專利名稱：：小型豬細(xì)胞色素p450的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及小型豬細(xì)胞色素P450的基因。技術(shù)背景細(xì)胞色素P450(cytochromeP450,CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的含鐵血紅素同工酶，參與許多外源化合物的轉(zhuǎn)化過程，對(duì)生物體內(nèi)的新陳代謝起著非常重要的作用。CYP是重要的藥物代謝I相酶，現(xiàn)有超過9(T/。的藥物都需要CYP的參與才能進(jìn)行代謝。CYP主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族，其中CYP3A亞家族是CYP家族的主要成員，約占肝內(nèi)CYP含量的30%,腸壁CYP含量的70%,是人類肝臟含量最高和代謝藥物最廣泛的P450酶。CYP在每一物種中均有多種亞型，且不同物種相應(yīng)CYP的代謝特性具有不同差異。在藥物研究中，為了能將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推廣到人，針對(duì)不同性質(zhì)的藥物，需要根據(jù)動(dòng)物相應(yīng)CYP的藥物代謝特性選擇不同的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但豬相應(yīng)CYP3A的藥物代謝特性尚缺乏研究。近年來，隨著動(dòng)物保護(hù)運(yùn)動(dòng)的興起和"3R，，原則的逐漸推廣，非人靈長(zhǎng)類及犬等高等動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)用途受到限制，豬由于其食性、解剖生理特點(diǎn)及藥物代謝特點(diǎn)等與人的相似性，以其進(jìn)行藥物研究的應(yīng)用逐漸增多。小型豬具有遺傳特性穩(wěn)定、體型小，詞養(yǎng)成本低，易于標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)操作方便等優(yōu)點(diǎn)，是目前醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)用豬，其作為新藥安全性、有效性評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有良好的應(yīng)用前景。因此，豬相應(yīng)CYP3A的藥物代謝特性具有重要的研究?jī)r(jià)值。獲得異源表達(dá)的CYP是研究CYP藥物代謝特性及體外藥物篩選的基礎(chǔ)，目前人、大鼠、小鼠、犬、牛等多種動(dòng)物的CYP基因已經(jīng)被克隆，各種CYP也已經(jīng)在大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等宿主中表達(dá)，但迄今為止，關(guān)于豬相應(yīng)CYP3A的基因克隆及異源表達(dá)方面的報(bào)道極少。此外，在獸醫(yī)臨床上，獸藥使用非常廣泛，這些藥物往往具有一定的毒性和蓄積性，帶來潛在的食品安全問題，明確其在動(dòng)物體內(nèi)的消除特性將極大地提高對(duì)其最大殘留量及休藥期限制的準(zhǔn)確性。而大多數(shù)獸藥在動(dòng)物體內(nèi)的消除依賴于CYP，CYP的活性及其同工酶組成在很大程度上決定這些藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留水平及在不同組織中的殘留狀況。由于CYP活性受到誘導(dǎo)、抑制等影響而導(dǎo)致藥物之間相互作用引起的副作用在獸藥中也同樣存在。在新獸藥的開發(fā)研究階段，通過定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)等預(yù)測(cè)化合物和豬CYP的相互作用并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，了解何種CYP參與藥物代謝及藥物對(duì)CYP的影響，可預(yù)測(cè)其和其它藥物間的相互作用。因此，克隆豬與人CYP3A亞家族相對(duì)應(yīng)的基因，并進(jìn)行異源表達(dá)，再進(jìn)一步研究CYP3A亞家族在豬體內(nèi)的藥物代謝特性，對(duì)于藥物代謝研究、體外藥物篩選、獸藥殘留研究、獸藥之間的相互作用研究以及新獸藥研發(fā)等具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種小型豬細(xì)胞色素P450,具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的目的之二在于提供編碼所述小型豬細(xì)胞色素P450的基因。進(jìn)一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列；進(jìn)一步，所述基因具有SEQIDNo.1中第1-1965位核苦酸序列。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次克隆出一種小型豬細(xì)胞色素P450(在本發(fā)明中命名為CYP3A88)的cDNA全長(zhǎng)序列，識(shí)別出其開放閱讀框，并推導(dǎo)出其編碼蛋白質(zhì)(即CYP3A88)的氨基酸序列。