豬骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子的克隆及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子活性區(qū)域的分離鑒定和功能驗證。從豬的基因組中克隆了骨骼肌特異表達(dá)基因MyoG上游806bp啟動子，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。結(jié)果表明本發(fā)明全長為806bp的啟動子片段具有獨立的啟動活性兼肌肉組織特異性。利用MyoG活性啟動子序列驅(qū)動外源基因PPARγ的表達(dá)，并可用于制備轉(zhuǎn)基因小鼠。本發(fā)明還公開了所述啟動子片段的制備方法、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)、定量PCR和Western?Blot方法對啟動子活性分析的應(yīng)用。
【專利說明】豬骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子的克隆及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到豬骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子區(qū)域的分離鑒定及功能驗證。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物的生存及生長發(fā)育有賴于基因組內(nèi)成千上萬個基因的表達(dá)以及進(jìn)行正常的調(diào)控作用。經(jīng)過科研人員多年的努力探索，我們現(xiàn)在認(rèn)識到每一個基因的表達(dá)都受到多種不同機制的調(diào)控。而對啟動子的分析可以幫助我們了解真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理里最基本的信息。這些基礎(chǔ)知識也是現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)理論重要的組成部分。其次，因為在基因的轉(zhuǎn)錄激活過程中發(fā)生的一系列級聯(lián)反應(yīng)最終都會作用到啟動子上，都會對啟動子上發(fā)生的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用造成直接或間接的影響。
[0003]啟動子常常被描述為有兩個獨立的部分，即核心啟動子和擴展的啟動子區(qū)域，核心啟動子一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游50bp之內(nèi)，是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成和通用轉(zhuǎn)錄因子聚集的位置。而在擴展的啟動子區(qū)域內(nèi)包含有特異的調(diào)控序列，控制下游基因的時空表達(dá)模式(Butler and Kadonaga 2002)。啟動子分類方法較多,根據(jù)啟動子的功能及作用方式可以分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組織特異性啟動子能夠啟動外源基因僅在受體所需要的部位特異表達(dá)，克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體中非特異、持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費，增加轉(zhuǎn)基因的效果(Smith，Sumazin et al 2007)。
[0004]除了非特異性蛋白在不同的組織中非特異表達(dá)會帶來安全問題和潛在的毒性作用外，由病毒驅(qū)動的啟動子所控制的重組蛋白表達(dá)還會帶來免疫反應(yīng)，而那些以特異性方式表達(dá)的產(chǎn)物只會在特定的組織和特定的細(xì)胞中表達(dá)，不會出現(xiàn)上述問題(Cordier et al2001, Hartigan-O' connor et al 2001, Hauser et al 2000)。組織特異性啟動子通常以特定的組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)、物理信號為基礎(chǔ)，可對外源基因進(jìn)行靶向定位，將基因固定于某一組織或細(xì)胞中表達(dá)，減少了機體能量和物質(zhì)的損耗及對機體代謝活動的影響，同時又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類疾病治療方面的前景尤其可觀。其次，轉(zhuǎn)基因動物育種研究中，通過組織特異性啟動子調(diào)控外源目的基因在靶組織中表達(dá)，能夠有效改善動物的某些性狀，如肌內(nèi)脂肪；或改善動物的消化系統(tǒng)以減少排泄物中的氮磷含量等。鑒于此，組織特異性啟動子在基因工程和轉(zhuǎn)基因育種中越來越受到研究者的青睞。
[0005]肌細(xì)胞生成素(myogenin, MyoG)是生肌決定因子基因家族中唯一的在所有骨骼肌細(xì)胞系均可表達(dá)的基因，其功能不可被其它生肌調(diào)節(jié)因子所代替。肌肉細(xì)胞有自己的內(nèi)在轉(zhuǎn)錄程序建立聯(lián)系，而且這個網(wǎng)絡(luò)在某種程度上是由MRFs、MEF-2所控制的。
