一對(duì)特異識(shí)別豬NFкBp65基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一對(duì)特異識(shí)別豬NFκBp65基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。該多肽由多肽甲和多肽乙組成；多肽甲中雙連氨基酸依次如下：序列3的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479、512-513和546-547；多肽乙中雙連氨基酸依次如下：序列5的2-3、36-37、70-71、104-105、138-139、172-173、206-207、240-241、274-275、308-309、342-343、376-377、410-411、444-445、478-479、512-513和546-547。本發(fā)明提供的多肽可以特異識(shí)別豬NFκBp65基因，適合應(yīng)用于NFκBp65基因的敲除或改造，以獲得豬抗病育種材料、異種移植供體及人類疾病動(dòng)物模型。
【專利說(shuō)明】—對(duì)特異識(shí)別豬NF K Bp65基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一對(duì)特異識(shí)別豬NFK B p65基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]p65是NF K B轉(zhuǎn)錄因子最重要的一個(gè)亞基。豬NF κ B ρ65與仔豬藍(lán)耳病毒、豬瘟病毒及偽狂犬病毒抗體水平有顯著關(guān)聯(lián)(Li et al.，2011)，其單個(gè)氨基酸的改變可引起家豬對(duì)非洲豬瘟病毒(ASFV)感染能力的顯著變化(Palgrave et al.,2011) 0由此可見(jiàn)，豬NF K B p65基因可作為豬抗病育種的一個(gè)重要候選基因。
[0003]p65作為NFk B轉(zhuǎn)錄因子一個(gè)主要的亞基，在哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。在含有TAD的三個(gè)亞基中，p65是唯——個(gè)全身性表達(dá)的(Doleschall et al.，2007)。p65亞基的缺失導(dǎo)致因肝變性所致胚胎死亡(Beg et al.，1995);相應(yīng)的，缺失其它四個(gè)亞基中任何一個(gè)都僅僅導(dǎo)致免疫缺陷，并未表現(xiàn)出任何發(fā)育障礙(Gerondakiset al., 1999 ；Li and Verma,2002)。與p65在不同細(xì)胞中發(fā)揮著抗凋亡作用相一致，P65雙敲除的成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也表現(xiàn)出對(duì)TNFa誘導(dǎo)凋亡的敏感度增加(Beg andBaltimore, 1996 ；Gerondakis et al., 1999)。p65雙敲除的小鼠成纖維細(xì)胞永生化速度大大超過(guò)正常未敲除細(xì)胞(Wang et al.，2009)。p65也對(duì)正常淋巴細(xì)胞的功能起著重要的作用(Gerondakis et al., 1999)。NF- κ B ρ65亞基特異性調(diào)節(jié)cyclin Dl蛋白的穩(wěn)定性(Dahlman et al.，2009)。p65對(duì)I κ B β蛋白的緊密控制在維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡中是必需的。Ρ65的激活對(duì)于細(xì)胞死亡和腸上皮的分裂的動(dòng)態(tài)平衡是必需的，同樣在防止重度急性腸炎的發(fā)生上也是必要的(Steinbrech`er et al.，2008)。在腫瘤抑制因子p53存在或缺失的情況下，p65的刪除均可減少K-Ras誘導(dǎo)的肺部腫瘤數(shù)量(Basseres et al., 2010)。
[0004]另外，豬被認(rèn)為是異種移植最重要的器官供體。NFk B介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活是引起豬-人異種移植排斥反應(yīng)的重要原因(Altintas et al.,2011 ；Auchincloss and Sachs,1998)，而p65作為NF κ B轉(zhuǎn)錄因子的主要亞基，必然會(huì)在這一免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。
[0005]綜上所述，在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)豬NF κ B ρ65基因進(jìn)行敲除或修飾，可解析豬NF κ Βρ65基因的功能、減緩豬-人異種移植排斥反應(yīng)或獲得相關(guān)疾病模型，為豬抗病育種、異種器官移植及新藥研發(fā)服務(wù)。
[0006]傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)效率很低，因此尋找一種能定點(diǎn)切割豬NF κ B ρ65基因的技術(shù)相當(dāng)重要。近年來(lái)發(fā)展的主要方法為依托序列特異的核酸酶進(jìn)行基因的精確修飾。序列特異的核酸酶主要由一個(gè)DNA識(shí)別域與一個(gè)能非特異性切割DNA的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域連接而成。其主要原理為先由DNA識(shí)別域識(shí)別并結(jié)合到需要改造的DNA片段上，然后由與DNA相連的非特異性內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域?qū)NA進(jìn)行切割,造成DNA的雙鏈斷裂(Double-strand break,DSB)，DSB會(huì)激活DNA的自我修復(fù)而引起基因的突變從而促進(jìn)該位點(diǎn)的同源重組。