CYP3A88為CYP3A亞家族的新成員，該酶可通過參與外源藥物的I相代謝中的氧化反應(yīng)，決定藥物在小型豬體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)特性、毒副作用及藥物相互作用特性。本發(fā)明獲得的CYP3A88的基因，可以用于CYP3A88mRNA的表達(dá)水平研究，以評(píng)估小型豬是否適宜于作為人CYP3A介導(dǎo)的藥理學(xué)研究動(dòng)物模型，同時(shí)，通過測(cè)定CYP3A88mRNA的表達(dá)水平，還可以進(jìn)行藥物對(duì)小型豬CYP3A88基因表達(dá)的誘導(dǎo)或抑制作用研究；采用本發(fā)明獲得的CYP3A88的基因，利用基因重組技術(shù)可異源表達(dá)CYP3A88，并制得CYP3A88的特異性抗體，用于藥物在小型豬體內(nèi)的代謝特性、毒理作用和藥物相互作用研究，可為新藥的有效性和安全性評(píng)價(jià)提供充分的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；因此，本發(fā)明具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。圖1為小型豬CYP3A88cDNA片段RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖2為小型豬CYP3A88cDNA5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂4唐凝膠電泳鑒定圖；圖3為小型豬CYP3A88cDNA3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖4為小型豬CYP3A88基因開放閱讀框PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；圖5為人、小型豬、犬、大鼠、小鼠CYP3A家族基因的鄰接法(NJ)系統(tǒng)聚類樹。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。優(yōu)選實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。一、小型豬CYP3A88基因的克隆1.小型豬CYP3A88cDNA部分序列的預(yù)測(cè)從CYP網(wǎng)站(http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html)下載主要哺乳動(dòng)物(包括人、大鼠、小鼠、犬、牛)CYP3A亞家族的所有氨基酸序列，轉(zhuǎn)換成FASTA格式，構(gòu)建CYP3A種子序列庫；從GenBank數(shù)據(jù)庫下載豬的所有表達(dá)序列標(biāo)簽(expressedsequencetags,EST),構(gòu)建豬UniGene序列庫；采用BLAST程序(版本2.2.15),以CYP3A種子序列庫中的所有氨基酸序列對(duì)豬UniGene序列庫進(jìn)行TBLASTN同源性檢索，獲得2條相似性最高的豬CYP3A同源EST(GenBank登錄號(hào)分別為AJ958861和CB479861);將所得豬CYP3A同源EST用DNASTAR軟件(版本7.1.0)進(jìn)行電子拼接，得到1條922bp的重疊克隆群(contig)序列，即預(yù)測(cè)的小型豬CYP3A88cDNA部分序列；2.總RNA的提取將巴馬香豬(4-6月齡，體重約10kg,由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室提供)經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，活體取出肝臟中葉左側(cè)部分組織，用生理鹽水沖洗后切成小塊，迅速置液氮中凍存，備用；取50-100mg液氮凍存肝臟組織，采用TripureRNA提取試劑盒(ROCHE/>司)^是取總RNA,按照試劑盒說明書操作；提取的總RNA用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性，并用核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定濃度,取28SrRNA條帶強(qiáng)烈且Aw，位于1.8-2.0之間的RNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；3.小型豬CYP3A88cDNA片段的克隆3.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)步驟1預(yù)測(cè)的小型豬CYP3A88cDM部分序列，設(shè)計(jì)并合成l對(duì)引物Pl如SEQIDNo.3所示、P2如SEQIDNo.4所示；3.2小型豬CYP3A88cDNA片段的RT-PCR擴(kuò)增采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)和PCR試劑盒(TaKaRa公司)兩步法進(jìn)行小型豬CYP3A88cDNA片段的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以步驟2提取的總RNA為模板，以01igo(盯)15為逆轉(zhuǎn)錄引物，反應(yīng)過程為按質(zhì)量比2:1加入總RNA和逆轉(zhuǎn)錄引物，使反應(yīng)總體積為15(al，混勻，溫度70。