。
在另一優(yōu)選的實施方案中，核酸構建體以線性片段的形式導入親本細胞。突變細胞的篩選將核酸構建體導入細胞后，下一步是從預計突變細胞的群落中分離出具有改變的目標核酸序列拷貝數(shù)之突變細胞，其中當在同一條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽。突變細胞的分離優(yōu)選最初通過測量在同一條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，相對于親本細胞突變細胞產(chǎn)生的多肽。突變細胞的分離可包括本領域周知的針對多肽的方法和/或用于測定核酸序列拷貝數(shù)的方法。用于測定基因拷貝數(shù)的方法為本領域周知，且包括Southern分析、定量PCR或實時PCR。
通過將核酸構建體導入生物體細胞中獲得的推定突變體群落首先利用標準鋪板技術進行純化，如那些用于經(jīng)典誘變的技術(見如，Lawrence，C.W.，1991，Christine Guthrie及Gerald R.Fink編，酶學方法，194卷，273-281，Academic Press，Inc.，San Diego)，單孢子分離，或加富技術。標準鋪板技術優(yōu)選地與檢測期望的多肽之方法一起使用。但是，無論用于鑒定帶有目標多肽之突變細胞的方法是否與鋪板培養(yǎng)物一起使用，經(jīng)純化的推定突變株優(yōu)選進一步表征，以證實由核酸序列編碼之多肽產(chǎn)生的增加或減少。此外，還期望核酸序列拷貝數(shù)的測定，以證實多肽產(chǎn)生的增加或減少是核酸序列拷貝數(shù)改變的結果。
可通過本領域已知的針對多肽的檢測方法鑒定特定多肽產(chǎn)生增加的突變細胞。多肽檢測的方法包括但不限于特異性抗體的使用，通過測定酶產(chǎn)物的形成或酶底物的減少測定酶活性，在含有酶底物的瓊脂平板上的透明區(qū)帶及生物活性檢測。
在一個優(yōu)選實施方案中，與親本細胞相比突變細胞產(chǎn)生的多肽的量高出或多出至少20％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少100％，更優(yōu)選至少100％-1000％，甚至更優(yōu)選至少200％-1000％，最優(yōu)選至少500％-1000％。
可利用上述相同的針對多肽的方法鑒定不再能產(chǎn)生特定多肽或產(chǎn)生能力降低的突變細胞，其中相比于親本細胞，測量的產(chǎn)量為零或降低。
在一個優(yōu)選實施方案中，與親本細胞相比突變細胞產(chǎn)生的多肽的量降低至少20％，優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少100％?；蜃诒景l(fā)明的方法中，可在“目標核酸序列之外的基因座”中導入核酸構建體是指未將核酸構建體導入多肽編碼序列、其控制序列或核酸序列編碼序列內的任意內含子序列中。當間插序列存在于核酸序列串聯(lián)拷貝之間時，可將構建體導入這些間插序列中?；蛘?，在本發(fā)明的方法中，核酸構建體可被導入“目標核酸序列之內的基因座”中，這是指將核酸構建體導入多肽編碼序列、其控制序列或核酸序列編碼序列內的任意內含子序列中。
控制序列包括與核酸序列可操作地連接且參與多肽產(chǎn)生的所有組分。這些控制序列包括但不局限于如此處所述的啟動子、信號序列、原肽序列、轉錄終止子、前導序列和聚腺苷酸化序列。每一控制序列相對于編碼序列可為天然的或異源的。
當基因座不在目標核酸序列之內時，基因座可與上述控制序列相鄰或不相鄰。優(yōu)選地，基因座是不相鄰的?；蜃膳c目標核酸序列處于同一染色體或同一染色體外元件，或處于不同染色體或不同染色體外元件。此外，基因座對細胞來說可為天然的或異源的。
在一個優(yōu)選實施方案中，基因座距離核酸序列的5’或3’末端至少100bp，優(yōu)選至少1000bp，更優(yōu)選至少2000bp，甚至更優(yōu)選至少3000bp，更加優(yōu)選至少4000bp，最優(yōu)選至少10,000bp。
在另一個優(yōu)選實施方案中，基因座與編碼目標多肽的核酸序列位于不同的染色體上。
在另一個優(yōu)選實施方案中，基因座編碼之多肽不同于由核酸序列編碼的多肽。
在另一個優(yōu)選實施方案中，基因座是編碼多肽的核酸序列。用插入的核酸構建體營救基因座及靶向構建體的用途本發(fā)明還涉及用插入的核酸構建體恢復(rescue)基因座的方法，包括從鑒定的突變細胞中分離(i)核酸構建體，及(ii)基因組的基因座之3′和5′側翼區(qū)，所述基因座中整合了核酸構建體；以及鑒定基因座之3′和5′側翼區(qū)。
可通過本領域周知的方法如用限制性酶切和隨后的連接及大腸桿菌轉化，反向PCR、隨機引物基因步移(walking)PCR或探查突變細胞文庫等方法分離核酸構建體和側翼區(qū)。帶有或不帶有3′和5′側翼區(qū)之分離的核酸構建體在此稱為“靶向構建體”。
靶向構建體包括距離核酸構建體整合位點上游和/或下游之間的100-9000bp，優(yōu)選200-9000bp，更優(yōu)選500-7000bp，甚至更優(yōu)選1000-7000bp，最優(yōu)選1000-3000bp。
本發(fā)明靶向構建體可被導入不同的細胞以改變多肽的產(chǎn)生，所述多肽與原初細胞中修飾的多肽類似、相同或完全不同。其他細胞可與原初細胞相同或屬于不同的種或不同的屬。如果原初細胞是真菌細胞，其他細胞優(yōu)選為真菌細胞。如果原初細胞為細菌細胞，則其他細胞優(yōu)選為細菌細胞。如果原初細胞為哺乳動物細胞，則其他細胞優(yōu)選為哺乳動物細胞。
當細胞為不同的細胞時，靶向構建體的整合優(yōu)選發(fā)生在這樣的靶基因座，其與該靶向構建體來源的原初細胞之基因座序列同源，即相同或足夠相似，使得靶向構建體和細胞DNA可經(jīng)歷同源重組，產(chǎn)生期望的突變。因此，靶向構建體的序列優(yōu)選與將進行同源重組之細胞染色體DNA的預選位點同源。但是，應當為本領域普通技術人員知曉，靶向構建體重新于靶基因座位點插入的概率取決于細胞，因為同源重組的頻率范圍可從釀酒酵母這樣的酵母中幾乎100％，變化到低至在曲霉屬中的1％。靶向構建體可通過非同源重組在非靶定基因座中整合，造成編碼目標多肽的核酸序列拷貝數(shù)的改變。
優(yōu)選地，靶定基因座包括具有與靶向構建體的側翼序列有高于40％同源性，優(yōu)選高于60％，更優(yōu)選高于70％，甚至更優(yōu)選高于80％，最優(yōu)選高于90％的同源性之DNA序列。兩個序列之同源性程度可用此處所述的Wilbur-Lipman方法測定。
靶向構建體可含有3’和5’區(qū)的任一個或二者均有，這取決于期望單一交叉或是替換。此外，可修飾靶向構建體以校正任何差錯事件，如重排、重復序列、刪除或插入，這些差錯發(fā)生在原初核酸構建體于基因座處導入并整合入細胞基因組的過程，該原初序列最初從該基因座恢復。
上述靶向構建體可以如限制性酶切割的線性核苷酸序列形式使用，或可被環(huán)化或插入適當?shù)妮d體。例如，環(huán)狀質粒或DNA片段優(yōu)選地采用單靶定序列。線性質?；駾NA片段優(yōu)選地采用兩個靶定序列。靶向構建體一經(jīng)導入細胞(所述細胞含有編碼目標多肽之核酸序列)，就在靶基因座或在非靶基因座(但優(yōu)選靶基因座)處整合入細胞的基因組，其可位于編碼目標多肽之核酸序列之內或之外。靶基因座可與目標DNA序列位于相同染色體或相同染色體外元件，或位于不同染色體或不同染色體外元件。當在相同條件下培養(yǎng)突變細胞及親本細胞時，相對于親本細胞，整合改變了編碼多肽之核酸序列的拷貝數(shù)。在一個優(yōu)選實施方案中，靶向構建體含有選擇性標記。
任選地，靶向構建體可以以兩個或多個分離的片段形式導入細胞。例如，當使用兩個片段時，片段間共有在一個片段3’端及另一個片段5’端同源(重疊)的DNA序列，兩個片段中一個攜帶第一靶定序列，另一個攜帶第二靶定序列。一經(jīng)導入細胞，兩個片段可經(jīng)歷同源重組，形成具有側翼為兩個原初片段之間的重疊區(qū)的第一及第二靶定序列之單一片段。產(chǎn)物片段然后呈適于同細胞靶序列同源重組的形式。可使用兩個以上經(jīng)設計的片段，使得其彼此間可經(jīng)歷同源重組，最終形成適于與細胞靶序列同源重組的產(chǎn)物。
一旦靶向構建體導入細胞，靶向構建體可通過包含一種可擴增的選擇性標記被進一步擴增，所述選擇性標記具有這樣的性質，即通過在適當選擇劑存在下培養(yǎng)細胞，以選擇含有選擇性標記擴增拷貝的細胞。
在一個優(yōu)選實施方案中，將一個或多個靶向構建體導入靶基因座。在另一個優(yōu)選實施方案中，每個靶向構建體改變編碼不同多肽之另一個核酸序列的拷貝數(shù)。在另一個優(yōu)選實施方案中，兩個或多個靶向構建體一起導入靶基因座，疊加性地或協(xié)同地作用，以改變編碼多肽之核酸序列的拷貝數(shù)。培養(yǎng)突變細胞及回收多肽的方法利用本領域周知的方法在適于多肽產(chǎn)生的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)目標多肽產(chǎn)生升高或降低的所選突變細胞。例如，細胞可通過搖瓶培養(yǎng)法培養(yǎng)，通過在合適的培養(yǎng)基中在使所述多肽能被表達和/或分離的條件下進行的、在實驗室用發(fā)酵罐或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)發(fā)酵、間歇發(fā)酵、補料分批發(fā)酵或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)。該培養(yǎng)是應用本領域已知的方法在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基(包含碳源和氮源和無機鹽)(參見如Bennett.J.W.和LaSure，L.，編，真菌基因操作增編(More GeneManipulations in Fungi)，Academic Press，CA.1991)中進行的。合適的培養(yǎng)基可從供應商獲得或者可按公開的組成(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心的產(chǎn)品目錄)制備。如果多肽分泌的話可直接從培養(yǎng)液中回收多肽。如果多肽未被分泌，則從細胞裂解物中回收。