[0007]轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-like effectornucleases, TALEN)是繼鋅指核酸酶技術(shù)以來(lái)的另一種能夠?qū)蚪M進(jìn)行高效定點(diǎn)修飾的新技術(shù)。轉(zhuǎn)錄因子激活效應(yīng)物家族中有一種蛋白(TALEs)能夠識(shí)別、結(jié)合DNA。TALE與DNA序列特異性結(jié)合主要是由TAL結(jié)構(gòu)內(nèi)34個(gè)恒定氨基酸序列介導(dǎo)。將TALEs與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域相連接，形成TALEN，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA雙鏈在特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾。
[0008]在TALE的中央存在著一個(gè)重復(fù)區(qū)域，這個(gè)區(qū)域通常是由33-35個(gè)氨基酸的數(shù)量可變的重復(fù)單元構(gòu)成。重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(Repeat Domain)負(fù)責(zé)識(shí)別特異性的DNA序列。每個(gè)重復(fù)序列基本上都是一樣的，除了兩個(gè)可變的氨基酸，即重復(fù)序列可變的雙氨基酸殘基(Repeat-Variable Diresidues, RVD)。TALE識(shí)別DNA的機(jī)制在于一個(gè)重復(fù)序列上的RVD能夠識(shí)別DNA靶點(diǎn)上的一個(gè)核苷酸，再融合FokI核酸內(nèi)切酶，組合成TALEN。TALEN是一種異源二聚體分子(兩單位的TALE DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到一單位的催化性結(jié)構(gòu)域)，能夠切割兩個(gè)相隔較近的序列，從而使得特異性增強(qiáng)。該酶效率高、毒性低、制備周期短，成本低，優(yōu)勢(shì)日益明顯。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一對(duì)特異識(shí)別豬NFk B p65基因的多肽及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明利用這對(duì)多肽構(gòu)建獲得的一對(duì)重組的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子(TALE)能夠特異性地識(shí)別豬NFk B P65基因。本發(fā)明還利用這對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子構(gòu)建獲得的一對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)，能夠?qū)ωiNF κ B p65基因進(jìn)行準(zhǔn)確、高效地靶向修飾。
[0010]具體地，本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0011]一對(duì)特異識(shí)別豬NFK B p65基因的多肽(命名為特異多肽對(duì))，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙
連氨基酸；
[0012]所述多肽甲中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下:序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基。
[0013]所述多肽乙中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下:序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基。
[0014]所述多肽甲具體可如序列表的序列3所示。
[0015]所述多肽乙具體可如序列表的序列5所示。
[0016]本發(fā)明還保護(hù)一對(duì)DNA分子(命名為特異DNA分子對(duì))，由編碼所述多肽甲的DNA分子甲和編碼所述多肽乙的DNA分子乙組成。
[0017]所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下:序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。
[0018]所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下--序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。
[0019]所述DNA分子甲具體可如序列表的序列2所示。
[0020]所述DNA分子乙具體可如序列表的序列4所示。
[0021]本發(fā)明還保護(hù)一對(duì)質(zhì)粒(命名為特異質(zhì)粒對(duì))，由具有所述DNA分子甲的質(zhì)粒甲和具有所述DNA分子乙的質(zhì)粒乙組成。
