專利名稱：馬力克氏病(mdv)－感染細胞上表達的宿主編碼蛋白及其抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼與腫瘤特別是禽腫瘤尤其是與致癌病毒如馬力克氏病病毒相關的禽腫瘤有關的抗原的核酸和氨基酸序列。本發(fā)明還涉及整合了上述序列的表達載體以及將這些載體和抗原在醫(yī)藥，特別是腫瘤的治療和預防方面的用途。
馬力克氏病病毒(MDV)是一種高度細胞相關的禽α皰疹病毒，它可產(chǎn)生一種淋巴增生疾病，即馬力克氏病(MD)，這種病的表現(xiàn)形式是在易感禽類的內(nèi)臟組織中產(chǎn)生神經(jīng)病變和/或淋巴瘤[Payne，L.N.綜述(編輯)，《馬力克氏病》(1985)，Martinus Nijhoff Publishing，Boston]。MD對全世界的禽工業(yè)有重要的經(jīng)濟意義。MDV的菌株被分為3個血清型。1型病毒包括致癌菌株和它們的減毒株，不同的1型病毒的致病型各不相同，從僅在易感禽類中產(chǎn)生MD的溫和致癌型病毒，直到能在已經(jīng)免疫的禽類中產(chǎn)生MD的高致癌型(高毒性+)。2型MDV是感染性的但不致癌的天然菌株。血清型3型病毒包括密切相關的火雞皰疹病毒(HVT)，這種病毒在火雞和雞中都沒有致病性。目前，基于所有三種血清型病毒的疫苗都可以從商業(yè)途徑獲得，它們可單獨或以不同方式組合使用。幾乎所有的用于商業(yè)生產(chǎn)的家禽都接種了疫苗，但持續(xù)有臨床疾病爆發(fā)的報道，并且發(fā)生率和嚴重性都在提高，因為MDV的高毒性致病型不斷出現(xiàn)[Witter，R.L.(1997)《禽類研究》41149-163]。在MD的爆發(fā)特別嚴重的地區(qū)，家禽生產(chǎn)者采用的解決方法是轉而使用更具侵襲力的疫苗，并求助于使用聯(lián)合疫苗(雙價或三價)來提高保護性。但疫苗生產(chǎn)者正在接受這樣一種觀點，即使用傳統(tǒng)的MD疫苗將無法持續(xù)地控制MD。
本發(fā)明試圖提供對腫瘤的鑒定、預防或治療有用的方法和試劑。
在第一個方面，本發(fā)明提供一種純化的多肽，該多肽能被雜交瘤AV37分泌的單克隆抗體識別，其中該雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約于1998年3月3日保藏在歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)，Centre forApplied Microbiology & Research，Salisbury，Wiltshire SP4OJG，UK，保藏號為98030304。
用于此處，“純化”的意思是，多肽不含它在自然界被發(fā)現(xiàn)時的一些生物物質，優(yōu)選是多數(shù)生物物質，換而言之，多肽不以它以前的存在形式存在。因此，本發(fā)明的多肽包括，諸如一種組合物中的多肽，該組合物含有一種可藥用載劑或賦形劑、或一種佐劑。
多肽優(yōu)選是具有示于圖5(SEQ ID NO.2)的序列的AV37多肽抗原以及該多肽的變異體和片段。
“片段”和“變異體”是指那些可用于制備能特異性結合所說的多肽或其突變體形式的抗體但缺少天然多肽的功能的多肽。這種變異體和片段通常包括至少一個含有至少5個連續(xù)氨基酸的區(qū)域，該區(qū)域與所說多肽的最同源的5個或更多的氨基酸區(qū)域具有至少90％的同源性。片段小于100％的整個多肽。例如，作為示于圖5(SEQ ID NO.2)的AV37多肽的一個片段，氨基酸可制備成一個具有AV37多肽的序列NH2-CDTLKNWFYDETLGRC-COOH(SEQ ID NO.3)的合成多肽。據(jù)信該序列位于蛋白結構的外部，因而可以激發(fā)一種抗體應答。
示于圖5(SEQ ID NO.2)的氨基酸也可分別制備成分別具有AV37多肽的序列NH2-DVMVPVEEEGKEFHHPTTATEK-COOH(SEQ ID NO.4)(C末端肽)和NH2-QPPFTSSHSCDTLKNWFYDETL-COOH(SEQ ID NO.5)(N末端肽)的合成肽。后面的序列來自C和N末端，這些肽已知是制備抗該肽抗體的優(yōu)秀候選肽，即用作肽疫苗，因為它們比固定在蛋白三維結構中的肽具有更好的移動性(柔性)。更高柔性的結果是，肽的某些組成單位更容易采取天然構象，從而使針對它們產(chǎn)生的抗體更能識別天然抗原。
本領域的技術人員應當理解，本發(fā)明的多肽可通過已知的多肽修飾技術進行修飾。這些技術包括1981年11月24日授予Stevens的美國專利No 4,302,386中公開的技術，該專利在此引入作為參考。這種修飾可增加抗原的免疫原性，或者它們可對這樣的免疫原性沒有影響。例如，少數(shù)氨基酸可被改變。此外，本發(fā)明的抗原可含有一個或多個對其免疫原性不是必需的氨基酸序列。不想要的序列可通過本領域熟知的技術除去。例如，這些序列可使用酶如酪蛋白酶或木瓜蛋白酶或有關的蛋白水解酶通過限制性蛋白水解消化來除去。