C水浴5分鐘，立即冰浴5分鐘，瞬時(shí)離心，再加入5xAMV緩沖液5pl、濃度為1Ommol/L的dNTPs2.5pl、濃度為40U/pl的RNasin1^1、濃度為10U/(al的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶l.5總體積為25混勻，瞬時(shí)離心，溫度42°C反應(yīng)60分鐘，95°C變性10分鐘終止反應(yīng)；PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄制備的cDNA為才莫板，以步驟3.1合成的引物Pl、P2為上下游引物，反應(yīng)體系為10xPCR反應(yīng)緩沖液2.5jil、濃度為10mmol/L的dNTPs2.5pl、濃度為10^mol/L的上、下游引物各2[xl、沖莫4反2|11、濃度為5U/pl的DNA聚合酶0.5|il、濃度為50mmol/L的MgCl2溶液2pl、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為25pi;反應(yīng)條件為溫度96。C預(yù)變性5分鐘，然后95°C變性30秒、58。C退火30秒、72。C延伸1分鐘，共12個(gè)循環(huán)，每循環(huán)1次退火溫度降低O.5°C;再95。C變性30秒，52'C退火30秒，72。C延伸1分鐘，共33個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸5分鐘；PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖1所示，其中1泳道為DL200GPCR分子量標(biāo)準(zhǔn)(Takara/>司)，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約600bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與小型豬CYP3A88目的cDM片段(608bp)大小相符；鑒定正確的PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒(Promega公司)進(jìn)行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約600bp的目的片段進(jìn)行切膠回收，獲得純化的小型豬CYP3A88c腿片段；3.3小型豬CYP3A88cDNA片^殳的克隆及序列測(cè)定將步驟3,2所得純化的小型豬CYP3A88cDNA片段與pMD18-T載體(TaKaRa公司)進(jìn)行TA連接，連接方法為濃度為50ng/Vl的DNA片段4jal、濃度為50rig/pi的載體1^1、連接緩沖液5ji1，置溫度為16。C孵育8小時(shí)，構(gòu)建重組克隆載體pMD18-T/CYP3A88;將所得重組克隆載體轉(zhuǎn)化入CaCl2法制備的DH5cc大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法為將上述重組克隆載體IOnl加入到感受態(tài)細(xì)胞100pi中，水浴30分鐘，42。C水浴熱^木克90秒，立即冰浴2分鐘，再加入液體LB培養(yǎng)基，于溫度為37。C，150r/min振搖l小時(shí)，制得轉(zhuǎn)化細(xì)胞；將所得轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，于溫度37。C倒置過夜，從平板上隨機(jī)挑取數(shù)個(gè)白斑，接種于液體LB培養(yǎng)基中，于溫度37。C、150r/min振搖過夜，采用質(zhì)粒提取試劑盒(Promega公司)小量提取質(zhì)粒，按照步驟3.2所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定陽性克隆質(zhì)粒；取所得陽性克隆質(zhì)粒，委托上海基康生物技術(shù)有限公司測(cè)定插入片段的序列，獲得608bp的DM序列，與小型豬CYP3A88cDNA部分序列的預(yù)測(cè)值一致；4.小型豬CYP3A88cDNA全長(zhǎng)的克隆采用cDNA末端快速擴(kuò)增4支術(shù)(rapidamplificationofcDNAends,RACE),以SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech公司)對(duì)小型豬CYP3A88cDNA片段的5'和3'末端進(jìn)行快速擴(kuò)增，以獲得小型豬CYP3A88cDNA全長(zhǎng)。4.1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)步驟3.3測(cè)得的小型豬CYP3A88cDNA部分序列，分別i殳計(jì)5'和3'末端基因特異性引物(genespecificprimer，GSP)和嵌套基因特異性引物(nestedgenespecificprimer,NGSP):5'GSP如SEQIDNo.5所示，5'NGSP如SEQIDNo.6所示，3'GSP如SEQIDNo.7所示，3'NGSP如SEQIDNo.8所示；4.2小型豬CYP3A88cDNA片段的RACE擴(kuò)增4.2.1cDNA第一鏈的制備以步驟2提取的總RNA為模板，按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄制備5'和3'cDNA第一鏈；4.2.25'RACE擴(kuò)增第一輪RACEPCR:以步驟4.2.1制得的5'cDNA第一鏈為模板，以通用引物(universalprimer,UPM)和步驟4.1合成的5'GSP為上下游引物，反應(yīng)體系為5xPCR反應(yīng)緩沖液5nl、濃度為10隨ol/L的dNTPs0.5pl、上、下游引物各0.5(!l、模板0.5(il、濃度為2.5U/(il的PrimeSTARDNA聚合斷TaKaRa公司)0.25nl、雙蒸水補(bǔ)充至總體積為25反應(yīng)條件為溫度94。