豬nr1h4基因的分子克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于家畜分子分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及豬NR1H4基因的分子克隆及應(yīng)用。本發(fā)明所述的分子標(biāo)記由NR1H4基因克隆得到，其NR1H4分子標(biāo)記的序列如SEQ?ID?NO：1所示。NR1H4基因的多態(tài)性是利用比較基因組學(xué)方法根據(jù)人的NR1H4基因序列設(shè)計(jì)引物，以豬的基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段利用測(cè)序篩選SNP，并利用PCR－RFLP進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)第709bp處有一個(gè)A/G的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Mwo?I多態(tài)性，并利用該標(biāo)記檢測(cè)了中外豬種的情況。本發(fā)明為豬標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。
【專利說明】豬NR1H4基因的分子克隆及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家畜分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種包含如SEQ ID NO:1所示豬基因核苷酸的核酸分子。本發(fā)明還涉及如SEQ ID N0:1所示的NR1H4基因的分子克隆方法及多核苷酸序列中的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)以及檢測(cè)所述單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬肉是動(dòng)物性蛋白的主要來源，隨著人們對(duì)肉需要量的增加，對(duì)肉質(zhì)的要求也相應(yīng)提高。影響豬肉質(zhì)的因素有遺傳和非遺傳的，豬肌內(nèi)脂肪含量對(duì)肉質(zhì)性狀有很大的影響，一般來說，肌內(nèi)脂肪含量越高，豬肉質(zhì)越嫩，從而肉質(zhì)越好。肉質(zhì)性狀大多屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制。許多肉質(zhì)性狀只能在動(dòng)物屠宰后才能測(cè)定，所以常規(guī)選育只能進(jìn)行同胞或半同胞測(cè)定，這樣必加大選育成本，且遺傳進(jìn)展緩慢。豬基因組草圖的構(gòu)建，使得尋找影響肉質(zhì)性狀的主基因或與其緊連鎖的分子標(biāo)記成為可能，這些分子標(biāo)記一經(jīng)確認(rèn)，就可進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇育種。利用分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇(MAS)進(jìn)行肉質(zhì)性狀改良是一種有效的途徑。
[0003]NR1H4 (Nuclear Receptor subfamily I, group H, member4,NRlH4)基因，也稱為法尼酯衍生物X受體(Farnesoid X receptor, FXR),是核受體的超家族成員之一,屬核激素受體超家族，高于生理濃度的法尼酯衍生物輕度激活該蛋白，故又稱為法尼酯衍生物X受體或“孤兒”核受體，人和小鼠NR1H4蛋白有α 1、α 2、β I和β 2幾種亞型。該蛋白氨基端為配體非依賴的轉(zhuǎn)錄活化域、DNA結(jié)合域、鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合域，羧基端為配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化域，具有典型的核受體結(jié)構(gòu)。配體與配體結(jié)合域的結(jié)合改變了核受體空間構(gòu)象，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因 的轉(zhuǎn)錄。初級(jí)鵝脫氧膽酸是NR1H4天然配體，人工合成的NR1H4配體有6-乙基鵝脫氧膽酸衍生物，其結(jié)合力比天然配體強(qiáng)數(shù)倍。次級(jí)膽汁酸石膽酸和脫氧膽酸可激活NR1H4。NR1H4蛋白對(duì)甘油三酯的形成有重要調(diào)節(jié)作用，而甘油三酯是脂肪的重要組成成分，NR1H4上調(diào)脂蛋白脂肪酶活化輔助因子載脂蛋白C-1I，下調(diào)脂肪酸合成的主要轉(zhuǎn)錄因子留醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白-lc，使有調(diào)節(jié)脂質(zhì)形成的乙酰輔酶A合成酶、脂肪酸合成酶等表達(dá)下降，從而減少脂肪酸，下調(diào)抑制因子脂蛋白C-1II，誘導(dǎo)極低密度脂蛋白受體表達(dá)，使富含甘油三酯的脂蛋白分解。NR1H4基因可誘導(dǎo)原代培養(yǎng)肝細(xì)胞過氧化物酶體增殖物激活受體α和其靶基因丙酮酸脫氫酶激酶4，促進(jìn)脂肪酸氧化。
[0004]NR1H4基因位于人染色體12q23.1，小鼠10號(hào)染色體C2 | 10，遺傳位置為44.98cM,大鼠(Rattus norvegicus)染色體 7ql3,斑馬魚(Danio rerio)18 號(hào)染色體CH211-264E16.3,恒河稱猴(Macaca mulatta)ll 號(hào)染色體,牛(Bos taurus)5 號(hào)染色體,家雞(Gallus gallus) I號(hào)染色體,家豬(Sus Scrofa) 5號(hào)染色體上。
[0005]NR1H4基因在脂肪形成中發(fā)揮重要作用，是膽汁鹽受體，通過調(diào)控靶基因調(diào)節(jié)脂類形成，從而影響豬肌內(nèi)脂肪的沉積，進(jìn)而影響豬肉質(zhì)性狀。但是，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于豬NR1H4基因的研究很少。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克隆豬NR1H4基因cDNA分子，尋找NR1H4基因的突變位點(diǎn)以及基因多態(tài)性的檢測(cè)方法，為豬肉質(zhì)標(biāo)記輔助育種提供一種有用的分子標(biāo)記。