可利用針對多肽的本領域周知的方法，如早先描述的那些方法或在實施例中描述的方法檢測多肽。
可通過本領域周知的方法回收多肽。例如，可通過包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀的常規(guī)方法從營養(yǎng)培養(yǎng)液中回收所述多肽。
可通過本領域已知的各種方法進一步純化多肽，這些方法包括但不限于層析法(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)，電泳法(例如制備型等電聚焦)，差示溶解度(例如硫酸銨沉淀)，或者提取(參見例如，“蛋白質純化”(Protein Purification)，J.C.Janson和Lars Ryden編，VCH Publishers，New York，1989)。獲得突變細胞的方法本發(fā)明還設計一種獲得突變細胞的方法。
在第一個實施方案中，獲得突變細胞的方法包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列拷貝之外的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的增加不是選擇壓力的結果；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，鑒定比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽的突變細胞。
在第二個實施方案中，獲得突變細胞的方法包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列拷貝之外的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的降低不是選擇壓力的結果；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，鑒定比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽的突變細胞。
在第三個實施方案中，獲得突變細胞的方法包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列拷貝之一內的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的增加不是選擇壓力的結果；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，鑒定比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽的突變細胞。
在第四個實施方案中，獲得突變細胞的方法包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列拷貝之一內的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的降低不是選擇壓力的結果；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，鑒定比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽的突變細胞。
在第五個實施方案中，獲得突變細胞的方法包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體在核酸序列拷貝之外的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，所述核酸序列在該核酸序列之5’和3’端含有重復序列，其中將核酸構建體整合入基因座中增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，鑒定比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽的突變細胞。
本發(fā)明通過下面的不應理解為限制本發(fā)明范圍的實施例進一步描述。
PDA含有39g/l馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Difco)，除非有其它特別注明，對pyrG營養(yǎng)缺陷型補加10mM尿苷。
pH 6.5的MY25培養(yǎng)基每升由25g麥芽糖，2.0g MgSO47H2O，10gKH2PO4，2.0g檸檬酸，10g酵母提取物，2.0g K2SO4，2.0g尿素和0.5ml微量金屬溶液組成。MY25搖瓶培養(yǎng)基用玻璃蒸餾水以1∶100或1∶1000稀釋，用于微量滴定生長實驗(MY25/100或MY25/1000)。培養(yǎng)物在34℃生長。
2X MY鹽(pH 6.5)溶液每升由4g MgSO47H2O，4g K2SO4，20gKH2PO4，4g檸檬酸，1ml微量金屬及2ml CaCl22H2O(100g/l儲藏原液)組成。
基本培養(yǎng)基轉化平板每升由6g NaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，1ml微量金屬溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O，342.3g蔗糖及20g的Noble瓊脂(pH 6.5)組成。基本培養(yǎng)基轉化平板(pH6.5)每升由6gNaNO3，0.52g KCl，1.52g KH2PO4，1ml微量金屬溶液，1g葡萄糖，500mg MgSO4-7H2O，及20g的Noble瓊脂組成。
微量金屬溶液(1000X)每升由22g ZnSO4-7H2O，11g H3BO3，5gMnCl24H2O，5g FeSO47H2O，1.6g CoCl25H2O，1.6g(NH4)6Mo7O24，及50g Na4EDTA組成。
COVE平板每升由343.3g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10ml 1M乙酰胺，10ml 3M CsCl及25g Nobel瓊脂。COVE微量金屬鹽(50X)溶液每升由26g KCl，26g MgSO47H2O，76g KH2PO4和50ml COVE微量金屬溶液組成。COVE微量金屬溶液每升由0.04g NaB4O710H2O，0.040gCuSO45H2O，0.70g FeSO4H2O，0.80g Na2MoO22H2O及10g ZnSO4組成。
YEG培養(yǎng)基每升由5g酵母提取物及20g葡萄糖組成。
BASTA平板每升含有342.3g蔗糖，20ml COVE鹽溶液，10ml 1M尿素，25g Noble瓊脂及5mg/ml終BASTA濃度，用于篩選轉化子。用于BASTA轉化的上層平板具有上述BASTA平板的相同組分。BASTA轉移平板同上，只是含有10mg/ml BASTA。實施例1米曲霉HowB430的構建構建含有來自柔毛腐質霉(LIPOLASETMgene，Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麥)的脂酶基因的米曲霉HowB430。
如下述構建含有TAKA/NA2-tpi前導雜合啟動子，來自柔毛腐質霉的脂酶基因，AMG終止子以及作為選擇標記的全長構巢曲霉amd S基因的pBANe8。
利用PCR，采用下面的引物1及2插入位于pToC90(Christensen等，1988，生物工程學，61419-1422)全長amd S基因側翼之NsiI位點，采用下面的引物3及4在pJaL292(圖1)NA2-tpi前導雜合啟動子的5’端插入EcoRI位點，在其3’端插入SwaI位點。用Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)根據(jù)制造商說明合成引物。引物1S′-ATGCATCTGGAAACGCAACCCTGA-3′引物25′-ATGCATTCTACGCCAGGACCGAGC-3′引物35′-TGGTGTACAGGGGCATAAAAT-3′引物45′-ATTTAAATCCAGTTGTGTATATAGAGGATTGTGG-3′利用約0.2μg的pToC90或pJaL292作為模板準備擴增反應(100μl)。每一反應含有如下成分0.2μg質粒DNA，48.4pmol正向引物，48.4pmol反向引物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1 mM，1x Taq DNA聚合酶緩沖液，及2.5U TaqDNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Branchburg，NJ)。反應在Ericomp熱循環(huán)儀中以如下程序進行溫育95℃5分鐘一個循環(huán)，隨后為30次循環(huán)95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘。
PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠中電泳，證實存在2.7kb的amdS片段及0.6kb的NA2-tpi片段。
PCR產(chǎn)物隨后按照制造商指示利用TA克隆試劑盒(Invitrogen，SanDiego，CA)亞克隆入pCRII。然后通過按照制造商指示利用QIAwell-8質粒試劑盒(Qiagen.Inc..Chatsworth，CA)從轉化子中提取質粒DNA，篩選轉化子。然后用NsiI或EcoRI/SwaI限制性消化質粒DNA，通過瓊脂糖電泳證實分別存在2.7 kb和0.6 kb的NsiI amdS片段與SwaI/EcoRI NA2-tpi片段。為證實PCR產(chǎn)物，將產(chǎn)物用Applied Biosystems Model373A自動DNA測序儀(Applied Biosystems.Inc.，F(xiàn)oster City，CA)利用引物步行技術對產(chǎn)物的兩條鏈測定序列(Giesecke等，1992，病毒學方法雜志，3847-60)，所述技術利用染料終止化學法采用了M13反向(-48)和M13正向(-20)引物(New England Billabs，Beverly，MA)，及對待測序的DNA特異的引物。來自正確轉化子的質粒然后用限制性酶消化，對經(jīng)消化的質粒在1％瓊脂糖凝膠上分離，按照制造商指示用FMC SpinBind試劑盒(FMC，Rockland，ME)純化。
含有TAKA淀粉酶啟動子、多接頭、AMG終止子及構巢曲霉pyrG基因的pKS6(圖2)經(jīng)EcoRI和SwaI酶切以去除TAKA淀粉酶啟動子。該區(qū)域用NA2-tpi PCR產(chǎn)物替代，以產(chǎn)生pBANe 13(圖3)。
用NsiI消化pBANe 13以去除構巢曲霉pyrG基因。該區(qū)域用上述全長amdS基因PCR產(chǎn)物替代，以產(chǎn)生pBANe 6(圖4)。
采用如下引物5和6由PCR將SwaI和PacI位點插入全長pMHan37的柔毛腐質霉脂酶基因(圖5)的側翼引物55’-ATTTAAATGATGAGGAGCTCCCTTGTGCTG-3’引物65 ′-TTAATTAACTAGAGTCGACCCAGCCGCGC-3’擴增反應(100μl)含有如下成分0.2μg的pMHan37，48.4pmol引物5，48.4pmol引物6，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，1x TaqDNA聚合酶緩沖液，及2.5U TaqDNA聚合酶。反應在Ericomp熱循環(huán)儀中以如下程序進行溫育95℃5分鐘一個循環(huán)，隨后為30次循環(huán)95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘。2μl反應產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中電泳，證實約900bp的脂酶基因產(chǎn)物的擴增。
將PCR擴增的脂酶基因產(chǎn)物隨后利用TA克隆試劑盒亞克隆入pCRII。然后通過利用QIAwell-8質粒試劑盒從轉化子中提取質粒DNA，篩選轉化子。用SwaI/PacI限制性消化質粒DNA，根據(jù)上述方法進行DNA測序以證實PCR產(chǎn)物。
通過用SwaI和PacI消化將脂酶基因從pCRII質粒中切出，隨后亞克隆入SwaI/PacI消化的pBANe6中得到pBANe8(圖6)。
用PmeI消化pBANe8，然后利用40mM Tris-乙酸-1mM EDTA二鈉(TAE)緩沖液進行制備型瓊脂糖電泳，分離含有NA2-tpi啟動子的線性PmeI片段、柔毛腐質霉的脂酶基因以及AMG終止子。
通過按照如下方法用線性PmeI片段轉化米曲霉HowB425得到米曲霉HowB430。
在100毫升1％酵母提取物-2％蛋白胨-1％葡萄糖中32℃下以150轉/分攪拌培養(yǎng)米曲霉HowB425 16-18小時。經(jīng)0.45毫米濾膜過濾回收菌絲體，直到約10毫升留在濾膜上。用25毫升1.0-1.2M MgSO4-10mM磷酸鈉(pH6.5)洗滌，如前述過濾，再次如前述洗滌，直至剩余10毫升，然后在125毫升Ehrlenmeyer燒瓶中重懸于10毫升的5mg/ml NOVOZYM 234TM(Novo Nordisk A/S.Bagsvaerd.，丹麥)(1.2M MgSO4-10mM磷酸鈉，pH6.5(0.45微米)過濾的溶液)。懸浮液在50轉/分的溫和攪拌下于37℃溫育約1小時，以產(chǎn)生原生質體。將10毫升體積的原生質體/菌絲體制品加入30毫升Corex離心管，覆蓋以5毫升0.6M山梨醇-10mM Tris-HCl pH 7.5，在大容量轉頭架中以3600×g離心15分鐘，回收原生質體。用巴氏吸液器從緩沖液交界面回收原生質體。然后用5倍體積的STC洗滌，離心，再次洗滌并如前述離心。將原生質體重懸于STC至終濃度為每毫升2×107原生質體。
米曲霉HowB425轉化的amdS篩選用濃度為2×107/毫升原生質體進行。10μgDNA加入100毫升原生質體中。然后加入體積為250毫升的PEG溶液(60％PEG 4000-10mMCaCl2，-10mM Tris-HCl pH 8.0)，混合物于37℃放置30分鐘。加入3毫升1M山梨醇-10mM CaCl2-10mM Tris pH 7.5(STC)，將混合物鋪板于補加用于amd S篩選的10mM尿苷之Cove平板。將平板于34℃溫育7-10天。將轉化子轉移到相同培養(yǎng)基的平板，于37℃溫育3-5天。在相同條件下采用相同培養(yǎng)基(無蔗糖)的平板通過孢子劃線法挑選分離的菌落，純化轉化子。實施例2質粒pSO122、pDSY81及pDSY82的構建如下述構建質粒pSO122，以含有米曲霉pyrG基因的1.5kb片段。
從米曲霉1560基因組文庫構建pSO2(圖7)。米曲霉1560的基因組文庫首先通過用Sau3A(New England Biolabs.Beverly，MA)部分消化米曲霉1560基因組DNA構建。按照制造商推薦的條件采用4單位Sau3A消化10μg米曲霉1560基因組DNA。反應在65℃進行，以5分鐘間隔取樣(從0-50分鐘)。將樣品置于冰上，通過加入10μM的EDTA終止反應。將這些消化物于帶有溴乙啶的1％瓊脂糖凝膠上電泳，切出含有3kb-9kbDNA的凝膠。使用由制造商提供的方法(New England Biolabs.Beverly，MA)利用Beta-Agarase I從凝膠切塊中純化DNA。按照制造商指示(Clontech.Palo Alto，CA)在制造商推薦的條件下于16℃過夜，將所選大小的DNA連接入EMBL4手臂。依制造商的方法利用Gigapack II包裝試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)將連接反應物包裝并滴定?？偣搏@得16000個重組噬菌斑，利用制造商提供的方法擴增文庫。
如EMBL 4手臂所提供的方法中所述，將基因組文庫適當稀釋以獲得每150mm培養(yǎng)皿7000個噬菌斑。采用標準方法(Sambrook等，1989，出處同前)將噬菌斑轉移至Hybond-N+環(huán)狀濾膜(Amersham.Cleveland.OH)。利用UV交聯(lián)固定濾膜，并在42℃預雜交(5X SSPE，35％甲酰胺)。用由黑曲霉pyrG構成的500bp片段以低嚴謹度(35％甲酰胺，5X SSPE，42℃)探查基因組文庫，所述片段用隨機引物DNA標記試劑盒(BoebringerMannheim，Indianapolis.IN)以32P標記。從一個噬菌斑中分離到3.8 kbHindIII片段，亞克隆入pUC 118克隆載體，制備pSO2。
利用如下所示引物7和8，采用PCR將BamHI限制性位點導入pSO2的pyrG基因之5’端，產(chǎn)生pSO122。引物7和8以制造商指示用AppliedBiosystems Model 394 DNA/RNA合成儀合成。
引物75′-GCGGGATCCCTAGAGTAGGGGGTGGTGG-3′引物85′-GCGGGATCCCCCCTAAGGATAGGCCCTA-3’
擴增反應(50μl)含有如下成分2ng pSO2，48.4pmol正向引物，48.4pmol反向引物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，1x Taq DNA聚合酶緩沖液，及2.5U TaqDNA聚合酶。反應在Ericomp熱循環(huán)儀中以如下程序進行溫育95℃5分鐘一個循環(huán)，隨后為30次循環(huán)95℃1分鐘，55℃1分鐘，72℃2分鐘。通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物。
用BamHI消化分離的PCR單于，并克隆入pBluescript SK-(Stratagene，La Jolla，CA)的BamH I位點，產(chǎn)生pSO122(圖8)。米曲霉HowB430和pSO122基因組之間的僅有的同源性在pyrG插入片段的5’端，因為其余pyrG片段如實施例1所述被從米曲霉HowB430中刪除。