[0022]所述質(zhì)粒甲具體可為在pCS2_Fok I載體(PEAS型)的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子甲得到的重組質(zhì)粒。
[0023]所述質(zhì)粒乙具體可為在pCS2_Fok I載體(PERR型)的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子乙得到的重組質(zhì)粒。
[0024]本發(fā)明還保護(hù)所述特異多肽`對(duì)在特異識(shí)別和靶向修飾豬NFk B p65基因中的應(yīng)用。所述豬NF K B p65基因，具體可如序列表的序列I所不。
[0025]本發(fā)明還保護(hù)所述特異質(zhì)粒對(duì)在特異切割豬NFk B P65基因中的應(yīng)用。所述豬NF κ Bp65基因，具體可如序列表的序列I所不。
[0026]本發(fā)明還保護(hù)所述特異質(zhì)粒對(duì)在構(gòu)建豬NF κ B p65基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。所述豬NF κ Bp65基因，具體可如序列表的序列I所不。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了特異識(shí)別豬NFk B p65基因的多肽對(duì)，并提供了該多肽對(duì)的編碼基因。本發(fā)明同時(shí)提供了用于基因工程的質(zhì)粒對(duì)，該質(zhì)粒對(duì)由兩個(gè)質(zhì)粒組成，其中一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)一條多肽和PEAS型Fok I核酸內(nèi)切酶的融合蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)另一條多肽和Fok I核酸內(nèi)切酶(PERR型)的融合蛋白。將所述質(zhì)粒對(duì)導(dǎo)入含有目的基因的細(xì)胞，可以使細(xì)胞中的目的基因被特異切割，在細(xì)胞自身修復(fù)系統(tǒng)的作用下，可以得到目的基因的突變庫(kù)。本發(fā)明的目的在于，在細(xì)胞或個(gè)體水平上對(duì)豬NFkB p65基因進(jìn)行敲除或修飾，以解析豬NF κ B p65基因的功能、構(gòu)建豬NF κ B p65基因突變庫(kù)或獲得相關(guān)疾病模型，為豬抗病育種及新藥研發(fā)服務(wù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028]圖1為四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖和工作原理示意圖。
[0029]圖2為重組質(zhì)粒TALE-L具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。[0030]圖3為重組質(zhì)粒TALE-R具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。
[0031]圖4為重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_L和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_R的構(gòu)建流程示意圖。
[0032]圖5為重組質(zhì)粒pGL4-SSA_p65的工作原理示意圖。
[0033]圖6 為 TALEN 質(zhì)粒對(duì) pcs2-TALE-peas_L 和 pcs2_TALE-perr-R 轉(zhuǎn)染豬 PEF 細(xì)胞60h后提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆后的部分測(cè)序結(jié)果(突變序列)。
[0034]圖7 為 TALEN 質(zhì)粒對(duì) pcs2-TALE-peas_L 和 pcs2_TALE-perr-R 的工作原理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
[0036]pTALE-A:CffB 10, Cat N0.CW2238。pTALE-G:CWB10，Cat N0.CW2239。pTALE-C:CWBIO, Cat N0.CW2240。pTALE-T:CWB10，Cat N0.CW2241。293T 細(xì)胞系:CWBIO，CatN0.CW2095。
[0037]pGM-SSA 載體:Addgene，Cat N0.429620 pRL-TK 載體:Promega，Cat N0.E22410
[0038]實(shí)施例1、TALE靶點(diǎn)識(shí)別模塊的構(gòu)建
[0039]一、四種模塊以及將模`塊進(jìn)行組合的機(jī)理描述
[0040]TAL的核酸識(shí)別單元為間隔32個(gè)恒定氨基酸序列的雙連氨基酸(即相鄰的兩個(gè)氨基酸)。雙連氨基酸與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、HD識(shí)別C、NN識(shí)別G。pTALE-A質(zhì)粒、pTALE_G質(zhì)粒、pTALE_C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒為單模塊載體，為分別具有上述四種TAL的核酸識(shí)別單元的編碼DNA的質(zhì)粒，且在編碼DNA的5’末端具有SpeI酶切識(shí)別序列、3’末端具有連續(xù)的Nhe I酶切識(shí)別序列和Hind III識(shí)別序列。通過(guò)單模塊載體上的Spe 1、Nhe I和Hind III酶切位點(diǎn)按照靶點(diǎn)序列相對(duì)應(yīng)的TAL單元即可串聯(lián)克隆，其中右側(cè)靶點(diǎn)序列需反向構(gòu)建模塊。四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖和工作原理示意圖見(jiàn)圖1。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因，因?yàn)镕ok I需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰(間隔14 18堿基)的靶序列(一般十幾個(gè)堿基)分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。