C預(yù)變性5分鐘；然后94。C變性30秒，68。C退火30秒，72。C延伸1.5分鐘，共31個(gè)循環(huán)，每循環(huán)1次退火溫度降低0.5°C,31個(gè)循環(huán)后降至53°C;再94。C變性30秒，53。C退火30秒，72。C延伸1.5分鐘，共10個(gè)循環(huán)；最后72""C延伸10分鐘；反應(yīng)起始時(shí)加入5'GSP,擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)后再加入U(xiǎn)PM;第二輪RACE巢式PCR:以步驟4.1合成的5'NGSP、嵌套通用引物(nesteduniversalprimer,NUP)為上下游引物，反應(yīng)條件與第一輪5'RACE相同，反應(yīng)起始時(shí)加入5'NGSP,擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)后再加入NUP;5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，其中1泳道為DL2000PCR分子量標(biāo)準(zhǔn)(Takara公司)，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約1500bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶；將鑒定正確的5'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化；4.2.33'RACE擴(kuò)增第一輪RACEPCR:以步驟4.2.1制得的3'cDNA第一鏈為模板，以UPM和步驟4.1合成的3'GSP為上下游引物，反應(yīng)條件與第一輪5'RACE基本相同，不同之處在于每個(gè)循環(huán)中72。C延伸40秒，反應(yīng)起始時(shí)同時(shí)加入U(xiǎn)PM和5'GSP;第二輪RACE巢式PCR:以步驟4.1合成的3'NGSP、NUP為上下游引物，反應(yīng)條件與第一輪3'RACE相同；3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)杲如圖3所示，其中l(wèi)泳道為MarkerVPCR分子量標(biāo)準(zhǔn)(TianGen公司)，2泳道為PCR產(chǎn)物，從圖可知，在約600bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶；將鑒定正確的3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)4亍切"交回收純^:;4.3RACE擴(kuò)增片段的克隆、序列測(cè)定及小型豬CYP3A88cDNA全長(zhǎng)序列拼接按照步驟3.3所述方法，分別將步驟4.2所得純化的5'和3'RACE擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，定向構(gòu)建重組克隆載體pMD19-T/5'RACE、pMD19-T/3'RACE,將所得重組克隆載體轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用PCR方法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行序列測(cè)定；測(cè)序結(jié)果顯示，去除載體序列后，5'RACE擴(kuò)增獲得1541bp片段，3'RACE擴(kuò)增獲得606bp片段，5'和3'RACE擴(kuò)增片段的序列用Pregap4軟件進(jìn)行拼接，重疊區(qū)域?yàn)?84bp，得到全長(zhǎng)為1965bp的拼接contig，說明已經(jīng)獲得完整的小型豬CYP3A88cDNA全長(zhǎng)序列，如SEQIDNo.1所示；5.小型豬CYP3A88基因開放閱讀框(ORF)的克隆根據(jù)小型豬CYP3A88cDNA全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)并合成如下引物P3如SEQIDNo.9所示、P4如SEQIDNo.IO所示；按照步驟3.2所述方法，以步驟2提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)15為逆轉(zhuǎn)錄引物，以引物P3、P4為上下游引物，RT-PCR擴(kuò)增小型豬CYP3A88基因ORF;PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖4所示，其中1泳道為WideRangeDNAMarker(500-12000bp,TaKaRa公司),2泳道為PCR產(chǎn)物,在約1600bp的位置出現(xiàn)一條特異性DNA條帶，與引物設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)擴(kuò)增大小(1613bp)相符，說明目的基因4并接正確；PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化；按照步驟3.3所述方法，將所得純化的PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，用PCR方法鑒定陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行序列測(cè)定，獲得1613bp的cDNA序列，分析結(jié)果表明該序列包含長(zhǎng)1509bp的小型豬CYP3A88基因0RF(SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列)，其編碼有503個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(序列如SEQIDNo.2所示)，即CYP3A88。