專利名稱：一種重組人促紅素分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白純化領域，尤其涉及一種采用陰離子交換層析技術對重組人促紅素進行分離純化的方法。
背景技術：
促紅素(Erythropoietin，ΕΡ0)最早發(fā)現(xiàn)于1906年，是一種糖蛋白，屬唾液糖蛋 白激素，蛋白質部分由166個氨基酸組成，分子量為34KD。其編碼基因是單拷貝基因，定位 于人的7號染色體長臂21區(qū)。依據其糖型結構的差異可分為α、β兩種，α型含34%的 碳水化合物，β型含26%的碳水化合物，兩種類型在生物學特性、抗原性等效果上均相同。 促紅素的生理作用是刺激骨髓中血紅蛋白或紅細胞的形成，主要由腎臟生成并通過循環(huán)血 進入骨髓而發(fā)揮作用。當人的腎功能發(fā)生嚴重損害時，如在急、慢性腎衰竭或腎切除的情況 下，EPO的產生減少，出現(xiàn)貧血。因此，EPO對絕大多數腎性貧血患者均有很好的療效。1985年，人EPO基因克隆和表達的成功使重組人促紅素的制備成為現(xiàn)實，重組人 促紅素(rhEPO)采用反轉錄PCR技術克隆人EPO-cDNA，將其插入到真核細胞表達載體中，構 建重組表達質粒，并轉化到CHO細胞中，篩選出高效穩(wěn)定表達人EPO的工程細胞株。培養(yǎng)該 工程細胞，收獲上清，進行rhEPO蛋白分離純化。rhEPO具有與天然的人促紅素相同的結構 及生理作用，是治療腎性貧血的首選藥物，還可用于外科圍手術期的紅細胞動員，治療癌癥 及癌癥放療化療引起的貧血，治療艾滋病伴發(fā)貧血癥等，rhEPO是目前為止人類開發(fā)最成功 的基因工程藥物。隨著對rhEPO臨床應用的深入研究，發(fā)現(xiàn)rhEPO在治療婦科貧血、孕產婦 貧血、類風濕性關節(jié)炎所致的貧血等方面都有較好的效果。目前已有重組人促紅素分離純化方法具有以下缺點操作繁瑣，每次處理量不高， 工藝放大難度大，不適合大規(guī)模生產，且最終rhEPO純度僅能達到95%以上，唾液酸含量為 9. Omol/molEPO以上，體內生物學比活性為1. 2X105IU/mg。亟需建立一種適合大規(guī)模生產且生產成本低的重組人促紅素(rhEPO)分離純化 方法，以滿足大量患者的需求。

發(fā)明內容
為解決上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種工藝穩(wěn)定、容易放大、適合大規(guī) 模生產且生產成本低的重組人促紅素分離純化方法。為達到上述目的，本發(fā)明的技術方案為一種重組人促紅素分離純化方法，包括以下步驟1)樣品進行藍膠層析；2)所述藍膠層析產物進行超濾濃縮；3)所述超濾濃縮產物進行離子交換層析I，用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液平衡柱床，上樣后先用PH6. 5 7. 5，含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl緩沖液洗脫；4)所述離子交換層析I產物進行C4反相層析；5)所述C4反向層析產物進行離子交換層析II，用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡，上樣后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨 酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗 10 15 個柱體積，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；6)所述離子交換層析II產物進行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。所述步驟1)中樣品為灌流培養(yǎng)細胞收集液；所述步驟1)具體為用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 3mo 1/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡 液淋洗至基線，再用ρΗ6· 5 7. 5、含1. 0 1. 4mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液 洗脫，收集rhEPO峰。優(yōu)選地，步驟1)具體為用 ρΗ7· 0、含 0. 2mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 緩沖 液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡液淋洗至基線， 再用 pH7. 0、含 1. 3mol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 rhEPO 峰。所述步驟2)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進行超濾濃 縮，濃縮至電導率和緩沖液電導率相差100 200μ S/cm。優(yōu)選地，步驟2)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進行超濾濃縮，濃 縮至電導率和緩沖液電導率相差180 μ S/cm。所述步驟3)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上 樣后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫至基 線，再用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I洗脫峰。優(yōu)選地，步驟3)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后 先用ρΗ7· 0、含0. 04mol/L NaCl的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫至基線，再用ρΗ7· 0、含 0. 13mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I 洗脫峰。所述步驟4)具體為用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩 沖液平衡C4柱，上樣后，先用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/L Tris-HCl緩沖 液淋洗至基線，再用PH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫， 收集洗脫峰。優(yōu)選地，步驟4)具體為用pH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩沖液平衡C4 柱，上樣后，先用PH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗至基線，再用pH7. 0、 含50%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫峰。 所述步驟5)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上 樣后先用PH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗 脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/LTris-HCl緩沖液淋洗10 15個柱體積，最后用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE II 洗脫峰。