[0041]二、靶點(diǎn)的選擇
[0042]NFkB p65基因的部分序列見(jiàn)序列表的序列1，其中自5’末端第196至270位核苷酸為第十外顯子。首先通過(guò)大量序列分析和篩選工作將第十外顯子作為初步選定的靶點(diǎn)，然后通過(guò)進(jìn)一步篩選，將序列表的序列I自5’末端第216至269位核苷酸作為進(jìn)一步選定的靶點(diǎn)，通過(guò)再次的篩選，將序列表的序列I自5’末端第217-233位核苷酸和第252-268位核苷酸作為最終的靶點(diǎn)。
[0043]三、重組質(zhì)粒TALE-L (左側(cè)TALE模塊)和重組質(zhì)粒TALE-R(右側(cè)TALE模塊)的構(gòu)建
[0044]根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-L(具有圖2所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖2。根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-R(具有圖3所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖3。重組質(zhì)粒TALE-L識(shí)別17個(gè)核苷酸(GCAACCCGGCGCATTGC)，重組質(zhì)粒 TALE-R 識(shí)別 17 個(gè)核苷酸(GGCTTGGGGACGGAAGC)。
[0045]重組質(zhì)粒TALE-L和重組質(zhì)粒TALE-R經(jīng)Spe I和Nhe I雙酶切，均產(chǎn)生1.7kb左右預(yù)期條丨丨重組質(zhì)粒TALE-L和重組質(zhì)粒TALE-R統(tǒng)稱重組質(zhì)粒TALE。
[0046]四、重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_L和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-perr-R的構(gòu)建
[0047]pCS2-Fok I載體:CWB10，Cat N0.CW2273 ;包括一對(duì)結(jié)構(gòu)基本相同的質(zhì)粒，pCS2-Fok I 載體(PEAS 型)和 pCS2_Fok I 載體(PERR 型)，pCS2_Fok I 載體(PEAS 型)又稱 PEAS 型 pCS2-Fok I 載體，pCS2_Fok I 載體(PERR 型)又稱 PERR 型 pCS2_Fok I 載體，pCS2-Fok I載體(PEAS型)和pCS2_Fok I載體(PERR型)的差異僅在于pCS2_Fok I載體(PEAS型)具有編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2_Fok I載體(PERR型)具有編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PERR型)的DNA序列；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為:具有由sCMV啟動(dòng)了控制的、除目標(biāo)基因靶點(diǎn)識(shí)別域外的TALEN必需元件、編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型或PERR型)的DNA序列，在編碼TALE0.5單元模塊(RVD NG,識(shí)別T堿基)的DNA序列的5 ’端嵌有限制性內(nèi)切酶Nhe I DNA的識(shí)別序列。Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型)和Fok I核酸內(nèi)切酶(PERR型)形成二聚體后發(fā)揮內(nèi)切酶的功能。
[0048]重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_L 和重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-perr-R 統(tǒng)稱 pcs2_TALEN,構(gòu)建流程不意圖見(jiàn)圖4。
[0049]1、用限制性內(nèi)切酶Spe I和Nhe I雙酶切重組質(zhì)粒TALE-L，回收約1.7kb的DNA片段。
[0050]2、用限制性內(nèi)切酶Nhe I酶切pCS2_Fok I載體(PEAS型)，回收約5.4kb的載體骨架。`