二、小型豬CYP3A88基因的序列分析和同源性比較將小型豬CYP3A88基因在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST同源序列比對(duì)，結(jié)果表明，小型豬CYP3A88基因?yàn)樾掳l(fā)現(xiàn)的豬CYP3A亞家族基因，GenBank登錄的豬CYP39v2(登錄號(hào)為EF625354),CYP3A46(登錄號(hào)為AB052266.1)均為該基因的片段。小型豬CYP3A88基因(SEQIDNo.1中第1-1965位核苷酸)全長(zhǎng)1965bp,其0RF為1509bp(第56-1564位核苷酸)，編碼有503個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(如SEQIDNo.2所示)；5'非編碼區(qū)長(zhǎng)55bp(第1-55位核苷酸)；3，非編碼區(qū)長(zhǎng)396bp(第1565-1965位核苷酸)，其中polyA長(zhǎng)度為29bp(第1937-1965位核苷酸)。經(jīng)SignalP3.0信號(hào)肽分析,小型豬CYP3A88的第1-29位氨基酸序列為信號(hào)肽序列。將CYP3A88氨基酸序列與小型豬其它3個(gè)CYP3A家族成員(CYP3A39、CYP3A29、CYP3A22)進(jìn)4亍對(duì)比，其相似性分別為92。/。，89%，80%。上述4個(gè)豬CYP3A家族成員與人CYP3A家族成員(CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43)序列比對(duì)結(jié)果見表l,從表l中可看出，小型豬CYP3A88與人CYP3A4相似性最高，為77%。表l、小型豬CYP3A與人CYP3A的氨基酸序列相似性比較(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>用Phylip3.66軟件將小型豬和其它4種哺乳動(dòng)物(人、犬、大鼠、小鼠)的CYP3A家族基因作系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖5所示，圖中H代表人、D代表犬、R代表大鼠、M代表小鼠，從圖5可知，各物種的CYP3A基本各自為一分支，提示細(xì)胞色素P450具有較明顯的種屬差異性，在選擇藥物代謝模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)應(yīng)重視種屬差異；小型豬CYP3A88首先與豬CYP3A其他成員聚為一類；然后豬與犬聚為一類，再和人聚為一類，而大鼠和小鼠聚在另一分支，說明豬、犬和人的細(xì)胞色素P450基因具有較近的遺傳關(guān)系，從而推測(cè)在CYP3A亞家族參與的藥物代謝中，豬與犬比大鼠和小鼠作為模型動(dòng)物更為合適，由于小型豬的諸多應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，其作為CYP3A亞家族的藥物代謝模型具有良好的應(yīng)用前景。三、小型豬CYP3A88基因的用途小型豬CYP3A88基因編碼相應(yīng)的P450單酶CYP3A88,該酶通過參與外源藥物的I相代謝中的氧化反應(yīng)，決定藥物的藥代動(dòng)力學(xué)特性、毒副作用及藥物的相互作用特性。小型豬CYP3A88基因具有如下多種用途1、小型豬CYP3A88基因可用于CYP3A88mRNA的表達(dá)水平研究，這對(duì)于評(píng)估小型豬是否適宜于作為人CYP3A介導(dǎo)的藥理學(xué)研究動(dòng)物模型具有重要意義；同時(shí)，通過測(cè)定CYP3A88mRNA的表達(dá)水平，可進(jìn)4亍藥物對(duì)小型豬CYP3A88基因表達(dá)的誘導(dǎo)或抑制作用研究。2、以小型豬CYP3A88基因構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞表達(dá)可獲得小型豬CYP3A88，用于小型豬體內(nèi)的藥物代謝特性研究、毒理作用研究、藥物相互作用研究等，一方面評(píng)價(jià)小型豬作為人類藥物代謝模型的適用性；另一方面為評(píng)估獸藥殘留、獸藥之間的相互作用、新獸藥研發(fā)等提供基礎(chǔ)依據(jù)。3、根據(jù)小型豬CYP3A88基因序列，可通過基因沉默、抗原抗體反應(yīng)等抑制該基因表達(dá)或CYP3A88代謝酶活性，用于研究豬CYP基因的代謝特性。4、通過基因重組技術(shù)以小型豬CYP3A88基因制得小型豬CYP3A88后，可進(jìn)一步制備小型豬CYP3A88的特異性抗體，用于CYP3A88基因的表達(dá)定量檢測(cè)，為研究藥物對(duì)小型豬CYP3A88基因的誘導(dǎo)或抑制作用提供必要的檢測(cè)技術(shù)。