[0006]NCBI數(shù)據(jù)庫中已含有人、鼠、豬、雞、斑馬魚等MyoG基因的序列。研究者可以利用數(shù)據(jù)庫獲得MyoG基因的啟動子序列。Anne-Sophie Armand等2008年獲得小鼠MyoG5'-側(cè)翼序列600bp，構(gòu)建含有雙熒光素報告載體，利用C2C12細(xì)胞系，檢測其活性，并在RNA水平以及蛋白質(zhì)水平檢測其基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在分化96h時MyoG啟動子活性達(dá)到最大(Armand et al 2008)。宋興超等克隆甘肅馬鹿MyoG啟動子序列685bp，并與人、豬、小鼠啟動子序列進(jìn)行比對，相似性分別為84.9%、88.1 %和82.6% (宋興超2009)。王秋華等克隆日本和牛MyoG啟動子序列，構(gòu)建一些列啟動子缺失片段，利用牛肌源干細(xì)胞和牛胎兒成纖維細(xì)胞，檢測啟動子活性，確定轉(zhuǎn)錄起始位點上游1039bp的啟動子活性最高(王秋華2012)。劉錚鑄等擴增波爾山羊MyoG基因的5'-側(cè)翼序列969bp，并對其進(jìn)行序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過序列比對，此序列與牛、小鼠、馬鹿和人物種的序列相似性在37.22% -96.85%之間；但與其它物種不同的是，波爾山羊序列MyoG啟動子的GC含量高達(dá)50.6% (劉錚鑄2012)。
[0007]MyoG基因是骨骼肌分化所必需的因子，在肌細(xì)胞分化為肌管的過程中起重要作用。Lucarelli等發(fā)現(xiàn)小鼠MyoG5 '-側(cè)翼區(qū)-1092bp~_134bp中有一段富含胞嘧卩定的序列，這段序列含有CCGG位點，肌肉細(xì)胞分化過程中此位點能夠結(jié)合與分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)啟動子的甲基化模式(Lucarelli et al 2001)。Fuso等發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞分化時,此段序列的甲基化狀態(tài)處于動態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞處于未分化狀態(tài)時，此序列的甲基化約為50%，隨著細(xì)胞分化時間的延長，啟動子序列的甲基化百分?jǐn)?shù)出現(xiàn)先降低后增加的現(xiàn)象(Fuso et al2010)。
[0008]到目前為止，未見到研究豬骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子應(yīng)用的相關(guān)報道。所以 申請人:對此基因進(jìn)行了啟動子的功能研究和應(yīng)用，以期能夠更好地利用該啟動子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于分離克隆豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子區(qū)域的活性片段，并對其進(jìn)行功能驗證，以期獲得此基因的具備較高啟動活性并保持肌肉組織特異性的調(diào)控區(qū)段，為動物基因工程提供可利用的組織特異性啟動子。
[0010]本發(fā)明從大白豬的基因組中分離并鑒定出MyoG基因具有肌肉組織特異性的啟動子。采用在線軟件MEME比對豬、人和小鼠相同區(qū)域序列，確定豬MyoG啟動子的功能區(qū)域位于第一外顯子5'端附近?？寺∝iMyoG基因5'側(cè)翼806bp序列，TESS和TFSEARCH等分析該片段含有啟動子的特征元件TATA box和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如Spl、E-boX、C/EBP、NF-UMyogenin等。構(gòu)建含有MyoG啟動子的pGL3_MyoG報告質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染分化0d、2d、3d、4d、6d的C2C12細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析報告基因螢火蟲熒光素酶的相對活性，從而獲得具有肌肉組織特異性的啟動子，進(jìn)一步構(gòu)建啟動子與豬PPARy基因的重組載體，通過熒光定量PCR和Western Blot檢測PPAR Y的表達(dá)量。將重組載體線性化，顯微注射小鼠受精卵
[0011]本發(fā)明通過以下技術(shù)實現(xiàn):
[0012]本發(fā)明的技術(shù)路線見圖1所示。
[0013]利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)查找豬骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG的上游調(diào)控序列，利用MEME在線軟件比較豬、小鼠、人類三個物種MyoG的調(diào)控序列，根據(jù)MEME分析的結(jié)果以及前人研究，預(yù)測MyoG啟動子的大概區(qū)域。利用TFSEARCH及MethPrimer生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析核心啟動子區(qū)域、順反式作用元件及CpG島分布情況。設(shè)計引物(該引物對的序列見表1所示)，從大白豬的基因組中PCR擴增獲得肌肉組織特異性啟動子， 申請人:將擴增的啟動子片段分別命名MyoG-pro其片段長度分別為806bp，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1。構(gòu)建報告基因LUC融合載體， 申請人:將其分別命名為pGL3-MyoG-pro。瞬時轉(zhuǎn)染分化0d、2d、3d、4d和6d的C2C12、3T3_L1細(xì)胞，雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測MyoG啟動子的活性，不同分化時期的C2C12細(xì)胞中，細(xì)胞分化3d時MyoG啟動子的活性達(dá)到最高，是陰性對照的八倍左右；其次，分化2d時MyoG啟動子活性比分化3d時啟動子活性低，但二者無顯著性差別。