為了降低針對基因組該同源性區(qū)域的靶定頻率且由于pSO122含有兩個BamHI位點，構建了兩個pSO122的衍生物pDSY81和pDSY82(圖8)，其中的一個BamHI位點被破壞。通過用BamHI部分消化pSO122，用Klenow片段補平5’懸垂，經(jīng)連接關閉質粒，構建pDSY81和pDSY82，然后轉化入大腸桿菌DH5α(Sambrook等，1989，出處同前)。然后通過使用QIAwell-8質粒試劑盒提取質粒DNA篩選轉化子，用BamHI限制性消化質粒DNA確定是否一個BamHI位點已被破壞。具有一個BamHI位點已被破壞的質粒用NsiI/BamHI消化，以測定哪一個BamHI位點已被破壞。實施例3用pSO122、pDSY81或pDSY82轉化米曲霉HowB430如實施例1所述制備米曲霉HowB430的原生質體。將5-15μl的DNA等份(用4-12 U的EcoRI使環(huán)狀pSO122和pDSY81線性化，或用15UBamH I使pDSY82線性化)加入14毫升Falcon聚丙烯管中的0.1毫升原生質體中(原生質體濃度2×107/毫升)，然后加入250μl 60％PEG4000-10mMCaCl2-10mM Tris-HCl(pH7)，溫和混勻，于37℃溫育30分鐘。轉化可用5μg環(huán)狀pSO122、6μg線性化pDSY81或6μg線性化pDSY82之任一種進行。然后加入3毫升SPTC(1.2M山梨醇-10mM CaCl2-10 mM TrispH 8)，輕輕混合懸浮液。用12毫升融化的上層瓊脂(1X COVE鹽，1％NZ胺，0.8M蔗糖，0.6％Noble瓊脂)或3毫升STC培養(yǎng)基與懸浮液混合，將懸浮液鋪板于基本培養(yǎng)基平板。平板于37℃溫育3-5天。
環(huán)狀pSO122轉化的轉化頻率為約100-200個轉化子/μg。獲得了約120,000個轉化子的米曲霉HowB430文庫。
EcoRI REMI pDSY81轉化的轉化頻率為約60-100轉化子/μg。獲得了約28,000個轉化子的米曲霉HowB430之EcoRI REMI文庫。
BamH I REMI pDSY82的轉化頻率為約80-110轉化子/μg。獲得了約27,000個轉化子的米曲霉HowB430之BamH I REMI文庫。
也利用pDSY81如上述制備了米曲霉HowB430的HindIII及SalIREMI文庫。
Hind III REMI pDSY81轉化的轉化頻率為約80-120個轉化子/μg。產(chǎn)生了約35,000個轉化子的米曲霉HowB430之Hind III REMI文庫。
SalI REMI pDSY81的轉化頻率為約80-110轉化子/μl。獲得了約25,000個轉化子的米曲霉HowB430之SalI REMI文庫。
米曲霉HowB430之文庫的集合分別命名如下“h”為pSO122；“e”為用EcoRI消化的pDSY81，隨后在EcoRI存在下轉化；“b”為用BamHI消化的pDSY82，隨后在BamHI存在下轉化；“hIII”為用HindIII消化的pDSY81，隨后在HindIII存在下轉化；“s”為用SalI消化的pDSY81，隨后在SalI存在下轉化。有123個＂h＂集合，28個＂e＂集合，23個＂b＂集合，55個＂hIII＂集合及25個＂s＂集合。
上述文庫合并成各個約1000個轉化子的組，于-80℃貯存在10％甘油中。實施例4脂酶表達篩選鑒定實施例3中所述米曲霉HowB430突變文庫＂h＂、＂e＂、＂b＂、＂s＂及＂hIII＂的脂酶表達。
對于96孔板篩選，用由等體積的無菌水及2X MY鹽(pH 6.5)溶液制備的稀釋液稀釋MY25培養(yǎng)基1000倍。對于24孔板篩選方法，用由等體積的無菌水及2X MY鹽(pH 6.5)溶液制備的稀釋液稀釋MY25培養(yǎng)基100倍。
初級96孔板篩選包括從獨立的文庫集合中稀釋孢子入MY25/1000，使得當將50毫升培養(yǎng)基分散入各個孔時，平均每孔接種一個孢子。接種后，將96孔板在靜止條件下于34℃生長7天。然后如下述鑒定脂酶活性。將目標突變體直接接種入含有MY25/100的24孔板，34℃生長7天。然后如下述鑒定脂酶活性。將目標突變體鋪板于COVE平板以產(chǎn)生孢子，再鋪板于PDA平板，以產(chǎn)生單個菌落，然后在24孔板中用上述方法測試每個分離物的4個單個菌落。
脂酶分析底物的制備如下使用前，將對硝基苯基丁酸儲備液底物1∶50稀釋(21μl對硝基苯基丁酸/毫升DMSO)入MC緩沖液(4mM CaCl2-100mM MOPS pH 7.5)。制備標準脂酶(LIPOLASETM， Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麥)，以含有40 LU/ml MC緩沖液，所述緩沖液中含有0.02％α-烯烴磺酸酯/鹽(AOS)去污劑。將標準物置于4℃?zhèn)溆?。使用前將標準脂酶在MC緩沖液中1∶40稀釋。肉湯樣品在含有0.02％AOS去污劑的MC緩沖液中稀釋，并將20μl等份加入96孔板的孔中，隨后加入200μl稀釋的底物。利用孔板讀數(shù)儀，在405nm處記錄吸光度，記錄間隔大約1分鐘的兩次讀數(shù)的差異。相對于脂酶標準計算脂酶單位/毫升(LU/毫升)。
經(jīng)96孔板篩選及隨后的24孔板篩選的結果鑒定了用于進一步評價的pSO 122轉化的轉化子360個，pDSY81或pDSY82 REMI轉化的轉化子44個。這些經(jīng)鑒定的轉化子與對照菌株米曲霉HowB427和米曲霉HowB430相比，產(chǎn)生更高水平的脂酶。實施例5搖瓶、發(fā)酵及脂酶基因拷貝數(shù)評價將實施例4中所述脂酶產(chǎn)量最高的突變株鋪板于COVE平板，以產(chǎn)生用于搖瓶及發(fā)酵評估的孢子。
通過將300-500毫升的孢子懸浮液(0.02％Tween-80加COVE平板的孢子)接種入125毫升搖瓶中25毫升的MY25培養(yǎng)基(pH 6.5)內，進行搖瓶評估。以200轉/分在34℃下培養(yǎng)搖瓶3天。于第2天和第3天取樣，如實施例4中所述測定脂酶活性。
將相同突變株在含有由Nutriose、酵母提取物、(NH4)2HPO4，MgSO47H2O、檸檬酸、K2SO4、CaCl2H2O及微量金屬元素構成的培養(yǎng)基之2升實驗室發(fā)酵罐中，34℃ pH7下以1000-1200轉/分生長8天。如實施例4中所述測定脂酶活性。
米曲霉突變株中的脂酶拷貝數(shù)通過實時PCR分析測定，PCR分析采用Applied Biosystems Prism Model 7700序列測定儀(AppliedBiosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)依照制造商指示進行。對脂酶及單拷貝基因對照oliC的每個基因組DNA制品進行實時PCR反應。在小培養(yǎng)皿平板上于34℃將突變株的孢子在5毫升YEG培養(yǎng)基上生長24小時。通過經(jīng)Whatman 1號濾紙(Whatman，Springfield Mill，英國)過濾從各個培養(yǎng)物中收集菌絲體，轉移入1.7毫升的離心管。在液氮中冷凍菌絲體，于SpeedVac(Savant Instruments.，Inc.，F(xiàn)amiingdale.，NY)中室溫下干燥過夜。利用DNeasy Kit(Qiagen，Chatsworth，CA)依照制造商指示獲得基因組DNA。通過比照脂酶復制子數(shù)量與oli C復制子數(shù)量的比例，計算各個菌株的平均脂酶拷貝數(shù)。利用米曲霉HowB430的基因組DNA產(chǎn)生用于分析的標準曲線。使用下列引物及探針組進行實時脂酶基因的擴增脂酶基因探針6FAM-5′-TGGCCAGTCCTATTCGTCGAGAGGTC-3′-TAMRA脂酶基因正向引物(lipo 9F)5′-CTCCCTTGTGCTGTTCTTTGTCT-3′脂酶基因反向引物(lipo 111R)5′-CTGTGCAAAGAGATTGAACTGGTTA-3′使用下列引物及探針組進行oliC實時擴增oliC探針6FAM-5′-TGGGTATGGGTTCCGCCGCC-3′-TAMRAoliC正向引物(oliC4F)5′-GATGGTCCAGGTCTCCCAGAA-3′oliC反向引物(oliCl22R)5′-CAGGGTTGCGGGAGACA-3′6FAM是熒光報道分子6-羧基熒光素的縮寫，其與探針的5’端共價連接，TAMRA是6-羧基四甲基羅丹明的縮寫，其是通過連接臂與探針3’端結合的湮滅劑。
為了標準曲線，用1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000系列稀釋米曲霉HowB430基因組DNA，且對引物組和探針組均進行實時PCR。為了分析其它菌株，以1∶50及1∶100或者以1∶100及1∶200稀釋基因組DNA，且對引物組和探針組均進行實時PCR。依照制造商指示利用TaqMan PCR試劑試劑盒(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)oster City，CA)進行實時PCR反應。反應含有1X TaqMan緩沖液A，3.5mM MgCl2，dATP、dCTP、dGTP及dUTP各200μM，0.025U/ml AmpliTaq Gold，0.01U/ml AmpErase，以及100nM的脂酶基因或oliC探針。以終濃度0.9μM加入各個脂酶引物。以終濃度0.3μM加入各個oliC引物。利用如下的循環(huán)條件在AppliedBiosystems Prism Model 7700序列檢測儀上進行反應，即50℃2分鐘1個循環(huán)，95℃10分鐘1個循環(huán)，以及40個循環(huán)95℃15秒，60℃1分鐘。利用Sequence Detector v 1.6分析原始數(shù)據(jù)。