優(yōu)選地，步驟5)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣 后先用PH4. 0、含5mol/L尿素、1. 5mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至 基線后再用 pH7. 0的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗15個柱體積，最后用ρΗ7· O、含0. 3mol/L NaCl的 10mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集DEAE II洗脫峰；所述步驟6)具體為用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞 酸_枸櫞酸鈉緩沖液平衡S-200柱，上樣并洗脫，同時用0. 22 μ m過濾器過濾并無菌收集， 收集峰即為重組人促紅素。優(yōu)選地，步驟6)具體為用pH7. 0、含120mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞酸-枸櫞 酸鈉緩沖液平衡S-200柱，上樣并洗脫，同時用0. 22 μ m過濾器過濾并無菌收集，收集峰即 為重組人促紅素。本發(fā)明中采用兩次陰離子交換層析，第二次陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose Fast Flow層析)的使用，不但可以根據生產需要進行不同程度的放大，解決生產規(guī)模問 題，而且在去除乙醇的同時對rhEPO純度和體內生物學比活性起到進一步提高的作用，該 步層析可以將唾液酸含量低的rhEPO去除，提高產品中唾液酸含量高的rhEPO蛋白的比例。 采用本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法，純化得到的rhEPO純度可達99%以上，唾液酸含 量達9. 5mOl/mOlEP0以上，體內生物學比活性達1.4X105IU/mg以上。本發(fā)明在已有工藝 方法基礎上進行改進，不但解決了生產規(guī)模問題，且提高了 rhEPO產品質量。


圖1是本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法工藝流程圖。
具體實施例方式下面結合說明書附圖對本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法做進一步詳細說明。材料準備通過細胞培養(yǎng)罐連續(xù)灌流培養(yǎng)含人促紅素基因的重組工程細胞株獲得 含重組人促紅素(rhEPO)的無血清培養(yǎng)液。從上述培養(yǎng)液中分離純化rhEPO的具體步驟1.藍膠層析(Blue Sepharose 6 Fast Flow 層析)1. 1 平衡用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液平衡 Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，直至流出液pH為7· 0。1. 2上樣以40ml/min流速，將過濾后的細胞收集液上樣。1. 3 淋洗用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的
流速淋洗至基線。1. 4 洗脫用 1. 3mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速洗脫并收集EPO峰。2.超濾濃縮將藍膠洗脫液用lOmmol/L Tris-HCl，pH7. 0緩沖液進行超濾濃縮，直到濃縮液電 導率和緩沖液電導率相差180 μ S/cm左右。3.離子交換層析 I (DEAE-Sepharose Fast Flow 層析)3. 1平衡以50mi/min的流速用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液平衡柱床，直至流出液pH為7.0。

3. 2上樣以40ml/min的流速將超濾得到的濃縮液上樣于DEAE-S印harose Fast Flow層析柱。3. 3 淋洗用 0. 04mol/L NaCl-lOmmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速淋洗，直至待檢測峰下降至基線。3. 4 洗脫用 0. 13mol/L NaCl-IOmmo 1/LTris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速洗脫，洗脫收集液為DEAE I收集液，收集于血清瓶中。4. C4反相層析4. 1 平衡用 8% 乙醇 /lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)緩沖液平衡 VydacC4 柱，平衡流 速為40ml/min，淋洗5倍柱體積。4. 2上樣以40ml/min的流速將DEAE I收集液上樣于Vydac C4柱。4. 3淋洗上樣完畢后，用8%乙醇/lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液淋洗至基線。4. 4 洗脫用 50% 乙醇/10mmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液以 40ml/min 的流速洗 脫，從洗脫峰出現(xiàn)時開始收集至洗脫峰結束為止，收集至5L血清瓶中。5. m^^^M^fr II (DEAE-Sepharose Fast Flow 層析)5. 1平衡用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液以40ml/min的流速平衡至流出 液PH為7.0。5. 2上樣以40ml/min的流速將C4反相層析收集液上樣于DEAE-S印harose Fast Flow層析柱。5. 3淋洗先用5mol/L尿素/1. 5mmol/L甘氨酸(pH4. 0)的緩沖液以40ml/min的 流速淋洗至紫外檢測值降低至基線，再用lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)緩沖液以40ml/min的 流速淋洗15個柱體積。5. 4 洗脫用含 0. 3mol/L NaCl/10mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)的緩沖液以 40ml/min 的流速洗脫，從洗脫峰紫外檢測值上升時開始收集，至降低至基線結束收集，收集DEAE II 洗脫液于500ml鹽水瓶中。此收集液唾液酸含量應不小于9. 5mOl/mOlEP0。6. S-200分子篩層析6. 1平衡用20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 12ml/min的流速平衡2倍柱體積。