專利名稱：無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供一種無指盤臭蛙(Rana grahami)丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應用，屬生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor，serpin)的最基本的功能是防止蛋白質水解，調節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。通過對絲氨酸蛋白酶的調節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑對生物體內的許多重要的生理生化功能都有重要的影響。以下14類生理生化功能都受絲氨酸蛋白酶抑制劑的調節(jié)血液凝固、補體形成、纖溶、蛋白質折疊、細胞遷移、細胞分化、細胞基質重建、激素形成及轉運、細胞內蛋白質水解、血壓調節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成。由于如此眾多的生理功能受其的調節(jié)，絲氨酸蛋白酶抑制劑已成為國際研究的熱點。而其研究與開發(fā)則蘊含著巨大的臨床治療藥物制備價值。
腫瘤是危害人類健康的一類主要疾病，而且治療藥物匱乏。據報道，惡性腫瘤僅在我國每年就新增加160萬病例，而且患病年齡逐漸年輕化。目前在化療中所使用的藥物，如阿霉素、環(huán)磷酰胺、腫瘤壞死因子等均具有較大的人體毒性，副作用非常的大，因而腫瘤治療藥物的開發(fā)是藥物研制的熱點。腫瘤擴張和轉移是目前臨床治療腫瘤效率低下的重要原因之一。絲氨酸蛋白酶抑制劑maspin在體內和體外對腫瘤都有明顯的抑制作用，其作用機理在于抑制腫瘤細胞浸潤和血管形成。
據國內外文獻報道，絲氨酸蛋白酶抑制劑如aprotinin除已在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術中用于抗纖溶，抑制接觸性激活、抗炎癥等。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein，tryptase在風濕性關節(jié)炎以及許多炎癥中(如鼻炎、結膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統(tǒng)炎癥)發(fā)生中起著重要的作用。臨床試驗證明其抑制劑是有效的治療藥物。另一方面，目前臨床上還沒有有效地治療皰疹病毒感染的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)抑制皰疹病毒絲氨酸蛋白酶是有效的治療手段。上述這些新的絲氨酸蛋白酶抑制劑藥物已處于II，III期臨床階段和已經商品化。
在中國的傳統(tǒng)中藥和民族醫(yī)藥中，許多兩棲類動物被作為藥材而被廣泛的應用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylaranaguentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動物的皮膚和內臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效，已報道藥理活性有廣譜抗菌作用、抗腫瘤、局部麻醉、鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、對心血管系統(tǒng)的作用等，另一方面，傳統(tǒng)中藥藥物成分的復雜性及其炮制方法的局限性也是造成藥物活性成分不能更好發(fā)揮作用的重要原因，因而從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內容之一。在國外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已經成為新藥發(fā)明的熱點。國外學者已從東方鈴蟾中分離出一低分子量具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的多肽BSTI，而國內學者從大蹼鈴蟾中分離到了具有絲氨酸蛋白酶抑制作用的多肽BMTI。從蟾蜍和林蛙皮膚中得到了具有舒張血管和降壓作用的bufokinin和ranakinin。從北美豹蛙和阿伯蛙中分離到了具有免疫調節(jié)和抗腫瘤作用的亮精肽和酪精肽。近十幾年對170多種兩棲類皮膚活性肽和類似物進行了篩選，證明有40多種活性肽有較好的藥物開發(fā)前景。
我國對兩棲類藥物的應用有悠久的歷史，但對其活性成分和藥理性質的研究主要集中于生物堿等有機小分子，對其皮膚活性蛋白肽類物質的研究還較少。無指盤臭蛙主要分布于我國的云南，四川和廣西等省，是我國的特色資源動物之一。而目前關于無指盤臭蛙皮膚活性物質的研究還鮮有報道。
發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體全序列氨基酸結構經蛋白質數(shù)據庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽編碼基因經基因數(shù)據庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術基礎，提供一組具有強烈的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性，同時具有較強的腫瘤細胞生長抑制活性和免疫調節(jié)活性的無指盤臭蛙指盤臭蛙丙精肽、其基因和各種變異體在制藥中的應用。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術方案無指盤臭蛙丙精肽無指盤臭蛙丙精肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
無指盤臭蛙丙精肽基因的克隆包括無指盤臭蛙皮膚總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉錄及cDNA文庫構建，設計引物，利用PCR方法篩選無指盤臭蛙蛋白酶抑制劑基因。擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。所獲陽性單克隆進行基因核苷酸序列測定。基因測序結果表明編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因由304個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120
gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙丙精肽的變異體，其變異體如下丙精肽2，第1位和第2位的丙氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg丙精肽3，第1位的丙氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽4，第1、2的丙氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽5，第1、2的丙氨酸、第19位的賴氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly。
無指盤臭蛙丙精肽及其變異體的制備方法根據編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因推斷無指盤臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙丙精肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。然后用HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
本發(fā)明的無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體作為制備治療腫瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應用。
本發(fā)明的有益效果在于由無指盤臭蛙丙精肽編碼基因推導其氨基酸結構，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙丙精肽的突變體，合成的無指盤臭蛙丙精肽及其突變體具有顯著的免疫調節(jié)和抑制腫瘤生長的作用。該無指盤臭蛙丙精肽及其突變體具有結構簡單、人工合成方便、抑制腫瘤效果明顯的有益特點。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但本發(fā)明的內容并不局限于此。
無指盤臭蛙丙精肽基因克隆I、無指盤臭蛙皮膚總RNA提取
A.活體無指盤臭蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4小時，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10ml總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產品)，于20ml玻璃勻漿器中勻漿30分鐘。
B.加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
C.上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為無指盤臭蛙皮膚總RNA。