[0051]3、將步驟I得到的DNA片段和步驟2得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_L (左側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_L進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCS2-Fok I載體(PEAS型)的NheI酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列3所示的雙鏈DNA分子(序列表的序列2所不的DNA分子編碼序列表的序列3所不的蛋白質(zhì)；序列3中的雙連氨基酸分別為:第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基、第546-547位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcS2-TALE-peaS-L中，在CMV啟動(dòng)子的作用下，表達(dá)序列3所示蛋白質(zhì)與Fok I內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-L)，該融合蛋白中，序列3所示蛋白質(zhì)位于N末端。
[0052]4、用限制性內(nèi)切酶Spe I和NheI雙酶切重組質(zhì)粒TALE-R，回收約1.7kb的DNA片段。
[0053]5、用限制性內(nèi)切酶NheI酶切pCS2_Fok I載體(PERR型)，回收約5.5kb的載體骨架。[0054]6、將步驟4得到的DNA片段和步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE-perr-R(右側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-perr-R進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在pCS2-Fok I載體(PERR型)的NheI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4所不的DNA分子(序列表的序列4所不的DNA分子編碼序列表的序列5所不的蛋白質(zhì)；序列5中的雙連氨基酸分別為:第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基、第546-547位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcS2-TALE-peaS-R中，在CMV啟動(dòng)子的作用下，表達(dá)序列5所示蛋白質(zhì)與Fok I內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-R)，該融合蛋白中，序列5所示蛋白質(zhì)位于N末端。
[0055]實(shí)施例2、報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建
[0056]1、合成序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子(靶點(diǎn)片段)。
[0057]2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用NFkB p65F和NF κ B p65R組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0058]NFk B p65F:5，-ACTTATGTTACCCGGGCGGATTGAGGAGAAACGCAAAAGG-3> ；
[0059]NF κ B p65R:5’ -ATACATGTATCCCGGGAGAAACAGGAGCCCAACAGAGGG-3>。
[0060]3、用限制性內(nèi)切酶XmaI酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
[0061]4、用限制性內(nèi)切酶XmaI酶切pGL4_SSA載體，回收約5.7kb的載體骨架。
`[0062]5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pGL4-SSA_p65 (報(bào)告質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pGL4-SSA-p65進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下:在p GL4-SSA載體的XmaI酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列6所示的DNA分子(NF κ B p65片段)。由CMV啟動(dòng)子控制的SSA報(bào)告基因(即Firefly Luciferase基因，中文名稱為螢火蟲熒光素酶基因)被終止密碼子和靶點(diǎn)片段分割為兩段(自上游至下游依次命名為片段甲和片段乙，片段甲的下游和片段乙的上游為同源臂)。將重組質(zhì)粒pGL4-SSA-p65導(dǎo)入細(xì)胞后，因?yàn)槠渭缀推我抑g具有終止密碼子和靶點(diǎn)片段組成的間隔區(qū)，只能表現(xiàn)出很弱的螢火蟲熒光素酶活性。將重組質(zhì)粒pGL4-SSA-p65導(dǎo)入細(xì)胞后，如果間隔區(qū)的DNA片段被切割，片段甲和片段乙可以借助同源臂發(fā)生同源重組并形成有活性的螢火蟲熒光素酶基因，使得螢火蟲熒光素酶活性顯著增強(qiáng)，工作原理示意圖見(jiàn)圖5。
[0063]實(shí)施例3、通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法驗(yàn)證實(shí)施例1構(gòu)建的質(zhì)粒的TALEN活性
[0064]分別進(jìn)行如下2組實(shí)驗(yàn)處理(每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)處理,結(jié)果取三個(gè)重復(fù)處理的平均值；轉(zhuǎn)染試劑均為DNA Fect TransfectionReagentDNA轉(zhuǎn)染試劑，CWBIO, Cat N0.CW0860,每個(gè)處理中轉(zhuǎn)染試劑的加入量為6 μ 1，并按照說(shuō)明書進(jìn)行操作):