6. 2上樣上樣流速為12ml/min，上樣量應不超過柱體積的1/10。6. 3洗脫用20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 12ml/min的流速洗脫。從洗脫峰開始出現(xiàn)收集至檢測峰下降至基線時停止收集。用一次性 過濾器，無菌過濾EPO產品至無菌鹽水瓶中，即為最終純化的重組人促紅素(rhEPO)產品原 液。分離純化后的重組人促紅素(rhEPO)產品經SDS-PAGE和HPLC檢測分析，純度達 99.0%以上，體內和體外生物比活性達1.5X105IU/mg以上，唾液酸含量不低于9. 5mol/mol EPO0其它檢測項目均符合中國藥典現(xiàn)行版規(guī)定。本發(fā)明重組人促紅素(rhEPO)的分離純化方法具有以下優(yōu)點1)純化過程中介質對蛋白的載量大，流速快，操作時間短；不但可大量處理樣品，還可根據生產需要進行不同程度的放大，解決生產規(guī)模問題。2)純化過程重復性好，且反復再生利用過程簡單。3)純化過程操作簡便，不需特殊的試劑。 4)由該方法獲得的rhEPO純度高，由已有工藝產品純度的95%以上提高到99.0% 以上，提高4.0%以上。5)由該方法獲得的rhEPO活性收率高由已有工藝的10%提高至15%，提高了 50%。6)由該方法獲得的rhEPO中唾液酸含量由已有工藝的9.0mOl/mOlEP0左右提高至 9. 5mol/mol EPO以上，提高了 5%以上。7)由該方法獲得的rhEPO體內生物學比活性由1. 2 X 105IU/mg提高至Ij 1.4X105IU/mg以上，提高約17%以上。
權利要求
1.一種重組人促紅素分離純化方法，包括以下步驟1)對樣品進行藍膠層析；2)對所述藍膠層析產物進行超濾濃縮；3)對所述超濾濃縮產物進行離子交換層析I，用pH6.5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩 沖液平衡柱床，上樣后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 PH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；4)對所述離子交換層析I產物進行C4反相層析；5)對所述C4反向層析產物進行離子交換層析II，用pH6.5 7.5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L 甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋 洗 10 15 個柱體積，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；6)對所述離子交換層析II產物進行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。
2.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟1)中的所述 樣品為灌流培養(yǎng)細胞收集液。
3.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟1)具體為 用 ρΗ6· 5 7. 5、含0. 1 0.3mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 緩沖液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡液淋洗至基線，再用pH6. 5 7. 5、含 1. 0 1. 4mol/LNaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 rhEPO 峰。
4.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟2)具體為 用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進行超濾濃縮，濃縮至濃縮液電導率和緩沖 液電導率相差100 200 μ S/cm。
5.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟3)具體為，用 ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用ρΗ6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I 洗脫峰。
6.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟4)具體為 用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩沖液平衡C4柱，上樣后，先用 pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/LTris-HCl緩沖液淋洗至基線，再用pH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
7.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟5)具體為用ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用ρΗ3· 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗10 15個柱體積，最后用pH6. 5 7. 5、含0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE II 洗脫峰。
8.根據權利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，所述步驟6)具體 為用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液平衡 S-200柱，上樣并洗脫，同時用0. 22 μ m過濾器過濾并無菌收集，收集峰即為重組人促紅素。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白純化領域，尤其涉及一種采用陰離子交換層析技術對重組人促紅素進行分離純化的方法，包括以下步驟1)樣品進行藍膠層析；2)藍膠層析產物進行超濾濃縮；3)超濾濃縮產物進行離子交換層析I；4)離子交換層析I產物進行C4反相層析；5)C4反向層析產物進行離子交換層析II；6)離子交換層析II產物進行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。采用本發(fā)明所述方法，純化得到的rhEPO純度可達99％以上，唾液酸含量達9.5mol/molEPO以上，體內生物學比活性達1.4×105IU/mg以上。本發(fā)明在已有工藝方法基礎上進行改進，不但解決了生產規(guī)模問題，且提高了rhEPO產品質量。
文檔編號C07K1/16GK102040659SQ20091011059
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月19日 優(yōu)先權日2009年10月19日
發(fā)明者于玉根, 張翼翔, 陳紅霞 申請人:深圳新鵬生物工程有限公司