II、無指盤臭蛙皮膚mRNA的純化無指盤臭蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的PolyATtractmRNAIsolation Systems試劑盒。
A.取無指盤臭蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗滌將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3ml，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。
C.將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.1ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15ml DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的無指盤臭蛙皮膚mRNA。
D.加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。
III、無指盤臭蛙皮膚cDNA文庫構建采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNALibrary Construction Kit質粒cDNA文庫構建試劑盒。
A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄)1.在0.5ml無菌的離心管加入1μl無指盤臭蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達到5μl。
2.混勻離心管中的試劑并短暫離心，72℃保溫2分鐘。
3.將離心管在冰上孵育2分鐘。
4.在離心管中加入以下試劑2.0μ15×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉錄酶。
5.混合離心管中試劑并短暫離心，在42℃保溫1小時。
6.將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。
7.從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。
B.采用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈
1.95℃預熱PCR儀。
2.將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應。
3.在PCR儀中按以下程序擴增①95℃20秒鐘②22個循環(huán)95℃5秒鐘68℃6分鐘4.循環(huán)結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。
C.PCR產物用PROMEGA公司的WizardSV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行抽提回收，步驟如下1.將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結合。16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
2.加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，16,000g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。
3.重復步驟2。
4.16,000g離心5分鐘。
5.將離心純化柱置于新的離心管中。
6.加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘。
7.16,000g離心1分鐘，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。
D.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞的制備1.挑取單個DH5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接種于50ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩2小時。當OD600值達到0.35時，收獲細菌培養(yǎng)物。
2.將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。
3.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.每50ml初始培養(yǎng)液且30ml預冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min離心10min，以回收細胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。
8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份細胞沉淀，分裝后備用。
E.酶切、連接以及連接產物的轉化1.在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl無指盤臭蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。
2.加入5μl(等量)的連接酶緩沖混合物。
3.16℃反應2小時。
4.全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。
5.42℃加熱90秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
6.加入37℃溫浴過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16小時，形成單菌落。
8.每個LB平皿用5ml LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構建的cDNA大約含1×106個單獨克隆。
IV、無指盤臭蛙丙精肽基因克隆篩選擴增引物長度為23個核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT 3’，PCR另一擴增引物為CLONTECH公司SMARTTMcDNA Library Construction Kit中的3’PCRPrimer引物，其序列為5′ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3′。
PCR反應在如下條件下進行94℃ 30秒鐘，60℃ 30秒鐘和72℃ 45秒鐘，35個循環(huán)。
首先滴定構建的細菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當?shù)募毦鷿舛?大約5000個細菌/毫升，和30個細菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μl)，37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細菌培養(yǎng)液，有16個樣品進行PCR鑒定，交叉陽性孔細菌樣品進入第二輪篩選。
V、無指盤臭蛙丙精肽基因序列測定和結果提取質粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國AppliedBiosystems373A全自動核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTMSequencing PrimerRV-M和BcaBESTTMSequencing Primer M13-47，BcaBESTTMSequencing Primer RV-M序列5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’，BcaBESTTMSequencing Primer M13-475’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’?；驕y序結果自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304
無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸的序列表為序列長度為304個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源無指盤臭蛙皮膚。
編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽氨基酸序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20無指盤臭蛙丙精肽基因作為基因工程制備無指盤臭蛙丙精肽的應用。
無指盤臭蛙丙精肽變異體作為蛋白質工程制備指盤臭蛙丙精肽變異體的應用。
制備無指盤臭蛙丙精肽及其變異體I、無指盤臭蛙丙精肽的制備方法根據編碼無指盤臭蛙丙精肽的基因推斷無指盤臭蛙丙精肽的氨基酸序列，利用蛋白組學方法設計無指盤臭蛙丙精肽的突變體，用自動多肽合成儀合成其全序列。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。