此外，相當于多肽的抗原性部分的小多肽可通過本領域熟知的方法化學合成。這包括包括1981年12月22日授予Goldberg的美國專利No 4,290,944中公開的方法，該專利在此引入作為參考。
因此，本發(fā)明的多肽包括一類修飾的多肽，包括合成來源的多肽或原始多肽的片段，它們都具有起始、結構和免疫原性的共同元件，并都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
多肽也可通過固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式進行合成，如Lu等(1981)《J.Org.Chem》463433及其參考文獻的公開。N-氨基基團的臨時保護由9-芴甲氧羰基(Fmoc)基團來提供。這種高堿不穩(wěn)定性保護基團的重復切割在N、N-二甲基甲酰胺中使用20％的哌啶來進行。側鏈功能可以它們的丁酯(絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸時)、丁酯(谷氨酸和天冬氨酸時)、丁基羰衍生物(賴氨酸和組氨酸時)、三甲苯基衍生物(半胱氨酸時)和4-甲氧-2、3、6-三甲苯砜衍生物(精氨酸時)形式進行保護。當谷氨酰胺或天冬酰胺為C末端殘基時，使用4、4’-二甲氧苯甲基基團保護側鏈氨基功能。固相支持以聚二甲基丙烯酰胺多聚體為基礎，后者由三種單體---二甲基丙烯酰胺(骨架單體)、雙丙烯酰胺二胺(交聯(lián)劑)和丙烯基肌氨酸甲酯(功能試劑)組成。使用的肽-樹脂連接試劑是酸不穩(wěn)定的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物都以其同型酸酐衍生物的形式加入，除了谷氨酰胺或天冬酰胺，它們使用一種可逆的N，N-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導的偶聯(lián)方法。所有的偶聯(lián)和脫保護反應都使用茚三酮、三硝基苯磺酸或同位素檢測試驗進行監(jiān)測。合成結束后，用含有50％的清除劑的95％三氟乙酸處理，將肽從樹脂支持物上切下，同時除去側鏈保護基團。通常使用的清除劑為乙二醇、酚、苯甲醚和水。精確的選擇依賴于所合成的肽的氨基酸組成。三氟乙酸通過真空揮發(fā)除去，隨后用二乙酯研制，提供粗制的肽。任何存在的清除劑都通過一個簡單的抽提過程除去，該過程通過液相凍干提供不含清除劑的初制肽。肽合成的試劑一般從Calbiochem-Novabiochem(UK)Ltd，Nottingham NG7 2QJ，UK獲得。純化可通過諸如分子大小排阻色譜、離子交換色譜和(主要)反相高效液相色譜技術的任何一種或其組合來進行。肽的分析可使用薄層色譜、反相高效液相色譜、酸水解后的氨基酸分析以及通過高速原子轟擊(FAB)質譜分析來進行。
可與AV37單克隆抗體結合的本發(fā)明的合適肽配體可使用本領域熟知的方法來鑒定。
一種方法由Scott和Smith(1990)《科學》249386-390和Cwirla等(1990)《美國科學院院刊》876378-6382公開，它涉及絲狀噬菌體如M13或fd的大文庫的篩選，這種文庫的每一成員都有一個不同的與噬菌體表面上的蛋白融合的肽。能夠與AV37單克隆抗體結合的文庫成員使用一種反復結合方法進行篩選，一旦純化了能夠最緊密結合的噬菌體，肽配體的序列可簡單地通過對編碼表面融合蛋白的DNA進行測序來測定。另一種可以使用的方法是NovaTope(TM)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可從Novagen，Inc.，597 Science Drive，Madison，WI53711購買。該方法的基礎是制備細菌克隆的文庫，每個細菌克隆都穩(wěn)定表達來自一種候選蛋白的小肽，所說的候選蛋白中被認為有配體存在。文庫用標準的呈現(xiàn)方法進行篩選，使用抗體或其他結合試劑作為探針。陽性克隆可直接通過DNA測序分析來測定配體的精確氨基酸序列。
進一步的方法也可用來鑒定肽配體，如使用Lam等(1991)《自然》35482-84公開的微珠結合的單個種類的肽文庫、Houghten等(1991)《自然》35484-86公開的合成肽組合文庫或Pirrung等在美國專利5143854中公開的固相支持物上的單個合成肽序列的基質。
能夠結合AV37多肽和其片段和變異體的單克隆抗體可使用標準的單克隆抗體技術制備?？乖Y合部分可以是一種抗體的一部分(如Fab片段)或一種合成的抗體片段(如一種單鏈Fv片段[ScFv])。用于選擇抗原的合適單克隆抗體可通過已知技術制備，例如在《單克隆抗體技術手冊》，H Zola(CRC Press，1988)和《單克隆雜交瘤抗體技術和應用》，J G R Hurrel(CRC Press，1982)中公開的技術。
嵌合抗體已由Neuberger等(1988，第8屆國際生物技術大會，2部分，792-799)討論。