獲得的結果示于如下表1，其中將作為對照的米曲霉HowB427或米曲霉HowB430之脂酶產(chǎn)量標準化為1.0，將米曲霉HowB430的平均脂酶基因拷貝數(shù)標準化為1.0。
表1脂酶表達及突變株的脂酶基因拷貝數(shù)菌株 構建物 文庫 搖瓶結果 平均相對拷貝HowB430 HowB425+pBANe8NA 1.0 1.0HowL371.3 pSO122h2.5 1.56HowL500.1 pSO122h2.7 1.25HowL795.4 pSO122h3.8 1.75HINL981 pDSY81hIII 5.9 5.62HINL949 pDSY81hIII 5.7 5.81HINL917 pDSY81hIII 5.6 5.38HINL980 pDSY81hIII 4.6 3.81SALL678 pDSY81s3.7 2.19SALL714 pDSY81s3.4 2.56BAML5 pDSY82b3.0 1.62HINL985 pDSY81hIII 2.9 1.56ECOL56 pDSY82e2.7 1.50HINL990 pDSY81hIII 2.4 1.62HINL955 pDSY81hIII 2.4 2.37HINL933 pDSY81hIII 2.3 1.75
如表1所示，當在搖瓶中生長時，與對照菌株米曲霉HowB430相比，突變株產(chǎn)生約多2-6倍的脂酶。當在發(fā)酵罐中(未對所有菌株測試)時，發(fā)酵罐中測試的突變株比對照菌株米曲霉HowB427產(chǎn)生約多2-5倍的脂酶。實施例6 pMTI936的構建利用下列依照制造商指示由Applied Biosystems Model 394DNA/RNA合成儀合成的引物，構建pMT1936，使之含有示于WO 98/11203中的米曲霉1560之palB基因。1007525-GGTTGCATGCTCTAGACTTCGTCACCTTATTAGCCC-3′1007535′-TTCGCGCGCATCAGTCTCGAGATCGTGTGTCGCGAGTACG-3′1007545′-GATCTCGAGACTAGTGCGCGCGAACAGACATCACAGGAACC-3′1007555-CAACATATGCGGCCGCGAATTCACTTCATTCCCACTGCGTGG-3′從利用述于實施例1中的方法獲得的米曲霉1560之基因組DNA，利用PCR擴增米曲霉palB 5′側翼序列及編碼palB產(chǎn)物的N-末端部分的序列。大約使用了0.05μgDNA模板及兩個引物(引物100755和100754)各5pmol。如制造商所述使用聚合酶Pwo進行擴增(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。擴增經(jīng)過了40個循環(huán)。部分反應產(chǎn)物用苯酚提取、乙醇沉淀、用限制性酶EcoRI和XhoI消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離約1.05kb的片段。
如上述獲得米曲霉palB 3′側翼序列及編碼palB基因產(chǎn)物C-末端部分的序列，除了采用引物100753和100752進行擴增以及在用凝膠電泳回收約1.5kb片段之前用限制性酶XhoI和XbaI消化PCR產(chǎn)物。
將如上所述消化及純化的PCR片段以三方連接的方法與載體pJaL400(圖9)純化的2.7kb EcoRI-XbaI片段連接，得到pMT1935(圖10)。通過由PCR引物100754和100753引入的BssHII、SpeI和XhoI位點分離pMT1935的palB之5’側翼和3’側翼。
為了在pMT1935的palB之5’側翼和3’側翼之間插入米曲霉pyrG基因，將含有重復的pyrG基因側翼的pJaL394(圖11)之3.5kb HindIII片段克隆入經(jīng)HindIII酶切、去磷酸化的、純化的pBluescript II SK-中。獲得了具有任一方向的插入片段之質粒。選擇了一個質粒pMT1931(圖12)，其中pBluescript多接頭的SpeI位點位于pyrG基因下游，XhoI位點位于pyrG基因上游。pyrG基因以3.5kb的SpeI-XhoI片段分離，并插入經(jīng)SpeI和XhoI消化的、純化的pMT1935中，產(chǎn)生破壞質粒pMT1936(圖13)。
pyrG可選擇性palB破壞盒可以以5.5kb AseI-PuvI片段(AseI與PuvI在實際的palB之5’和3’側翼序列內切割)的形式從pMT1936中分離。實施例7用pMT1936的AseI/PvuI palB破壞盒轉化米曲霉及脂酶篩選用獲自pMT1936的5.5kb之AseI/PvuI片段以如實施例3中所述的相同轉化方法轉化米曲霉HowB430。用于轉化的線性片段通過如下方法分離用AseI和PvuI消化pMT1936，利用QiAquick凝膠提取試劑盒依照制造商指示將分離的片段在1％瓊脂糖凝膠上分離。然后通過在基本培養(yǎng)基平板(pH 6.5或pH 8.0)上生長測試轉化子。如實施例5所述測定平均脂酶基因拷貝數(shù)。
結果顯示，測試的128個轉化子中有13個含有palB-表型，如其不能在pH 8.0下生長所示。將13個palB-表型的菌株與13個能在pH 8.0下生長的轉化子經(jīng)孢子純化，在搖瓶中培養(yǎng)進行評估，分別采用實施例4和5中所述測定搖瓶培養(yǎng)物中脂酶產(chǎn)生。如實施例5中所述測定平均脂酶基因拷貝數(shù)。
結果示于下面的表2，其中米曲霉HowB430的脂酶產(chǎn)生與平均脂酶基因拷貝數(shù)被標準化為1.0。5個不能比米曲霉HowB430產(chǎn)生更多脂酶的palB-菌株均損失了50％或更多的脂酶表達盒。
表2菌株 palB表型搖瓶結果平均相對拷貝數(shù)HowB430 + 1.0 1.0
DEBYIO.3- 2.2 1.0palB24-l- 1.7 0.38palB29-I- 1.0 0.31palB46-l- 0.6 0.31palB78-l- 1.6 0.44palB91-I- 1.3 0.38實施例8用NdeI線性化的pDSY138轉化米曲霉及脂酶表達篩選用來自米曲霉DEBY932(WO 98/11203)的NdeI線性化pDSY138之分離物轉化米曲霉HowB430，利用實施例3中所述的方法回收轉化子。一共將180個回收的轉化子在24孔微量滴定板上于1/100強度的MY25培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于第4天和第6天取樣，用于如實施例4所述分析脂酶。產(chǎn)生脂酶最高的前11個轉化子及1個平均脂酶產(chǎn)量的轉化子經(jīng)孢子純化，在24孔微量滴定板培養(yǎng)基上重新測試。這些純化的轉化子也同樣在完全強度的MY25中于搖瓶內依實施例5所述進行評估。將產(chǎn)量最高的兩株如實施例5所述于2升發(fā)酵罐中培養(yǎng)。同樣如實施例4所述測量脂酶活性。如實施例5所述測定平均脂酶基因拷貝數(shù)。
所得結果示于下面的表3，其中米曲霉HowB430的脂酶產(chǎn)生與平均脂酶基因拷貝數(shù)被標準化為1.0。最高的兩個脂酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生與米曲霉DEBY932基本上相同量的脂酶活性，但是其脂酶基因的拷貝數(shù)也已增加。
表3菌株 發(fā)酵結果 平均相對拷貝數(shù)HowB430 1.01.0138T83.l.l 2.21.81138T102.l.1 1.91.81實施例9米曲霉HowB432的構建通過用含有NA2-tpi啟動子、柔毛腐質霉(CAREZYMETM基因，NovoNordisk A/S，Bagsvaerd，丹麥)的纖維素酶基因和質粒pGAG3(圖14)的AMG終止子的線性片段轉化米曲霉JaL250，得到米曲霉HowB432。
通過刪去中性蛋白酶I基因(npI)從米曲霉JaL 142(Christensen等，1988，生物/技術(Bio/Technology)61419-1422)構建米曲霉JaL250。通過將編碼質粒pJaL389(圖15)中npI基因之中央部分的1.1kb的BalI片段與pJaL335(圖16)的3.5kb之HindHI片段交換，構建npI缺失的質粒，其中所述質粒pJaL389含有編碼npI基因的5.5kb之SacI基因組片段，所述3.5kb之HindHI片段含有側翼為重復序列的pyrG基因。由此，得到質粒pJaL399(圖17)。用7.9kb的SacI片段轉化米曲霉JaLI42。利用如實施例7所述Southern分析以及依照標準方法通過IEF蛋白酶曲線分析來分析轉化子。
35個轉化子中有兩個具有與親本菌株相比改變了的Southern圖譜，由IEF顯示無中性蛋白酶I活性。此外，Southern分析顯示，兩個轉化子之一具有npI基因的完整缺失，稱為米曲霉JaL228。
一共將2.3×107米曲霉JaL228的分生孢子鋪板于補加0.1％5-氟-乳清酸(FOA)和10mM尿苷的基本培養(yǎng)基平板上。獲得8個FOA抗性菌落。利用401bp pyrG重復區(qū)域探查的8個菌落之基因組DNA的Southern印跡證實，通過在重復區(qū)域的重組已將pyrG基因切除。米曲霉JaL228顯示出來自兩個重復區(qū)域之預期大小的2.7kb和3.1kb的兩條帶。如果pyrG基因已通過重復區(qū)域之間的重組而喪失，則3.1kb帶會消失，僅保留2.7kb帶。所有8個FOA抗性菌落顯示此種條帶模式。涵蓋了npI基因與保留在8個菌落中401bp重復拷貝之間的連接之PCR片段的測序證實，通過重復序列間的重組已切除了pyrG基因。其中的一個菌落稱為米曲霉JaL250。