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>小型豬細(xì)胞色素P450的基因<160〉10<210〉1<211〉1965<212〉DM<213>豬(Susscrofa)<220><221>CDS<222〉(56)…(1564)<400〉1gggcacaaccagctaaaaggaaaatccgaggagagaatcacggaggacagtggccatg58Met1gacctgateccaggcttttecacagaaacctgggUetcctggetacc106AspLeulieProGlyPheSerThrGluThrTrpValLeuLeuAlaThr51015agectggtgetcetctatetatatgggactUtteacatggccttttt154SerLeuValLeuLeuTyrLeuTyrGlyThrTyrSerHisGlyLeuPhe202530aagaagctggggattcctgggccaagacctctgccttattUggaaat202LysLysLeuGlylieProGlyProArgProLeuProTyrPheGlyAsn354045atectgggctaccgtaagggtgttgaccatUtgacaaaaagtgtttt250lieLeuGlyTyrArgLysGlyValAspHisPheAsplysLysCysPhe50556065caacagtatgggaaaatgtgggggUttttgatggteggcagcccgtg298GinGinTyrGlyLysMetTrpGlyPhePheAspGlyArgGinProVal707580ttggetateaccgatccagacatgateaaaacggtcetcgtgaaagaa346lxuAlalieThrAspProAspMetlieLysThrValLeuValLysGlu859095tgttattctgtcUcacaaaceggeggtcttttggtccacgtggtget394CysTyrSerValPheThrAsnArgArgSerPheGlyProArgGlyAla100105110atgagaagtgetgtctctctggetgaggatgaagagtggaaaagaate442MetArgSerAlaValSerLeuAlaGluAspGluGluTrpLysArglie115120125cgaacgttgctgtctccgaccttcaccagtggaaagetcaaggagatg490ArgThrLeuLeuSerProThrPheThrSerGlyLysLeuLysGluMet130135140145ttccccateattagecattatggagacttgttggtgageaacctgagg538PheProlielieSerHisTyrGlyAspLeuLeuValSerAsnLeuArg150155160aaggaagcagagaaaggcaaacctgtgaccatgaaagacatetttggg586LysGluAlaGluLysGlyLysProValThrMetLysAspliePheGly165170175gcctacageatggacgtgateactageacagcatttggagtgaacgtc634AlaTyrSerMetAspVallieThrSerThrAlaPheGlyValAsnVal180185190gattecetcaacaacccacaagacccctttgtggaaaacageaggaag682AspSerLeuAsnAsnProGinAspProPheValGluAsnSerArgLys195200205etcttaaaatttagtttcUcagtccattcUtetcteaataatattc730LeuLeuLysPheSerPhePheSerProPhePheLeuSerlieliePhe210215220225tttccattcUgaccccgateUggaagtattaaacateactctgttt778PheProPheLeuThrProlieLeuGluValLeuAsnlieThrLeuPhe230235240cccaaaagtgttgtgaattttttcacgagatecataaaaaggatgaaa826ProLysSerValValAsnPhePheThrArgSerlieLysArgMetLys245250255gaaagtcgcetcaaagatacacaaaagcaccgagtggaccUcUcag874GluSerArgLeuLysAspThrGinLysHisArgValAspLeuLeuGin260265270ctgatgattaacteccagaattecaaagaaatggacgcccataaaggt922LeuMetlieAsnSerGinAsnSerLysGluMetAspAlaHisLysGly275280285ctgtecaatgaagaacttgtggcccaaggtgttatttttatttttget970LeuSerAsnGluGluLeuValAlaGinGlyValliePheliePheAla290295300305gggtatgagaccactageagttctetctecetccttgtgtatgaattg1018GlyTyrGluThrThrSerSerSerLeuSerLeuLeuValTyrGluLeu310315320gccactcaccctgacgtccagcagaagctgcaggaggagattgatgcg1066AlaThrHisProAspValGinGinLysLeuGinGluGlulieAspAla325330335accttccccaataaggcgcctcctacctaxgatggtctggcgcaaatg1114ThrPheProAsnLysAlaProProThrTyrAspGlyLeuAlaGinMet340345350gagtatcUgacatggtggtgaacgaatctetcagaatattcccagtt1162GluTyrLeuAspMetValValAsnGluSerLeuArgliePheProVal355360365actcctagagttgagagggtctgtaagaaggatgtggaaatecatggc1210ThiProArgValGluArgValCysLysLysAspValGlulieHisGly370375380385gtgttcValPhegttValcccProaaaLys390gggGlyactThrgtgValatgMetatgMet395gtgValccaProatelietttPhegcgAla400cttLeu1258cac3gaHisArggccAlaccgPro405gagGluetcLeutggTrpccaProgagGlu410cctProgagGlugagGluttcPhecgcArg415cctProgaaGlu13063ggttcArgPheagtSer420呵LysaagLysaacAsnaagLysgacAsp4253CCThratalieaatAsncctProtacTyr430actThrtacTyrctgLeu1354ccctttProPhe435gggGlyactThrggaGlycccProcgcArg440aacAsntgcCysattlieggcGlyatgMet445aggArgtttPhegccAlaetcLeu1402atgaacMetAsn450atgMetaaaLysetcLeugetAla455etcLeugtcValagaArggtcValctgLeu460cagGinaacAsnttcPhetecSerttcPhe4651450aaacctLysProtgtCysa￡iaLysgaaGlu470acaThrcagGinateliecccProctgLeu475aaaLysatalieageSertecSercagGin480ggaGly1498cttateLeulieGinccaPro485gaaGluaaaLyscctProattliegttVal490ctaLeuatgMetgUValgtgValcccPro495agaArggatAsp1546gggaccGlyThracaThr500agtSerggaGlygccAlatgacUtgcctaaggactcgggcttggUc1.594ctcaaggaagctgcatcccagagtaccagagaccttgatttcctttgtgaUagaactcg1654aaataaagataagcttaatctagtgeattegatggatgattagagatgetgcccattcct1714tagcttctccctgtctatgtggagtgttacatactgtgtcatttgaaagaggtgattaat1774gagggtcagacatgcagactcagcttcUgggttctcctaggaacaaactttaatgaaaa1834gaagagttattgtggtgaccaaagtggatatttgtgttccagattttatgttgaatattc1894taaattaaatattatatgaagccaataaacatccctttacagaaaaaaaaaaaaaaaaaa1954aaaaaaaaaaa1965<210>2<211>503<212>PRT<213>豬(Susscrofa)<400>2MetAspLeulieProGlyPheSerThrGluThrTrpValLeuLeuAla151015ThrSerLeuValLeuLeuTyrLeuTyrGlyThrTyrSerHisGlyLeu202530PheLysLysLeuGlylieProGlyProArgProLeuProTyrPheGly354045AsnlieLeuGlyTyrArgLysGlyValAspHisPheAspLysLysCys505560PheGinGinTyrGlyLysMetTrpGlyPhePheAspGlyArgGinPro65707580ValLeuAlalieThrAspProAspMetlieLysThrValLeuValLys859095GluCysTyrSerValPheThrAsnArgArgSerPheGlyProArgGly100105110AlaMetArgSerAlaValSerLeuAlaGluAspGluGluTrpLysArg115120125lieArgThrLeuLeuSerProThrPheThrSerGlyLysUuLysGlu130135140MetPheProlielieSerHisTyrGlyAspLeuLeuValSerAsnLeu145150155160ArgLysGluAlaGluLysGlyLysProValThrMetLysAspliePhe165170175GlyAlaTyrSerMetAspVallieThrSerThrAlaPheGlyValAsn180185190ValAspSerLeuAsnAsnProGinAspProPheValGluAsnSerArg195200205LysLeuLeuLysPheSerPhePheSerProPhePheLeuSerlielie210215220PhePheProPheLeuThrProlieLeuGluValLeuAsnlieThrLeu225230235240PheProLysSerValValAsnPhePheThrArgSerlieLysArgMet245250255LysGluSerArgLeuLysAspThrGinLysHisArgValAspLeuLeu260265270GinLeuMetlieAsnSerGinAsnSerLysGluMetAspAlaHisLys275280285GlyLeuSerAsnGluGluLeuValAlaGinGlyValliePheliePhe290295300AlaGlyTyrGluThrThrSerSerSerLeuSerLeuLeuValTyrGlu305310315320LeuAlaThrHisProAspValGinGinLysLeuGinGluGlulieAsp325330335AlaThrPheProAsnLysAlaProProThrTyrAspGlyLeuAlaGin340345350MetGluTyrLeuAspMetValValAsnGluSerlxuArgliePhePro355360365ValThrProArgValGluArgValCysLysLysAspValGlulieHis370"5380GlyValPheValProLysGlyThrValMetMetValProliePheAla385390395400LeuHisArgAlaProGluLeuTrpProGluProGluGluPheArgPro405410415GluArgPheSerLysLysAsnLysAspThrlieAsnProTyrThrTyr420425430LeuProPheGlyThrGlyProArgAsnCyslieGlyMetArgPheAla435440445LeuMetAsnMetLysLeuAlaLeuValArgValLeuGinAsnPheSer450455460PheLysProCysLysGluThrGinlieProLeuLyslieSerSerGin465470475480GlyLeulieGinProGluLysProlieValLeuMetValValProArg485490495AspGlyThrThrSerGlyAla500<2〗0〉3<211〉22<212〉腿<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述引物P1<400>3catggtggtgaacgaatctctc22<210>4<211〉25<212〉DNA<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述引物P2<400>4catagacagggagaagctaaggaat25<210>5<211>24<212>腿<213>人工序列<220><223>人工序列的描述5'GSP<400>5ccc"ctctgggcacaaccattag24<210〉6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉人工序列的描述5'NGSP<400〉6gggcacaaccattagaacaatagg24<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述3'GSP<400>7tggtggtgaacgaatctctcagaa24<210〉8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述3'NGSP<權(quán)>8tttgggactggaccccgcaac21<210>9<211>23<212>飄<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物P3<400>9ggaaaatccgaggagagaatcac23<210>10<211>25<212>腿<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述引物P4caaggtctctggtactctgggatgc2權(quán)利要求1、小型豬細(xì)胞色素P450，具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。2、編碼權(quán)利要求1所述的小型豬細(xì)胞色素P450的基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼小型豬細(xì)胞色素P450的基因，具有SEQIDNo.1中第56-1564位核苷酸序列。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的編碼小型豬細(xì)胞色素P450的基因，具有SEQIDNo.1中第1-1965位核苦酸序列。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了氨基酸序列如SEQIDNo.2所示的小型豬細(xì)胞色素P450的基因，本發(fā)明獲得的基因一方面可用于小型豬細(xì)胞色素P450mRNA的表達(dá)水平研究、藥物的基因表達(dá)誘導(dǎo)或抑制作用研究，另一方面可通過基因重組技術(shù)制備小型豬細(xì)胞色素P450及其特異性抗體，用于小型豬體內(nèi)的藥物代謝特性、毒理作用和藥物相互作用研究。文檔編號(hào)C12N15/53GK101328474SQ20081006997公開日2008年12月24日申請(qǐng)日期2008年7月14日優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日發(fā)明者宇劉,商海濤,蓓桂,王世春,泓魏申請(qǐng)人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)