[0065]第I組:將0.4 μ g pRL-TK質(zhì)粒(參考對(duì)照質(zhì)粒)、2.0 μ g重組質(zhì)粒pGL4_SSA-p65、4.0yg質(zhì)粒載體pCS2-Fok I (PEAS型)和4.0 μ g質(zhì)粒載體pCS2_Fok I (PERR型)共轉(zhuǎn)染IXlO6 的 293T 細(xì)胞；
[0066]第2組:將0.4 μ g pRL-TK質(zhì)粒(參考對(duì)照質(zhì)粒)、2.0 μ g重組質(zhì)粒pGL4_SSA-p65、4.0 μ g 重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-peas_L 和 4.0 μ g 重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-perr-R 共轉(zhuǎn)染 I X IO6的293T細(xì)胞；
[0067]轉(zhuǎn)染24小時(shí)后取各組的細(xì)胞進(jìn)行裂解并檢測(cè)熒光素酶的熒光信號(hào)(儀器為:Luminometer, DLReady,型號(hào)是TD-20 / 20),結(jié)果見(jiàn)表1。突光素酶檢測(cè)按照試劑盒Dualluciferase assay kit (Promega,貨號(hào) #E1910)說(shuō)明書進(jìn)行。
[0068]表1各組處理的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)
[0069]
第I組第2組
~Firefly ~Renilla~Firefly~Renilla~
F/R比值F/R比值
熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)


0.02904
重復(fù)處理 I 590.160 20315.8441596.740 19942.203 0.080068
9


0.02303
重復(fù)處理 2 590.160 25619.1332367.240 22725.797 0.104165` 6
重復(fù)處理 3 472.140 21162.762 0.02231 1714.760 21477.559 0.07984
—0.02479
平均值0.088024
8
P 值(--


0.00163
驗(yàn))
敲除活性3^50
[0070]TALENs 敲除效率=(第二組的 F / R):(第一組的 F / R) =3.550 (Ρ〈0.01)，即重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-L和重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-R對(duì)靶點(diǎn)片段的敲除活性為3.550。[0071 ] 實(shí)施例4、通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證實(shí)施例1構(gòu)建的質(zhì)粒的TALEN活性
[0072]PEF細(xì)胞(豬胎兒成纖維細(xì)胞):從流產(chǎn)的豬胎兒中分離得到PEF細(xì)胞(分離方法參見(jiàn)文獻(xiàn):李紅，魏紅江，許成盛，汪霞，卿玉波，曾養(yǎng)志；版納微型豬近交系胎兒成纖維細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特征；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)；第36卷第6期；2010年
12月；678-682)。
[0073]1、將 4 μ g 重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-peas_L 和 4 μ g 重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-perr-R通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方式共轉(zhuǎn)染I X IO6PEF細(xì)胞，得到重組細(xì)胞。
[0074]2、將步驟I得到的重組細(xì)胞30°C培養(yǎng)60小時(shí)，然后收集細(xì)胞。
[0075]3、提取步驟2收集的細(xì)胞的基因組DNA并作為模板，用PCRF與PCRR組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收376bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0076]PCRF:5’ -CGGATTGAGGAGAAACGCAAAAGG-3，:
[0077]PCRR: 5，-AGAAACAGGAGCCCAACAGAGGG-3，。
[0078]4、將步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18-T載體(寶生物，貨號(hào):D101A)連接，得到連接產(chǎn)物。