一種或多種氨基酸殘基在肽合成前或合成后被化學修飾的肽可用來提供該肽的功能，即在體內(nèi)產(chǎn)生特異性抗體的能力基本上保持不變。這種修飾包括與酸或堿形成鹽，尤其是與生理上可接受的有機或無機的酸或堿，形成末端羧基基團的酯或酰胺，并結合上氨基酸保護基團如N-叔丁氧羰基。這種修飾可保護肽不在體內(nèi)代謝。肽可以單拷貝或多拷貝如串聯(lián)重復的形式存在。這種串聯(lián)或多拷貝重復可使它們具有有效的抗原性，而避免使用一種載體。肽優(yōu)選形成一種環(huán)即N末端和C末端連接在一起、或在一個末端添加一個或多個半胱氨酸以增加抗原性和/或形成二硫鍵。如果肽與一種載體優(yōu)選是一種多肽共價結合，其排列方式優(yōu)選使本發(fā)明的肽形成一個環(huán)。
根據(jù)當前的免疫學理論，載體的功能應是存在于任何免疫原性制劑中以刺激免疫系統(tǒng)或增強免疫系統(tǒng)的刺激。據(jù)認為最佳載體含有(或與抗原一起產(chǎn)生)一種T細胞表位。肽可與一種單獨的載體如血清白蛋白、肌紅蛋白、細菌類毒素和匙孔藍蛋白通過諸如交聯(lián)方法連接在一起。更近一些時候發(fā)展起來的能夠誘導免疫應答的T細胞輔助的載體包括乙型肝炎B核心抗原(也稱為核衣殼蛋白)、推定的T細胞表位如Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cys、β-半乳糖苷酶和白介-1的163-171肽。后一化合物可被認為是一種載體或一種佐劑或兩者。此外，本發(fā)明的同一種或不同的多肽的幾個拷貝可相互交聯(lián)，在這種情況下就沒有單獨的載體，但載體的功能可通過這種交聯(lián)來提供。合適的交聯(lián)試劑包括列于Sigma和Pierce目錄的試劑，例如戊二醛、碳二亞胺和琥珀酰亞胺-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧化物，后一試劑利用C末端半胱氨酸殘基的-SH基團(如果存在的話)。
如果多肽是通過在一種合適宿主中表達一種合適的核苷酸序列制備的，那就優(yōu)選以融合產(chǎn)物的形式表達該肽，即與一種作為載體的多肽序列融合表達。Kabigen的“Ecosec”是這種安排的一個例子。
在第二個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多肽在制備醫(yī)藥用組合物中的用途。具體地說，用于生產(chǎn)疫苗，這種疫苗用于治療或預防腫瘤，優(yōu)選是禽類腫瘤，尤其是與致癌禽類病毒如MDV、ALV以及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒相關的禽類腫瘤。
優(yōu)選進行受體的主動免疫。在這種方式中，一種或多種AV37多肽/蛋白在一種含有合適的佐劑和載體的免疫原性制劑中制備，并通過已知途徑給藥于受體。在禽類中，受精卵的卵內(nèi)注射是一種方便的給藥模式。合適的佐劑包括福氏完全或不完全佐劑、胞壁酰二肽、EP109 942、EP 180 564和EP 231 039的“Iscoms”、氫氧化鋁、皂苷、DEAE-葡聚糖、中性油(例如miglyol)、植物油(如花生油)、脂質體、Pluronic多元醇或Ribi佐劑系統(tǒng)(見諸如GB-A-2 189 141)?！癙luronic”是一種注冊商標。
為提供更好的免疫效果，優(yōu)選使用在不是將要處理的物種中制備的AV37多肽。另一種多肽可用來代替AV37多肽全分子，來在病人中產(chǎn)生抑制性抗體。這樣的其他多肽包括AV37蛋白的片段和類似物。這樣的多肽可按照上面的介紹進行篩選，來保證它們能夠在受體中產(chǎn)生抑制性抗體。
本發(fā)明的第三個方面，提供一種示于圖5(SEQ ID No.1)的分離AV37基因及其變異體用于此處，“分離”一詞的意思是，該基因從它被發(fā)現(xiàn)的基因組的至少大部分中分離，換而言之，該基因不是以它以前存在的形式存在。因此，例如，本發(fā)明的基因包括這樣的基因，它已被克隆進一種細菌載體例如質粒、或一種病毒載體如噬菌體，只要這樣的克隆已從由有關基因組的DNA文庫組成的克隆中分離。
“基因”可包含通?？刂破浔磉_的啟動子和/或其他表達-調(diào)節(jié)序列，它可包含內(nèi)含子，或者它可僅由編碼序列組成，例如cDNA序列。
基因的“變異體”是這樣的物質，(i)它可用來制備一種多肽或其一個片段，后者又可用來制備能夠特異性地結合由所說基因編碼的蛋白的抗體；或(ii)相應于該基因或一種上面定義的(i)型變異體的反義序列。例如，可以用與原來的密碼子不同但編碼相同氨基酸的密碼子進行取代。此外，取代密碼子可編碼一種不同的氨基酸，但不影響蛋白的免疫活性，或提高其活性或免疫原性。例如，定點誘變或其他技術可用來產(chǎn)生單個或多重突變，例如取代、插入、刪除和易位，如同Bostein和Shortle在“體外誘變的策略和應用”《科學》229193-1210(1985)中的介紹，該文在此引入作為參考。因為這樣的修飾基因可根據(jù)這里的介紹應用熟知的技術獲得，這樣的修飾基因也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而且，本領域的技術人員應當理解，本發(fā)明的基因序列(或其片段)可用于獲得能在高度嚴謹條件下與其雜交的其他DNA序列。這種DNA包括任何基因組DNA。因此，本發(fā)明的基因包括顯示與按本發(fā)明的方法鑒定的基因有55％、優(yōu)選60％、最優(yōu)選70％同源性的DNA，只要這種同源DNA編碼一種能用于下面介紹的方法中的蛋白。另外，其他物種中的同源基因可通過證明預測的氨基酸序列與可獲得的蛋白數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列之間有至少約35％的同一性，優(yōu)選35、40、50、60或更大的同一性，進行鑒定。
DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA雜交可在含有0.1XSSC至6XSSC的液體溶液中、在55℃至65℃的溫度下進行。本領域已經(jīng)熟知，溫度越高，SSC濃度越低，雜交條件就越嚴謹?！案叨葒乐敗庇脕碇?XSSC和65℃。1XSSC是0.15M NaCl/0.015M檸檬酸鈉。
基因的“變異體”包括這樣的基因，在該基因相對較小的片段上(例如20至50個核苷酸)與本發(fā)明的基因的等位片段具有高度的同源性(至少50％，優(yōu)選至少90或95％)，即使兩種基因的整個同源性可能非常低。這是因為，即使蛋白的一般結構不同，但重要的活性或結合位點可能相同。
本發(fā)明還包括顯示與本發(fā)明的基因編碼的預測氨基酸序列具有至少30％同一性、優(yōu)選35、40、50、60或更大％的同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明的DNA序列優(yōu)選在一種合適的宿主中表達來制備本發(fā)明的多肽。因此，編碼本發(fā)明的多肽的DNA可根據(jù)已知技術并按照這里的介紹進行修改，用來構建表達載體，后者又可用來轉化一種合適的宿主細胞，用來表達和制備本發(fā)明的多肽。這種技術包括1984年3月3日授予Rutter等的美國專利No.4,440,859、1985年7月23日授予Weissman等的美國專利No.4,530,901、1986年4月15日授予Crowl等的美國專利No.4,582,800、1987年6月30日授予Mark等的美國專利No.4,677,063、1987年7月7日授予Goeddel等的美國專利No.4,678,751、1987年11月3日授予Itakura等的美國專利No.4,704,362、1987年12月1日授予Murray等的美國專利No.4,710,463、1988年7月2日授予Toole，Jr.等的美國專利No.4,757,006、1988年8月23日授予Goeddel等的美國專利No.4,776,075以及1989年3月7日授予Stalker等的美國專利No.4,810,648中公開的技術，上述專利在此引入作為參考。
編碼本發(fā)明的多肽的DNA可與多種其他DNA序列連接形成載體，用來導入合適的宿主。伴侶DNA依賴于宿主的本質、DNA導入宿主的方式以及是否需要游離體維持或整合。
DNA一般以適當?shù)姆较蚝驼_的閱讀框插入到一種表達載體例如質粒中用于表達。如果需要，DNA可與所需的宿主能夠識別的合適轉錄和翻譯調(diào)節(jié)控制核苷酸序列連接，即使這種控制元件一般可由表達載體中獲得。然后通過標準技術將載體導入宿主。一般來說，不是所有的宿主都被載體轉化。因此，需要對轉化的宿主細胞進行選擇。一種選擇技術涉及將在轉化的宿主細胞中編碼一種選擇標記例如抗生素抗性的DNA序列以及任何必需的控制元件整合到表達載體中。此外，編碼這種選擇標記的基因可在另一種載體上，該載體被用來共轉化所需的宿主細胞。
然后將本發(fā)明的重組DNA轉化的宿主細胞在本領域的技術人員熟知的、根據(jù)這里的公開內(nèi)容介紹的合適條件下培養(yǎng)足夠的時間，使多肽表達，然后回收多肽。
多種表達系統(tǒng)已經(jīng)知道，包括細菌(例如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(例如啤酒酵母)、絲狀真菌(例如曲霉)、植物細胞、動物細胞和昆蟲細胞。
載體包含一種原核復制區(qū)域，例如ColE1 ori可用于在原核細胞中增殖，即使該載體被用于在其他非原核的細胞類型中表達。載體也可包含一種合適的啟動子，例如一種能指導基因在被其轉化的細菌宿主細胞如大腸桿菌中表達(轉錄和翻譯)的原核啟動子。
啟動子是一種表達控制元件，它由能夠允許RNA聚合酶結合并發(fā)生轉錄的DNA序列組成。與舉例的細菌宿主匹配的啟動子序列通常在質粒載體中提供，這種質粒含有方便的限制酶切位點，用于本發(fā)明的DNA片段插入。
典型的原核載體質粒為pUC18、pUC19、pBR322和可從BioradLaboratories(Richmond，CA，USA)獲得的pBR329以及可從Pharmacia，Piscataway，NJ，USA獲得的pTrc99A和pK223-3。