II、分子量測定采用快原子轟擊質譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry，F(xiàn)AB-MS)，以甘油∶間硝基芐醇∶二甲亞砜(1∶1∶1，V∶V∶V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。
III、純化的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用快原子轟擊質譜法，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
無指盤臭蛙丙精肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
無指盤臭蛙丙精肽變異體是通過蛋白組學的方法設計的一組具有改良的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的環(huán)狀多肽.無酶活性，它們的全序列如下丙精肽2，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys-Arg丙精肽3，Ala-Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽4，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly-Lys丙精肽5，Leu-Lys-Gly-Cys-Trp-Thr-Lys-Ser-Ile-Pro-Pro-Lys-Pro-Cys-Phe-Gly
無指盤臭蛙抗菌肽的藥理實驗1.無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制絲氨酸蛋白酶的作用不同量的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體溶解于0.05M Tris-HCl緩沖液與一定量的胰蛋白酶(最終濃度為40μg/ml)于0.05M Tris-HCl緩沖液于室溫下保溫2min，最后加入發(fā)色底物S-2238(終濃度為40μg/ml)啟動反應，應用PERKIN ELMER(美國)公司生產的分光光度計于處監(jiān)測吸收值變化2min，加入同樣體積的0.05M Tris-HCl緩沖液與空白對照，抑制常數(shù)Ki＝[I]/(V0/VI+1)計算。[I]為無指盤臭蛙丙精肽及其變異體的摩爾濃度，V0為空白對照是胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應速度，V1為加入無指盤臭蛙丙精肽及其變異體后胰蛋白酶與發(fā)色底物的反應速度。此試驗重復六次，取平均值。
無指盤丙精肽及其變異體均能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，在上述試驗條件下抑制半數(shù)胰蛋白酶活性所需要的無指盤臭蛙丙精肽及其變異體濃度及其抑制常數(shù)Ki見表1。
表1 無指盤臭蛙丙精肽及其變異體對絲氨酸蛋白酶的抑制作用

2.無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制腫瘤生長的作用在96孔細胞培養(yǎng)板上，將待測樣品用完全培養(yǎng)基進行5倍或2倍倍比稀釋，共六個稀釋度，每個稀釋度設3個重復孔，每孔100μl，同時設置正常細胞對照。每孔滴加3×105個/ml的HepG2、C8166和Molt-4細胞100μl。置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。48小時后用MTT法測定待測化合物對細胞的毒性作用。EC50是對50％宿主細胞產生細胞毒性作用時的濃度。
表1 無指盤臭蛙丙精肽及其變異體抑制腫瘤細胞生長的作用

由表1可見，無指盤臭蛙丙精肽及其變異體能顯著抑制肝腫瘤細胞系(HepG2)和兩種淋巴細胞系(C8166和Molt-4)的生長，這表明無指盤臭蛙丙精肽及其變異體具有很強的抑制腫瘤細胞生長和調節(jié)免役的作用，并表現(xiàn)出改良的性能，同時還具有序列簡單、合成方便等優(yōu)點。可作為制備治療腫瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應用。
無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應用.seqSEQUENCE LISTING<110>中國科學院昆明動物研究所<120>無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應用<130>1<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>304<212>DNA<213>Rana grahami<400>1atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304<210>2<211>20<212>PRT<213>Rana grahami<400>2Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys1 5 10 15Phe Gly Lys Arg20
權利要求
1.無指盤臭蛙丙精肽，其特征在于該無指盤臭蛙丙精肽是中國兩棲類動物無指盤臭蛙基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性。無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為Ala1-Ala2-Leu3-Lys4-Gly5-Cys6-Trp7-Thr8-Lys9-Ser10-Ile11-Pro12-Pro13-Lys14-Pro15-Cys16-Phe17-Gly18-Lys19-Arg20，其第6位的半胱氨酸和第16位的半胱氨酸形成分子內二硫鍵。
2.無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸序列，其特征在于cDNA由304個核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為atgttcacct tgaagaaatc cctgttactc cttttctttc ttgggatcat ctccttatct 60ttccgtgagc aagagagaga tgccgatgaa gatgatggag gggaagttac aggggaagaa120gtaaaaagag ctgcactcaa agggtgctgg accaagagta taccaccaaa gccttgtttt180ggaaaaagat aaaacttgaa atggaaatca tctgatgtgg aatatcattt agctaaatgc240taaatgtctg ataaaaaata aaatatattg cacgtacaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa300aaaa 304。
3.權利要求2所述的無指盤臭蛙丙精肽基因核苷酸序列，其特征在于，編碼成熟無指盤臭蛙丙精肽序列的為第130-189位核苷酸，其氨基酸序列為Ala Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg1 5 10 15 20。
4.無指盤臭蛙丙精肽的變異體，其特征在于其變異體如下丙精肽2，第1位和第2位的丙氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys Arg丙精肽3，第1位的丙氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Ala Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽4，第1、2的丙氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly Lys丙精肽5，第1、2的丙氨酸、第19位的賴氨酸和第20位的精氨酸同時缺失Leu Lys Gly Cys Trp Thr Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe Gly。
5.無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體的應用，其特征在于無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體作為制備治療腫瘤、胃炎、胰腺炎藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及無指盤臭蛙丙精肽、基因和變異體及其在制藥中的應用，屬生物醫(yī)學技術領域。無指盤臭蛙丙精肽是一種環(huán)狀多肽，分子量2188.68道爾頓，等電點10.07，具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性.無酶活性，無指盤臭蛙丙精肽全序列為NH
文檔編號A61K38/57GK1850857SQ20061001093
公開日2006年10月25日 申請日期2006年5月30日 優(yōu)先權日2006年5月30日
發(fā)明者賴仞, 李建許, 李東升, 徐學清, 韓耀平 申請人:中國科學院昆明動物研究所