[0079]5、將步驟4得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(寶生物，D9057S)，然后涂布于含500mg / ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取100個(gè)克隆并進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算突變的克隆占總體克隆數(shù)的比例，從而估算出該對(duì)TALEN質(zhì)粒的效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)克隆在預(yù)期切割位點(diǎn)附近出現(xiàn)突變(詳見(jiàn)圖6)，即重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-L和pcs2-TALE-perr-R組成的TALEN質(zhì)粒對(duì)在PEF細(xì)胞基因組中的切割效率達(dá)5%。
[0080]重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-L和重組質(zhì)粒pcs2-TALE-perr-R的工作原理見(jiàn)圖7,兩種帶有Fok I功能域的靶向TALE核酸酶分別在CMV啟動(dòng)子控制下高效表達(dá)，并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的靶點(diǎn)DNA發(fā)生特異性結(jié)合。Fok I核酸內(nèi)切酶成二聚體行使DNA切割活性，切斷目標(biāo)基因DNA雙鏈。
【權(quán)利要求】
1.一對(duì)多肽，由多肽甲和多肽乙組成；所述多肽甲由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸；所述多肽乙由17個(gè)TAL核酸識(shí)別單元組成，每個(gè)TAL核酸識(shí)別單元中具有兩個(gè)雙連氨基酸； 所述多肽甲中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下:序列表的序列3自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基； 所述多肽乙中的17個(gè)雙連氨基酸依次如下:序列表的序列5自N末端第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基和第546-547位氨基酸殘基。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽對(duì)，其特征在于:所述多肽甲如序列表的序列3所示；所述多肽乙如序列表的序列5所示。
3.一對(duì)DNA分子，由編碼權(quán)利要求1中的所述多肽甲的DNA分子甲和編碼權(quán)利要求1中的所述多肽乙的DNA分子乙組成。
4.如權(quán)利要求3所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于: 所述DNA分子甲中，編碼所述多肽甲的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下:序列表的序列2自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。 所述DNA分子乙中，編碼所述多肽乙的17個(gè)雙連氨基酸的核苷酸依次如下:序列表的序列4自5’末端第4-9位核苷酸、第106-111位核苷酸、第208-213位核苷酸、第310-315位核苷酸、第412-417位核苷酸、第514-519位核苷酸、第616-621位核苷酸、第718-723位核苷酸、第820-825位核苷酸、第922-927位核苷酸、第1024-1029位核苷酸、第1126-1131位核苷酸、第1228-1233位核苷酸、第1330-1335位核苷酸、第1432-1437位核苷酸、第1534-1539位核苷酸和第1636-1641位核苷酸。
5.如權(quán)利要求4所述的一對(duì)DNA分子，其特征在于:所述DNA分子甲如序列表的序列2所示；所述DNA分子乙如序列表的序列4所示。
6.一對(duì)質(zhì)粒，由質(zhì)粒甲和質(zhì)粒乙組成；所述質(zhì)粒甲為具有權(quán)利要求3或4或5中所述的DNA分子甲的質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙為具有權(quán)利要求3或4或5中所述的DNA分子乙的質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求6所述的一對(duì)質(zhì)粒，其特征在于:所述質(zhì)粒甲是在PEAS型pCS2-FokI載體的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA 分子甲得到的重組質(zhì)粒；所述質(zhì)粒乙是在PERR型pCS2-FokI載體的多克隆位點(diǎn)插入所述DNA分子乙得到的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求1所述的一對(duì)多肽在特異識(shí)別和靶向修飾豬NFK B p65基因中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述的一對(duì)質(zhì)粒在特異切割豬NFK B p65基因中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述的一`對(duì)質(zhì)粒在構(gòu)建豬NFK B p65基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103554231SQ201310398624
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月5日
【發(fā)明者】李和剛, 趙金山, 阮進(jìn)學(xué), 李培培, 張寶珣, 劉明團(tuán), 代永聯(lián), 侯樂(lè)樂(lè), 郝小靜, 江科, 吳海港 申請(qǐng)人:青島市畜牧獸醫(yī)研究所