一種典型的哺乳動物細胞載體質粒為可從Pharmacia，Piscataway，NJ，USA獲得的pSVL。該載體使用SV40晚期啟動子驅動克隆基因的表達，最高表達水平出現(xiàn)在產(chǎn)生T抗原的細胞，例如COS-1細胞。
誘導型哺乳動物表達載體的一個例子是pMSG，它也可從Pharmacia獲得。該載體使用小鼠乳腺瘤病毒長末端重復的糖皮質激素誘導型啟動子驅動克隆基因的表達。
有用的酵母質粒載體為pRS403-406和pRS413-416，它們一般可從Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA 92037，USA獲得。質粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406為酵母整合型質粒(YIps)，并整合有酵母選擇標記HIS3、TRP1、LEU2和URA3。質粒pRS413-416為酵母著絲粒質粒(YCps)。
多種方法已被發(fā)展來將DNA與載體通過互補粘性末端操縱連接。例如，可以將互補的同源多聚體序列加入將要插入載體的DNA片段。然后使載體和DNA通過互補同源多聚體尾巴之間的氫鍵結合，形成重組DNA分子。
合成的、含有一種或多種限制酶切位點的接頭可為DNA片段與載體連接提供另一種方法。按早期的介紹用限制酶切消化制備的DNA片段用噬菌體T4 DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理，這兩種酶能通過其3’-5’外切核酸酶活性除去突出的3’單鏈末端，并通過其聚合酶活性將凹進的3’末端補平。
因此這些活性的組合產(chǎn)生了平末端的DNA片段。然后將平末端片段與摩爾數(shù)大大過量的接頭分子在酶的存在下溫育，其中酶是能夠催化平末端DNA分子連接的酶，例如噬菌體T4連接酶。這樣，反應的產(chǎn)物就是在末端帶有聚合物接頭序列的DNA片段。然后用合適的限制內(nèi)切酶切割這些DNA片段，并與已經(jīng)用能夠產(chǎn)生與DNA片段的末端相匹配的末端的酶切割的表達載體連接。
含有各種限制酶切位點的合成接頭可從多種來源購買，包括International Biotechnologies Inc，New Haven，CN，USA。
修飾編碼本發(fā)明的多肽的DNA的一種理想方法是按照Saiki等(1988)《科學》239487-491公開的方法使用聚合酶鏈反應。
在這種方法中，酶擴增DNA的兩翼為兩種特異性的引物，它們自身將整合進擴增的DNA。所說的特異性引物可含有限制酶識別位點，用于使用本領域熟知的方法克隆進表達載體。
在第4個方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的多核苷酸載體結構物轉化的宿主細胞。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。細菌細胞是優(yōu)選的原核細胞，并且通常為大腸桿菌，例如可從Bethesda ReserchLaboratories Inc.，Bethesda，MD，USA獲得的DH5，以及可從Rockville，MD，USA的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的RR1。優(yōu)選的真核宿主細胞包括酵母和哺乳動物細胞，優(yōu)選來自小鼠、大鼠、猴或人成纖維細胞系的脊椎動物細胞。酵母宿主細胞包括YPH499、YPH500和YPH501，它們一般可從Stratagene CloningSystems，La Jolla，CA 92037，USA獲得。優(yōu)選的哺乳動物宿主細胞包括可從ATCC獲得的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞CCL61、可從ATCC獲得的NIH Swiss小鼠胚細胞NIH/3T3細胞CRL1658以及可從ATCC獲得的猴腎衍生的COS-1細胞CRL1650。
在第5個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的多核苷酸載體結構物在制備醫(yī)藥用組合物中的用途。具體地說，制備疫苗，用于治療或預防腫瘤，優(yōu)選是禽腫瘤，尤其是那些與致癌禽病毒如MDV、ALV、勞氏相關病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒有關的腫瘤。
在禽類中，用本發(fā)明的多核苷酸載體結構物的溶液對受精卵進行卵內(nèi)注射是一種方便的給藥模式。
用本發(fā)明的DNA結構物轉化合適的宿主細胞通過熟知的方法來完成，并通常根據(jù)所用載體的類型。對原核宿主細胞的轉化來說，見諸如Cohen等(1972)《美國科學院院刊》692110和Sambrook等(1989)《分子克隆實驗室手冊》Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY。酵母細胞的轉化在Sherman等(1986)《酵母遺傳學方法，實驗室手冊》Cold Spring Harbor，NY中介紹。Beggs(1978)《自然》275104-109的方法也有用。對于脊椎動物細胞，對這些細胞的轉染有用的試劑如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖或脂質體制劑可從Stratagene Cloning Systems或Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD，20877，USA獲得。