此外，MyoG-pro的活性在3T3-L1中幾乎未被檢測到。結(jié)果表明806bp的MyoG-pro片段具備獨立的啟動報告基因表達(dá)的功能并同時保持著肌肉組織的表達(dá)特異性。之后，構(gòu)建與脂肪沉積相關(guān)的豬PPAR Y基因的重組表達(dá)載體， 申請人:將構(gòu)建好的載體命名為pGL3-MyoG-PPAR Y。將pGL3-MyoG_PPAR Y轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，熒光定量PCR和Western Blot檢測豬PPAR Y基因的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNA水平，MyoG啟動子能夠提高02(:12細(xì)胞中？?41?￥基因的表達(dá)量是空白對照的2.17±0.14倍左右，蛋白質(zhì)水平，PPARy基因的表達(dá)量與空白對照有顯著性差異。證明分離出的啟動子MyoG-pix)兼?zhèn)鋯油还馑孛笀蟾婊蚝椭鞠嚓P(guān)基因的能力。
[0014]本發(fā)明的具體步驟如下:
[0015]基于進(jìn)化印記理論，利用軟件MEME比對豬、小鼠、人類三個物種MyoG基因的mRNA5/端上游調(diào)控序列。MEME分析發(fā)現(xiàn)，MyoG調(diào)控序列在不同的物種間存在著相同的規(guī)律。生物的進(jìn)化歷程必定會在分子序列上留下相應(yīng)的進(jìn)化印記，即家族特異模塊和直系同源簇特異模塊組成的功能特異模塊。因此，推測豬MyoG啟動子的功能區(qū)域應(yīng)該位于Motif富集的片段內(nèi)。通過美國國立生物研究所網(wǎng)站NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找豬MyoG基因，擴增806bp的啟動子序列(如SEQ ID NO:1所示)，以此序列作為研究對象。再根據(jù)TFSEARCH及MethPrimer預(yù)測順反式作用元件及CpG島分布情況。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計引物，以約克夏豬基因組DNA為模板，PCR擴增MyoG啟動子區(qū)域，并連接到pGL3-Basic報告基因LUC上游多克隆位點(載體圖及多克隆位點等信息見圖2)處，構(gòu)建得到融合表達(dá)載體(圖3)。通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將融合表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)入不同分化時期的小成纖維細(xì)胞C2C12(簡稱C2C12)細(xì)胞和小鼠前脂肪細(xì)胞系3T3-L1細(xì)胞(簡稱3T3-L1)，同時轉(zhuǎn)入海腎熒光素酶報告基因pRL-TK為內(nèi)參質(zhì)粒。本發(fā)明設(shè)置陰性對照pGL3-Basic (圖2),陽性對照pGL3_control。轉(zhuǎn)染48h后通過雙突光素酶報告系統(tǒng)對報告基因LUC進(jìn)行定量分析，進(jìn)而分析MyoG啟動子在不同來源細(xì)胞中的啟動功能。進(jìn)一步，將豬PPAR Y的CDS區(qū)域替換載體的LUC基因，連接在MyoG啟動子的下游，構(gòu)建重組表達(dá)載體，豬PPAR Y的⑶S區(qū)域序列如SEQ IDNO:2所示。重組載體轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞48h后，提取細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)，通過熒光定量PCR和Western Blot檢測PPAR Y在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量，以此來證明骨骼肌特異性的啟動子不僅能夠啟動報告基因表達(dá)，同時也具備啟動脂肪相關(guān)基因表達(dá)的能力。之后將重組載體線性化，顯微注射小鼠受精卵，制作轉(zhuǎn)基因小鼠，PCR鑒定出四只陽性小鼠(圖)。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0017]1.本發(fā)明詳盡的驗證了豬MyoG啟動子不同來源細(xì)胞中啟動基因表達(dá)的能力，為MyoG基因的表達(dá)調(diào)控帶來了更深層次的認(rèn)知。
[0018]2.本發(fā)明鑒定了肌肉組織特異表達(dá)的啟動子豬MyoG的活性區(qū)段，為基因工程和分子育種提供了新的特異表達(dá)的啟動子資源。
[0019]3.本發(fā)明利用PCR技術(shù)鑒定了四只轉(zhuǎn)基因小鼠，為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬模型提供一定的
理論基礎(chǔ)。[0020]更詳細(xì)的技術(shù)方案參見《【具體實施方式】》的內(nèi)容。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明克隆的豬骨骼肌特異表達(dá)基因MyoG的上游調(diào)控核苷酸序列，擬確定為啟動子序列MyoG-pix)，長度為806bp。
[0022]序列表SEQ ID NO:2是本發(fā)明克隆的豬PPAR Y基因⑶S序列(豬PPAR Y基因的Genebank登錄號為397671)，長度為1515bp，編碼504個氨基酸。
[0023]序列表SEQ ID NO:3是豬PPAR Y基因的蛋白質(zhì)序列。