通過從pDM176(圖18)從分離含有柔毛腐質霉纖維素酶基因的SwaI/PacI片段，并將片段連接入SwaI/PacI消化的pBANe6，構建pGAG3。將pDM176的SwaI/PacI片段及SwaI/PacI消化的pBANe6在1％瓊脂糖凝膠上分離，并在連接前用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)按照制造商指示進行分離。連接產(chǎn)物用于轉化大腸桿菌DH5α細胞，然后通過利用QIAwell-8質粒試劑盒依照制造商指示從轉化子中提取質粒DNA，限制性消化質粒DNA以證實正確大小的片段存在與否，以及以實施例1中所述的方法測定DNA序列，篩選轉化子。
然后用PmeI消化pGAG3，通過使用TAE緩沖液由制備型瓊脂糖電泳分離線性表達盒。然后使用線性表達盒轉化米曲霉JaL250。
如實施例1中所述用濃度為每毫升2×107個原生質體的原生質體進行用amdS選擇的米曲霉JaL250轉化。將上述10μg線性片段加入1Oμl原生質體。然后加入體積為250μl的PEG(60％PEG4000-10mM CaCl2-10mMTris-HCl pH 8.0)，將混合物置于37℃30分鐘。加入3毫升STC培養(yǎng)基，將混合物鋪板于補加了用于amdS選擇的10mM尿苷之COVE平板。在34℃培養(yǎng)平板7-10天。然后將轉化子轉移至相同培養(yǎng)基的平板，于37℃溫育3-5天。通過孢子劃線法及利用不含蔗糖的相同培養(yǎng)基之平板挑取分離的菌落，純化轉化子。實施例10用NdeI線性化的pDSY138轉化米曲霉以及纖維素酶表達篩選利用實施例3所述方法用NdeI消化的pDSY 138(WO 98/11203)轉化米曲霉HowB432?？偣不厥樟?40個轉化子，其如實施例4所述生長于1/4強度的MY25培養(yǎng)基之24孔微量滴定板上，除了是在第3天和第5天取樣，并如下分析纖維素酶活性。
根據(jù)下面的方法測定纖維素酶活性。通過在100mM MOPS(pH 7.0)的緩沖液中于80℃中溶解物質10分鐘，制備含有2％偶氮羧甲基纖維素的底物溶液。使用CAREZYMETM(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麥)作為標準。制備2.5-25ECU/毫升的貯藏原液，以通過在100mM MOPS(pH7.0)緩沖液中相應地稀釋CAREZYMETM構建標準曲線。將5μl等份的標準品與樣品(從搖瓶及發(fā)酵罐中稀釋)加入96孔板上的獨立的孔。將體積為65μl的2％偶氮羧甲基纖維素溶液移入每個孔并混合。反應在45℃溫育30分鐘，通過加入215μl終止劑隨后混合，終止反應。首先將0.2gZnCl2懸浮于20ml 250mM MOPS(pH 7.0)中，再將懸浮液加入80毫升酸化乙醇(每升乙醇含有1.1毫升濃鹽酸)，制備終止劑。將含有終止劑的平板于3000轉份離心10分鐘。每個懸浮液之100μl等份移入96孔板中，于600nm測定吸光度。利用線性回歸，測定標準品和樣品的斜率、截距及相關系數(shù)。
將20個纖維素酶產(chǎn)量最高的轉化子經(jīng)孢子純化，并在24孔微量滴定板中重新測試。將產(chǎn)量最高的8個產(chǎn)纖維素酶純化轉化子又一次經(jīng)孢子純化，如實施例5中所述，在完全強度的MY25中于搖瓶中測試。最高的2個產(chǎn)纖維素酶轉化子也利用如實施例5中所述的相同培養(yǎng)基和條件在2升發(fā)酵罐中生長。如上述測定纖維素酶活性。利用實施例5中所述的相同方法測定纖維素酶拷貝數(shù)，所用引物如下，并使用米曲霉HowB432基因組DNA為標準。通過纖維素酶復制子數(shù)量與oliC復制子數(shù)量的比例計算每一菌株的纖維素酶基因拷貝數(shù)。纖維素酶基因探針6FAM-CAGCCTGTCTTTTCCTGCAACGCC-TAMRA纖維素酶基因正向引物(CARE119F)CCAAGAAGGCTCCCGTGAA纖維素酶基因反向引物(CARE186R)GAAGTCCGTGATACGCTGGAA所得結果示于下面的表4，其中米曲霉HowB432的纖維素酶產(chǎn)量及平均纖維素酶基因拷貝數(shù)被標準化為1.0，結果表明，米曲霉C 138T205.1.1比米曲霉HowB432具有多出50％的纖維素酶基因拷貝，這與發(fā)酵中纖維素酶產(chǎn)量增加50％相一致。
表4菌株 發(fā)酵結果 平均相對拷貝數(shù)HowB432 1.0 1.0C138T205.l.l1.5 1.56C138T21.l.l 1.151.0實施例11葡萄糖轉運子基因過量表達質粒pHB218和pDSY153以及終止對照質粒pDSY152和pDSY155的構建構建過量表達米曲霉DEBY599.3 (WO 98/11203)的葡萄糖轉運子基因的質粒，以測定如果葡萄糖轉運子過量表達是否會導致柔毛腐質霉脂酶纖維素酶的產(chǎn)量增加。通過PCR擴增葡萄糖轉運子開放閱讀框，以分別將SwaI和PacI位點置于ORF的5’和3’末端。依照制造商指示利用Applied Biosystems Model 394 DNA/RNA合成儀合成的下列引物與0.2毫克pDSY112(WO98/11203)一起用于擴增9611765′-ATTTAAATGGTCCTCGGTGGATCAAGC-3′9611775′-TTAATTAATTAGTCCTGTCTGCGCTGGT-3′用于擴增的條件及參數(shù)述于實施例1。在瓊脂糖凝膠上電泳10毫升PCR反應產(chǎn)物，獲得預期的1.5kb片段。依照制造商指示利用pPCR-ScriptTM試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)克隆PCR產(chǎn)物。采用連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α細胞，用QIAWell-8質粒試劑盒從數(shù)個轉化子中分離質粒DNA。用NotI和EcoRI消化質粒以確定哪一個克隆含有1.5kb的插入片段。如瓊脂糖凝膠電泳所示，分析的11個克隆中6個具有正確大小的插入片段。其中一個克隆pDSY119被PacI和SwaI消化，將消化產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切下1.5kb的SwaI/PacI帶，使用QIAQuick凝膠提取試劑盒從凝膠切塊中純化DNA。用標準方法(Sambrook等，1989，出處同前)將此1.5kb片段與Swal/PacI切割的pBANe13(圖3)連接。連接產(chǎn)物用于轉化大腸桿菌DH5α細胞，從數(shù)個轉化子中分離質粒DNA。用Swal/PacI消化質粒以確定哪一個克隆含有預期的1.5kb的插入片段。所得質粒稱為pHB218(圖19)。
構建了一款其中選擇標記為bar基因的pHB218，用來轉化pyrG+菌株。通過限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳及利用QIAQuick凝膠提取試劑盒純化，從pHB218中分離SwaI/PacI插入片段。將插入片段連接入pSE39(圖20)并利用SwaI/PacI消化。連接產(chǎn)物用于轉化大腸桿菌DH5α細胞，如上述從數(shù)個菌落中分離質粒DNA。用SwaI/PaeI消化質粒以確定哪一個克隆含有預期的1.5kb的插入片段。如實施例1所述測定質粒的序列，以證實在氨基酸9 pDSY153(圖21)缺失了終止密碼子。實施例12用pHB218轉化米曲霉HowB430及脂酶篩選用pHB218轉化米曲霉HowB430，利用實施例3所述方法回收轉化子。回收了120個帶有pHB218的轉化子，如實施例5所述生長于搖瓶內的MY25培養(yǎng)基中，如實施例4所述于2-3天后鑒定脂酶活性。如實施例5所述測定脂酶基因拷貝數(shù)。
結果示于表5，其中米曲霉HowB430的脂酶產(chǎn)量與平均脂酶基因拷貝數(shù)標準化為1.0。由表5可知，在搖瓶中，具有增加的脂酶基因拷貝數(shù)之轉化子產(chǎn)生較多的脂酶，丟失了脂酶基因拷貝的米曲霉218T95產(chǎn)生較少的脂酶。
表5菌株 搖瓶結果平均相對拷貝數(shù)HowB4301.01.0218T56 1.85.33218T87 1.74.00218T18 1.82.87218T43 1.62.53218T95 0.90.47實施例13用pDSY153轉化米曲霉DEBY10.3及脂酶篩選用pDSY153轉化米曲霉DEBY10.3，利用實施例3所述方法回收轉化子?；厥樟?16個帶有pDSY153的轉化子，如實施例5所述生長于搖瓶內的MY25培養(yǎng)基中，如實施例4所述于2-3天后鑒定脂酶活性。如實施例5所述測定脂酶基因拷貝數(shù)。
結果示于表6，其中米曲霉DEBY10.3的脂酶產(chǎn)量與平均脂酶基因拷貝數(shù)標準化為1.0。結果顯示，在搖瓶中，具有增加的脂酶基因拷貝數(shù)之轉化子產(chǎn)生較多的脂酶，脂酶基因拷貝降低的轉化子產(chǎn)生的脂酶減少。
表6菌株 搖瓶結果 平均相對拷貝數(shù)DEBYIO.3 1.0 1.0153T208 1.43 2.87153T214 1.35 2.93153T171 1.25 1.19153T90 0.4 0.56153T11 0.2 0.44