電轉化也可用于轉化細胞，而且用其來轉化酵母細胞、細菌細胞和脊椎動物細胞在本領域是熟知的。
例如，多種細菌可用Luehansky等(1988)《分子微生物學》2637-646中介紹的方法轉化，該文在此引入作為參考。在25 uFD使用6250V每cm對懸浮于2.5X PEB的DNA-細胞混合物進行電轉化，一般能得到最大數(shù)量的轉化子。
電轉化酵母的方法在Becker & Grarente(1990)《酶學方法》194182中介紹。
轉化成功的細胞，即含有本發(fā)明的DNA結構物的細胞，可用熟知的技術進行鑒定。例如，由導入本發(fā)明的一種表達結構物而產(chǎn)生的細胞可進行培養(yǎng)來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。可收集細胞并裂解，并使用諸如Southern(1975)《分子生物學雜志》98503或Berent等(1985)《生物技術》3208中的方法檢測其DNA中目標DNA的存在。此外，可使用抗體按這里的介紹檢測上清中目標蛋白的存在。
除了直接檢測重組DNA的存在，在重組DNA能指導蛋白表達時，成功的轉化可通過熟知的免疫學方法進行證明。例如，用一種表達載體成功轉化的細胞能產(chǎn)生顯示合適抗原性的蛋白。收集可能轉化了的細胞樣品，使用合適的抗體檢測目標蛋白。
因此，除了轉化宿主細胞本身，本發(fā)明還包括一種營養(yǎng)培養(yǎng)基中這些細胞的培養(yǎng)物，優(yōu)選是一種單克隆的培養(yǎng)物(克隆均一)，或由單克隆培養(yǎng)物衍生的培養(yǎng)物。
包含本發(fā)明的各個方面的非限制性實施例將參考

圖1至7進行介紹。
圖1質粒PI.18的表達，該質粒含有一個AV37抗原的開放閱讀框(ORF)可以插入的EcoRV位點。
圖2禽痘病毒轉移質粒(pEFL929)，它含有一個AV37 ORF可以插入的SmaI位點。
圖3HVT轉移質粒(pVECo4)，它含有一個AV37 ORF可以插入的EcoRV位點。
圖4桿狀病毒轉移質粒(pACYM1)，它在多克隆位點(mcs)中含有一個AV37 ORF可以插入的SmaI位點圖5(a)編碼AV37抗原以及成熟AV37抗原的氨基酸序列的DNA序列。
圖5(b)成熟AV37抗原的氨基酸序列。
圖6顯示DELFIA的結果。沙門氏菌Ab用作陽性對照來表示DELFIA正常。參考數(shù)字1566、1568和1571為具有淋巴瘤的毒性MDV感染的禽的環(huán)數(shù)(2)；391V和PK/2365為已用毒性MDV超免疫的禽。
圖7顯示預先吸收AV37蛋白后的DELFIA結果。參考數(shù)字391V和1599表示帶有淋巴瘤的毒性MDV感染的禽。
表1-遺傳密碼和單字母氨基酸命名(摘自Old & Primrose，《基因操作原理》，第三版，1985，附錄7，346頁，Blackwell ScientificPublications，Oxford，UK。)
a如果在起始位置編碼Met丙氨酸 A 亮氨酸 L精氨酸 R 賴氨酸 K天冬酰胺N 甲硫氨酸M天冬氨酸D 苯丙氨酸F半胱氨酸C 脯氨酸 P胱氨酸 C 絲氨酸 S甘氨酸 G 蘇氨酸 T谷氨酸 E 色氨酸 W谷氨酰胺Q 酪氨酸 Y組氨酸 H 纈氨酸 V異亮氨酸I針對馬力克氏病病毒轉化細胞系上表達的一種宿主抗原的單克隆抗體AV37的制備分泌mAb AV37的雜交瘤的制備從MD腫瘤分離細胞，體外培養(yǎng)，制備永生化的細胞系[Powell，L.N.，Payne，L.N.，F(xiàn)razier，J.A.和Rennie，M.C.(1975)《致癌和皰疹病毒II》，de-Thé，G.Epstein，M.A.和zurHausen，H.(編輯)IARC Scientific Publications no.11，Lyon]。從MDV轉化的細胞系HP9[Payne，L.N.(1981)《國際癌癥雜志》28757-766]取107細胞，與Quli A一起經(jīng)腹膜內(nèi)途徑注射給一只成年BALB/c小鼠。4周后，從MDV轉化的細胞系MDCC-HP89[Payne，L.N.(1981)《國際癌癥雜志》28757-766]取107細胞，經(jīng)相同途徑在無佐劑的條件下注射給該鼠。8周后用107MDCC-HP89細胞重復此步驟。6周后，通過靜脈途徑注射107MDCC-HP89細胞，并在1天后經(jīng)腹膜途徑注射107MDCC-HP89細胞，以加強小鼠的免疫應答。3天后處死小鼠，取出脾臟，制備脾細胞。使用聚乙二醇使脾細胞與NS1骨髓瘤細胞融合來制備雜交瘤細胞[Kohler，G和Milstein，C.