[0024]圖1:本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。 [0025]圖2:構(gòu)建好的以pGL3-basic為骨架的融合載體結(jié)構(gòu)圖。其中:位點5_53為多克隆位點，用于插入目的序列；Amp為氨節(jié)抗性篩選基因；luc+為報告基因螢火蟲熒光素酶。
[0026]圖3:pGL3-MyoG載體的構(gòu)建圖。在多克隆位點插入MyoG啟動子序列。
[0027]圖4:融合載體的Nhe I和Xho I雙酶切鑒定圖。M表示DL marker 2000，上面較大的條帶為載體條帶，下端為啟動子條帶。
[0028]圖5:骨骼肌特異表達(dá)基因MyoG啟動子驅(qū)動LUC基因在不同來源的細(xì)胞中的表達(dá)情況。其中:圖5A為MyoG啟動子在不同分化時期C2C12細(xì)胞中的活性分析；圖5B為MyoG啟動子在3T3-L1細(xì)胞中的活性分析，pGL3-Basic質(zhì)粒為陰性對照，pGL3-C0ntix)l質(zhì)粒為陽性對照。
[0029]圖6:為pcDNA3.1-PPAR Y質(zhì)粒圖譜和豬PPARy基因PCR擴增圖。其中:圖6A為pcDNA3.1-PPAR Y質(zhì)粒圖譜；圖6B為豬PPAR Y基因PCR擴增圖。
[0030]圖1:重組表達(dá)質(zhì)粒pGL3-MyoG_PPAR Y的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031]圖8:重組質(zhì)粒酶切鑒定圖。其中:圖8A為重組表達(dá)質(zhì)粒pGL3-MyoG_PPAR Y的酶切鑒定圖；圖8B為陰性對照質(zhì)粒PGL3-PPARY的酶切鑒定圖，圖中標(biāo)記說明:M表示DLmarker 10000。
[0032]圖9:利用定量PCR檢測PPARy基因在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量以及利用WesternBlot測定PPAR Y蛋白質(zhì)在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量。其中:圖94為？?八1?￥基因在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量；圖9B為PPAR Y蛋白質(zhì)在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量。
[0033]圖10:重組表達(dá)質(zhì)粒pGL3-MyoG_PPAR Y線性化圖。圖中標(biāo)記說明:M表示DLmarker 10000，2612bp片段包含MyoG啟動子，PPARy基因的CDS區(qū)域，F(xiàn)lag標(biāo)簽以及SV401ate poly (A) signal。
[0034]圖11:轉(zhuǎn)基因小鼠以及陽性小鼠PCR鑒定結(jié)果。其中:圖1lA為四只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(從上至下和從左至右依次編號為a、b、c、d);圖1lB為陽性小鼠PCR鑒定結(jié)果，瓊脂糖凝膠電泳圖中的標(biāo)記說明:M表示DL10000 ;泳道1:pGL3-MyoG-PPAR Y質(zhì)粒；泳道2-5:M1、M2、M3、M4轉(zhuǎn)基因小鼠;泳道6:野生型小鼠;泳道7:水。
【具體實施方式】
[0035]實施例1:豬的骨骼肌特異性表達(dá)基因MyoG啟動子片段及相應(yīng)獲得
[0036]基于進(jìn)化印記理論，利用軟件MEME比對豬、小鼠、人類三個物種MyoG基因的mRNA5/端上游調(diào)控序列。MEME分析發(fā)現(xiàn)，MyoG調(diào)控序列在不同的物種間存在著相同的規(guī)律。生物的進(jìn)化歷程必定會在分子序列上留下相應(yīng)的進(jìn)化印記，即家族特異模塊和直系同源簇特異模塊組成的功能特異模塊。因此，推測豬MyoG啟動子的功能區(qū)域應(yīng)該位于Motif富集的片段內(nèi)。通過美國國立生物研究所網(wǎng)站NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)上查找豬MyoG基因(Gene ID:497618)，擴增806bp的啟動子序列，如SEQ IDNO:1所示，以此序列作為研究對象。再根據(jù)TFSEARCH及MethPrimer預(yù)測順反式作用元件及CpG島分布情況。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的結(jié)果設(shè)計引物(引物序列如表1所示)，以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴增MyoG啟動子區(qū)域。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖電泳檢測及Omega公司回收試劑盒純化回收，放至_20°C備用。
[0037]表1 MyoG啟動子片段的擴增引物(引物的下劃線部分為酶切位點)
[0038]
【權(quán)利要求】
1.調(diào)控豬骨骼肌基因MyoG的特異性表達(dá)的啟動子，其核苷酸序列如序列表SEQID NO:I所示。
2.權(quán)利要求 1所述的啟動子在豬骨骼肌組織表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/85GK104017807SQ201410263464
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月13日
【發(fā)明者】蔣思文, 李倩倩, 彭健, 柴進(jìn), 李鳳娥 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)