[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種克隆和檢測(cè)豬NR1H4基因的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，為豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇提供有用的分子標(biāo)記。
[0008]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:以人的NR1H4基因序列(GenBank 收錄號(hào)為 NM_001206993)為種子序列，在 GenBank 中利用 BLASTN (Basic LocalAlignment Search Tool Nucleotide),參照其同源性在 80% 以上的豬 EST (ExpressionSequence Tags)設(shè)計(jì)特異引物,利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA End),克隆出豬NR1H4基因cDNA全長(zhǎng)，該豬NR1H4基因的DNA序列如SEQ ID N0:1所示。NR1H4基因的多態(tài)性是利用比較基因組學(xué)方法根據(jù)人的NR1H4基因序列設(shè)計(jì)引物，以豬的基因組DNA為模板擴(kuò)增，擴(kuò)增片段利用測(cè)序篩選SNP，并利用PCR - RFLP進(jìn)行基因分型技術(shù)，發(fā)現(xiàn)第709bp處有一個(gè)A/G的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Mwo I多態(tài)性，并利用該標(biāo)記檢測(cè)了中外豬種的情況。
[0009]試驗(yàn)材料:25日齡沙子嶺豬由湖南省湘潭市沙子嶺豬資源場(chǎng)提供，取背最長(zhǎng)肌-80 °C 保存，5 ' -RACE Version2.0 試劑盒購于 Invitrogen 公司，3 ' -RACESMARTer?RACE cDNAAmplification Kit 試劑盒購于 Clontech 公司。
[0010]總RNA提取與cDNA第I鏈的合成:用SUPERSCRIPT II RT酶和特異性引物GSP-1對(duì)總RNA進(jìn)行基因第一鏈cDNA的合成，使用RNase Mix對(duì)合成的cDNA進(jìn)行去RNA處理，最后對(duì)cDNA進(jìn)行純化。
[0011]引物設(shè)計(jì):據(jù)GenBank人NR1H4基因(登錄號(hào):NM_001206993)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的軟件為Premiere5.0,引物設(shè)計(jì)的原則是特異性引物長(zhǎng)度在23-28個(gè)核苷酸，GC含量在50%-70%，退火溫度在65-70°C，使用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
[0012]編碼序列PCR擴(kuò)增:以合成的豬cDNA為模板，在保守區(qū)設(shè)計(jì)引物經(jīng)過克隆測(cè)序，獲得該基因部分 CDS (coding domain sequence)序列。
[0013]5' -RACE擴(kuò)增:使用TdT酶和dCTP對(duì)純化后的cDNA末端加上多聚C，使用弓丨物GSP5 (Gene-Specific Primers)和試劑盒中的橋連鉚釘引物AUAP (表1)對(duì)已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第一輪擴(kuò)增；使用引物GSP-3和試劑盒里中的橋連通用擴(kuò)增引物AUAP進(jìn)行巢式PCR第二輪擴(kuò)增，將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得684bp的目的序列。
[0014]3' -RACE擴(kuò)增:使用合成的cDNA為模板進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增。將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍，然后用引物GSP3和UPM (Universal Primer A Mix)(表1)進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測(cè)序。
[0015]將擴(kuò)增得到的5' -RACE長(zhǎng)度為684bp、3' -RACE擴(kuò)增得到的長(zhǎng)度420bp和擴(kuò)增的長(zhǎng)度為965bp的編碼序列的序列拼接得NR1H4基因的全長(zhǎng)cDNA序列，從而完成本發(fā)明的NR1H4基因的克隆的內(nèi)容。
[0016]表1本發(fā)明中使用的引物序列
[0017]
【權(quán)利要求】
1.一種豬NR1H4基因序列如序列表SEQ ID NO:1所述；在序列表SEQ ID N0:1的709bp處有1個(gè)G/A的堿基突變，導(dǎo)致PCR-RFLP-Mwo I多態(tài)性。
2.檢測(cè)權(quán)利要求1所述的一種豬NR1H4基因，擴(kuò)增該片段的正向引物為5'-AGA GTGAAT GAC CAC AAG TT-3'，反向引物為 5' -ACT GGA ATT ATC TGC GTA CT-3'。
3.制備如權(quán)利要求1所述的豬NR1H4基因的方法，按照以下步驟: 利用權(quán)利要求2所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用限制性內(nèi)切酶Mwo I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)GG、GA和AA基因型的分布。
4.權(quán)利要求1所述豬NR1H4基因在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898120SQ201410090508
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】馬海明, 楊虎, 蔣雋, 何俊, 賀長(zhǎng)青 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)