(1975)《自然》256495-497]?？寺‰s交瘤，一個孔---349(AD4a)中的細胞分泌一株抗體，該抗體在用于流式細胞儀分析時，能夠與至少90％的MDCC-HP9或-HP89細胞系產(chǎn)生陽性的免疫反應，而識別少于10％的胸腺細胞。選擇此克隆，并進行下一輪的克隆，篩選對MDV轉化細胞系細胞的陽性反應。所選擇的雜交瘤對HP9和HP89細胞系細胞產(chǎn)生陽性應答，但對來自未感染的禽的淋巴細胞不應答。此兩次克隆的雜交瘤被命名為AV37，并于1998年3月3日根據(jù)布達佩斯條約保藏于ECACC，保藏號為98030304。使用mAb AV37鑒定表達AV37抗原的細胞AV37克隆分泌的單克隆抗體(mAb AV37)能夠識別基本上所有MD腫瘤衍生的細胞系細胞上存在的一種抗原，除了細胞系MDCC-MSB-1[Yamada M.，Matsuda，H.和Hii，S.(1983)GANN，74502-508]。AV37抗原在來自未感染禽的淋巴細胞上不顯示表達(脾、胸腺、法氏囊或骨髓)。但該單克隆抗體似乎能對少數(shù)外周血淋巴細胞產(chǎn)生弱的陽性應答(＜0.1％的群體)。用植物凝集素伴刀豆球蛋白A刺激淋巴細胞并加入來自活化的淋巴母細胞的條件培養(yǎng)基可增加表達AV37抗原的細胞比例(最大達6％)。MDV感染后，在感染后的第3天和第7天，抗原在2％的外周血淋巴細胞上檢測到。在感染后第5天在脾細胞上和在感染后第12天在胸腺細胞上也檢測到該抗原。
AV37抗原在不同MD腫瘤的不同細胞部分(2-70％)中存在。這些AV37+細胞分散于腫瘤組織，但趨向于在不同的區(qū)域聚集。流式細胞儀分析顯示，多數(shù)AV37+腫瘤細胞為CD4+，并表達高水平的MDV基因產(chǎn)物meq，它是一種具有轉錄因子活性的堿性亮氨酸拉鏈蛋白，但不存在參與裂解性感染的病毒蛋白---pp38和gB。高比例的CD4+AV37+細胞顯示于細胞周期的S-G2M期，但只有少部分具有微二倍體DNA，這表明該細胞群體正在活躍增殖，而不是經(jīng)歷活化誘導的細胞程序性死亡。meq在體外與阻斷細胞程序性死亡有關，這說明腫瘤中的AV37+細胞是永生化的，因此很可能是贅生性轉化細胞。一個進一步的重要發(fā)現(xiàn)是，AV37單克隆抗體識別的抗原在其他禽致癌病毒轉化的細胞系上表達，這包括逆轉錄病毒如禽白血病病毒和網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒(見表2)。這表明，AV37抗原是一種禽腫瘤特異性抗原。
表2-mAbs AV37對禽細胞系MATSAs的反應性
表2的關鍵詞1 ALV＝禽白血病病毒；MDV＝馬立克氏病病毒；MNNG＝甲基硝基亞硝基胍；RAV＝勞氏相關病毒；REV＝網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒。2 HL SC＝Hyline Poultry Farms，Dallas Centre，IA，USA；RIR-RhodeIsland Red；RPRL-區(qū)域家禽研究實驗室，East Lansing，MI，USA.3 Oghura，H.et al.(1984)GANN，75，410-414；Hihara，H.et al.(1974)Natl.Inst.Animal Health Quart.14，163-173；Baba，T.W.(1985)《病毒學》144，139-151；Nazerian，K.et al.(1977)禽疾病21，69-76；Okazaki，W.et al.(1980)禽類病理學9，311-329；Powell，P.C.et al.(1974)《自然》251，79-80；Payne，L.N.et al.(1981)《國際癌癥雜志》28，757-766；Nazerian，K.(1987)禽類病理學16，527-544；Akiyama，Y.and Kato，S.(1974)Biken，17，105-116；Shaw，I.(1997)PhD thesis，University of London.AV37抗原的鑒定AV37抗原的純化AV37抗原從HP9細胞純化，該細胞的表面蛋白已按照Vainio，O.，Riwar，B.，Brown，M.H.和Lassila，O.(1991)《免疫學雜志》1471593-1599介紹的方法使用乳過氧化氫酶用Na125I進行了標記。細胞表面蛋白用含有蛋白酶抑制劑的2％NP40裂解緩沖液溶解。與AV37抗體組成一種可溶性免疫復合物的放射性標記的抗原用已經(jīng)結合了鏈球菌蛋白G的兔抗鼠免疫球蛋白抗體免疫沉淀。將免疫沉淀用含有或不含有巰基乙醇的緩沖液解離[Laemmli，U.K.(1990)《自然》227680-685]。當用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析時，在還原和非還原條件下，放射性標記的抗原都顯示具有75kDa的相對分子量。AV37基因的克隆和測序(i)表達被AV37單克隆抗體識別的抗原的基因從一個互補DNA(cDNA)文庫中克隆，該文庫從一種MDV轉化細胞系的細胞制備。