利用下面的寡核苷酸從米曲霉基因組DNA擴增palB基因的基因組片段5′-CATATGCACAATACTCACACCAGTAGGCGACCAC-Y5′-CATATGCTGGTTGTGATCACAGCGACTGGGATGG-3′利用米曲霉How B430基因組DNA作為模板，依照制造商指示使用Clontech高級基因組PCR試劑盒(Clontech.Palo Alto.，CA)擴增產(chǎn)物。反應條件為94℃1分鐘；35次如下循環(huán)94℃30秒，68℃6分鐘；以及1個循環(huán)的68℃6分鐘。獲得預期的約4.7kb之產(chǎn)物，依照制造商指示使用TA克隆試劑盒在72℃下10分鐘用Taq DNA聚合酶將3’A加入產(chǎn)物。
利用Invitrogen Topo TA克隆試劑盒將產(chǎn)物亞克隆入pCR2.1，篩選大腸桿菌轉化子中的插入片段。來自三個亞克隆pLRF1的palB片段之核苷酸序列通過引物步移(primr walking)測定。所有三個亞克隆均具有3個堿基改變位置1910的T變?yōu)镃(擺動位置，故其為沉默的)，距終止密碼子約110bp的終止子中的A變?yōu)镚，以及可能改變氨基酸殘基的3885位置中A變?yōu)門。為了校正3885位置中的A變?yōu)門，使用下面的寡核苷酸利用Morph定點突變試劑盒(Five Prime-Three Prime，Inc.，Boulder，CO)依照制造商指示進行定點突變，從5’至3’5′-CCTGGCGACTTCGGAAGATGGAACTCACAG-3′用于定點突變的模板為pLRF2。pLRF2是這樣構建的用NdeI消化pLRF1，分離4.6kb palB片段，將其亞克隆入已被NdeI消化并經(jīng)蝦堿性磷酸酶磷酸酶化(phosphatased)的pMT1612(WO 98/11203)中。突變后，測定數(shù)個大腸桿菌克隆的核苷酸序列，鑒定其中3385位置的T已經(jīng)被改變?yōu)锳的克隆。此外，通過引物步移，測定了含有期望的T被改變?yōu)锳之pLRF2的定點突變克隆之一的核苷酸序列，以證實未引入其它改變。實施例15palB-表型的互補及用于脂酶產(chǎn)生的轉化子的篩選通過在米曲霉菌株DEBY10.3以及在分別如實施例5與7中所述的米曲霉HowB430 palB破壞轉化子之一中用野生型palB基因與palB-表型互補，證實了palB-表型與脂酶產(chǎn)生增加的關系。此互補將導致脂酶產(chǎn)生減少。
用如實施例3所述方法選擇BASTA抗性的pLRF2轉化米曲霉DEBY10.3或pal B破壞的米曲霉HowB430菌株之一米曲霉pal B76-1-1。也用BASTA抗性的pMT1612作為對照轉化菌株。米曲霉DEBY10.3中，分別用pLRF2和pMT1612獲得26和11個轉化子。在米曲霉HowB430 palB76-1-1中，分別用pLRF2和pMT1612獲得28和14個轉化子。
所有轉化子經(jīng)孢子純化并于pH6.5和pH8.0的基本培養(yǎng)基平板上測定palB表型。對于米曲霉DEBY10.3及米曲霉HowB430 palB76-1-1，結果分別示于下面的表7和表8。所有pLRF2米曲霉DEBY 10.3的轉化子為palB+，而所有pMT1612米曲霉DEBY 10.3轉化子為palB-。在米曲霉palB76-1-1群落中，28個pLRF2轉化子中有27個為palB+，而14個pMT1612轉化子中有13個為palB-。
通過如實施例4所述，將各個轉化子接種入含有1/100強度MY25培養(yǎng)基(pH6.5)的24孔微量滴定板中，測定轉化子產(chǎn)生脂酶的能力。每一轉化子各接種入3個孔中，將平板于34℃以150轉/分搖動下培養(yǎng)。于第3天和第5天取樣，并如實施例4所述分析。如實施例5所述測定平均脂酶基因拷貝。
對于米曲霉DEBY10.3及米曲霉palB76-1-1，結果分別示于下面的表7和表8。對于這些菌株將結果標準化為1.0。
表7菌株 palB表型相對LU/ml微滴定平均相對拷貝數(shù)DEBY10.3 - 1 1pLRF2-1 + 0.9 1.17pLRF2-2 + 0.8 1.19pLRF2-3 + 1.3 3.5pLRF2-4 + 0.5 0.61pLRF2-5 + 0.7 0.94pLRF2-6 + 1.1 1.61pLRF2-7 + 0.69 0.67pLRF2-8 + 0.85 0.89pLRF2-9 + 0.63 0.56pLRF2-10 + 1.1 1.44pLRF2-11 + 0.8 0.83pLRF2-12 + 0.6 0.56pLRF2-13 + 1.1 1.21pLRF2-14 + 0.5 0.39pLRF2-15 + 0.6 0.67pLRF2-16 + 0.5 0.39pLRF2-17 + 0.8 1pLRF2-18 + 0.8 0.89pLRF2-19 + 0.7 0.78pLRF2-20 + 0.7 1.06pLRF2-21 + 0.8 0.9pLRF2-22 + 1 1.17pLRF2-23 + 0.9 0.89pLRF2-24 + 0.8 0.89pLRF2-25 + 0.5 0.56pLRF2-26 + 0.6 0.67pMT1612-1 - 1.3 1.05pMT1612-2 - 1.3 1.05pMT1612-3 - 0.73 0.39pMT1612-4 - 1.11pMT1612-5-1.10.94pMT1612-7-1.21.5pMT1612-8-1.10.94pMT1612-9-1 0.94pMT1612-10-1.31.39pMT1612-11-1.31.44pMT1612-12-1.11.05表8菌株 palB表型 相對LU/ml平均相對拷貝數(shù)HowB430+1 1pLRF2-1+0.951pLRF2-2+1.42.13pLRF2-3+1.21.53pLRF2-4+1.4 2pLRF2-5+1.21.2pLRF2-6-1.71.47pLRF2-7+0.9 1pLRF2-8+1.21.47pLRF2-9+1.11.2pLRF2-10 +1 1.13pLRF2-11 +0.90.87pLRF2-12 +1.31.53pLRF2-13 +0.70.5pLRF2-14 +0.90.87pLRF2-16 +0.70.6pLRF2-17 +1.11.53pLRF2-18 +1.292pLRF2-19 +1.11.27pLRF2-20 +0.60.6pLRF2-21 +0.90.87pLRF2-22 +1.21.33pLRF2-24 +0.80.87pLRF2-25+1.21.67pLRF2-26+0.81.07pLRF2-27+0.70.87pLRF2-28+1.41.33pLRF2-29+1.32.27pLRF2-32+0.80.93pMT1612-1-1.40.93pMT1612-2-1.61.27pMT1612-3-1.30.93pMT1612-4+1.31.2pMT1612-5-1.62.2pMT1612-6-1.5 1pMT1612-8-1.61.27pMT1612-10 -1.61.2pMT1612-11 -1.81.13pMT1612-12 -1.20.73pMT1612-13 -1.41.1376-1-1 -1.4 1有數(shù)個菌株喪失或獲得了脂酶基因的拷貝。在所有4個群落中拷貝數(shù)改變的頻率相當高，從45％-66％?？截悢?shù)的喪失或獲得分別與脂酶表達的降低或升高符合得很好。
在此表述及要求保護的本發(fā)明不局限于有此處公開的具體實施方案，因為這些實施方案意在闡明本發(fā)明的幾個方面。任何等同的實施方案均落入本發(fā)明的范圍。事實上，除了此處所示及描述的之外，對于本領域普通技術人員而言由前述說明可知對本發(fā)明的修改是顯而易見的。這類修改也認為落入所附權利要求書的范圍。
所有此處提及的用于描述和公開所引公開文本之特定信息的公開文本在此引用作為參考。上面討論的公開文本僅僅為了其在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_。不應認為此間所述內容是發(fā)明人承認無資格享有因在先發(fā)明而具有比這種公開在先的申請日。
應當理解，本發(fā)明不限于此處所述的特定方法及組合物或其變體。也應當理解此處所用的術語僅僅意在描述特定的實施方案，而不意在限制，因為本發(fā)明的范圍僅應由所附的權利要求書限定。
除非另有定義，所有此處所用的技術和科學術語具有本發(fā)明所述技術領域中普通技術人員通常知曉的相同含義。盡管在實施或測試本發(fā)明中可使用任何與此處公開的那些類似或等同的材料或方法，描述了優(yōu)選地方法和材料。
權利要求
1.一種用于制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的拷貝之外的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
2.權利要求1的方法，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽。
3.權利要求1的方法，其中于基因座中導入核酸構建體降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽。
4.一種用于制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列的一個拷貝之中的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中于基因座中導入核酸構建體改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
5.權利要求4的方法，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽。
6.權利要求4的方法，其中于基因座中導入核酸構建體降低了核酸序列的拷貝數(shù)，且當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更少的多肽。
7.一種用于制備多肽的方法，包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞，其中(i)通過將一個核酸構建體在核酸序列之外的基因座處導入親本細胞的基因組產(chǎn)生突變細胞，使突變細胞與親本細胞相關聯(lián)，該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，所述核酸序列在該核酸序列之5’和3’端含有重復序列，其中于基因座中導入核酸構建體增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果；(ii)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。
8.權利要求1-7中任一項的方法，其中核酸構建體與核酸序列具有小于40％的同源性。
9.權利要求1-8中任一項的方法，其中基因座與核酸序列位于不同的染色體或者與核酸序列位于相同的染色體。
10.權利要求1-9中任一項的方法，其中核酸構建體包含于載體中。
11.權利要求1-9中任一項的方法，其中核酸構建體是一種環(huán)狀分子。
12.權利要求1-9中任一項的方法，其中核酸構建體是一種線性片段。
13.權利要求1-12中任一項的方法，其中核酸構建體包含選擇標記。
14.權利要求13的方法，其中所述選擇標記是dal，amp，kan，cam，tet，dfhr)，hygB，ADE2，HIS3，LEU2，LYS2，MET3，TRP1，URA3，amdS，argB，bar，hygB，niaD，pyrG，sC或trpC。
15.權利要求1-14中任一項的方法，其中親本細胞是原核細胞或真核細胞。
16.權利要求15的方法，其中原核細胞是細菌細胞。
17.權利要求16的方法，其中細菌細胞選自芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和假單胞菌屬細胞。
18.權利要求15的方法，其中真核細胞是哺乳動物細胞。
19.權利要求15的方法，其中真核細胞是真菌細胞。
20.權利要求19的方法，其中真核細胞是絲狀真菌細胞。
21.權利要求20的方法，其中絲狀真菌細胞選自支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、柱霉屬、梭孢殼屬、Tolypocladium或木霉屬細胞。
22.權利要求19的方法，其中真菌細胞是酵母細胞。
23.權利要求22的方法，其中酵母細胞選自假絲酵母屬、漢遜酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、酵母屬、裂殖酵母屬或Yarrowia屬。
24.權利要求1-23中任一項的方法，其中多肽是重組多肽。
25.權利要求1-24中任一項的方法，其中多肽是異源多肽。
26.權利要求1-25中任一項的方法，其中多肽是抗體或其部分、抗原、凝集因子、酶、激素或其變體、受體或其部分、調節(jié)蛋白、結構蛋白、報道分子或轉運蛋白質。
27.權利要求26的方法，其中酶是氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂合酶、異構酶或連接酶。
28.權利要求27的方法，其中酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齒斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果膠裂解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶或木聚糖酶。
29.權利要求1-28中任一項的方法，其中核酸構建體是pDSY82、pDSY112、pMT1612、pMT1936、pLRF2、pDSY153或pHB218。
30.一種用于制備多肽的方法，包括(a)通過將一個核酸構建體在核酸序列的拷貝之外或在核酸序列拷貝之一的序列之內的基因座處，導入親本細胞的基因組，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不受選擇壓力；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，分離比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽的突變細胞；(c)鑒定其中已整合有核酸構建體的基因座；(d)產(chǎn)生其中相應基因座已經(jīng)被破壞的細胞；(e)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)該細胞；(f)從培養(yǎng)液中回收多肽。
31.一種用于制備多肽的方法，包括(a)通過將一個核酸構建體在核酸序列之外的基因座處，導入親本細胞的基因組，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，所述核酸序列在該核酸序列之5’和3’端含有重復序列，其中將核酸構建體整合入基因座中增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不受選擇壓力；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，分離比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽的突變細胞；(c)鑒定其中已整合有核酸構建體的基因座；(d)產(chǎn)生其中相應基因座已經(jīng)被破壞的細胞；(e)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)該細胞；(f)從培養(yǎng)液中回收多肽。
32.一種用于獲得突變細胞的方法，包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列拷貝之外的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不受選擇壓力；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)鑒定當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽的突變細胞。
33.一種由權利要求32的方法產(chǎn)生的突變細胞。
34.一種用于獲得突變細胞的方法，包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體于核酸序列的一個拷貝之中的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝，其中將核酸構建體整合入基因座中改變了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的改變不受選擇壓力；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽；(b)鑒定當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽的突變細胞。
35.一種由權利要求34的方法產(chǎn)生的突變細胞。
36.一種用于獲得突變細胞的方法，包括(a)將一個核酸構建體在其中核酸構建體在核酸序列之外的基因座處整合入親本細胞的基因組之條件下導入親本細胞，形成突變細胞，其中該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列，所述核酸序列在該核酸序列之5’和3’端含有重復序列，其中將核酸構建體整合入基因座中增加了核酸序列的拷貝數(shù)，且拷貝數(shù)的增加不受選擇壓力；當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽；(b)鑒定當在同一有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時，比親本細胞產(chǎn)生更多的多肽的突變細胞。
37.一種由權利要求36的方法產(chǎn)生的突變細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備多肽的方法,包括(a)在有助于多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)突變細胞,其中(ⅰ)通過將一個核酸構建體在核酸序列之內的基因座或在核酸序列之外的基因座處導入親本細胞的基因組,使突變細胞與親本細胞相關聯(lián),該親本細胞含有編碼多肽的核酸序列之至少兩個串聯(lián)的拷貝,或一個編碼多肽的核酸序列,該核酸序列在核酸序列之5’和3’端含有重復序列,其中于基因座中導入核酸構建體改變了核酸序列的拷貝數(shù),且拷貝數(shù)的改變不是選擇壓力的結果;(ⅱ)當在同一條件下培養(yǎng)親本細胞和突變細胞時,突變細胞比親本細胞產(chǎn)生更多或更少的多肽;(b)從培養(yǎng)液中回收多肽。本發(fā)明還涉及獲得突變細胞的方法以及突變細胞。
文檔編號C12N15/09GK1307642SQ99808098
公開日2001年8月8日 申請日期1999年5月27日 優(yōu)先權日1998年5月27日
發(fā)明者D·S·耶弗 申請人:諾沃諾爾迪斯克生物技術有限公司