使用Chirgwin等的方法從HP9細胞制備信使RNA[Chirgwin，J.M.Przbyla，A.E.，MacDonald，R.J.和Rutter，W.J.(1979)《生物化學》185294-5299]，并用寡聚(dT)色譜純化。將雙鏈DNA與非自身互補的BstX1接頭連接，用瓊脂糖凝膠電泳進行分子量大小分離，并插入質粒pCDM8[Seed，B.(1987)《自然》329840-842]。將連接的DNA電轉化進大腸桿菌MC1061/p3[Dower，W.J.，Miller，J.F.和Ragsdale，C.W.(1988)《核酸探索》166127-6145]。質粒由混合的轉化克隆用標準方法制備[Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)《分子克隆實驗室手冊》，Cold SpringHarbor，New York]。COS-7細胞轉染在懸液中或在粘附細胞上進行[Metzelaar，M，Winjgaard，P.L.J.，Peters，P.，Sixma，J.J.，Nieuwenhuis，H.K.和Clevers，H.C.(1991)《生物化學雜志》2663239-3245].用單克隆抗體AV37篩選丙酮固定的轉染細胞以及從陽性染色的細胞回收質粒按Horst的介紹進行[Horst，M.，Wijngaard，P.L.J.，Metzelaar，M.，Bast，E.J.E.G.和Clevers，H.C.(1991)《核酸探索》194556]。該AV37+克隆被命名為pMAT1。一種對照單克隆抗體AV7不能檢測到用pMAT1轉染的染色細胞，即使這些轉染細胞能用單克隆抗體AV37強烈地染色。使用PRISMTMReady ReactionDye DeoxyTMTerminator cycle測序試劑盒(Applied Biosystems)對pMAT1克隆進行測序。測定該克隆每條鏈的全部序列。序列數(shù)據(jù)用Wisconsin Package軟件(Genetics Computer Group)分析[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]。完整的核酸和氨基酸序列示于圖5(a)。UW-GCG軟件包[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]被用來搜尋各種DNA數(shù)據(jù)。
意外的是，使用Southern印跡分析在MDV DNA上沒有檢測到編碼AV37抗原的基因，這表明它不是一種病毒基因。但使用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)從未感染的雞淋巴細胞和孵育5天的雞蛋細胞的總RNA抽提物中擴增到了該基因。這表明AV37是癌胚抗原，類似哺乳動物中介紹的癌胚抗原[綜述Boon，T.和Old，L.J.《當代免疫學評論》(1997)9681-683；Van den Eyde，B.和vand der Bruggen，P.《當代免疫學評論》(1997)9684-693]。
AV37單克隆抗體還能識別用其他致癌病毒轉化制備的淋巴母細胞系。用細胞系獲得的陽性應答見表2(上文)的介紹。這表明，AV37抗原是轉化的一種標記，并存在于由其他致癌病毒產(chǎn)生的腫瘤細胞。
(ii)表達被AV37單克隆抗體識別的抗原的基因從一個互補DNA(cDNA)文庫中克隆，該文庫從馬力克氏病病毒轉化的淋巴母細胞系MDCC-HP9制備。所有的MDCC-HP9細胞都表達非常高水平的AV37抗原。使用Chirgwin等的方法從HP9細胞制備信使RNA[Chirgwin，J.M.Przbyla，A.E.，MacDonald，R.J.和Rutter，W.J.(1979)《生物化學》185294-5299]，并用寡聚(dT)色譜純化。將雙鏈DNA與非自身互補的BstX1接頭連接，用瓊脂糖凝膠電泳進行分子量大小分離，并插入質粒載體pCI-nx，該質粒由IAH，Compton的J.Young博士贈送。pCI-nx是商業(yè)化質粒pCI-neo(Promega，Madison，Wisconsin)的一個變異體。將該文庫電轉化進大腸桿菌MC1061/p3[Dower，W.J.，Miller，J.F.和Ragsdale，C.W.(1988)《核酸探索》166127-6145]。質粒由混合的轉化克隆用標準方法制備[Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Sambrook，J.(1982)《分子克隆實驗室手冊》，Cold Spring Harbor，New York]。COS-7細胞轉染在懸液中進行[Metzelaar，M，Winjgaard，P.L.J.，Peters，P.，Sixma，J.J.，Nieuwenhuis，H.K.和Clevers，H.C.(1991)《生物化學雜志》2663239-3245]。將包被了羊抗鼠免疫球蛋白的Dynabeads M280(Dynal，Oslo，Norway)與AV37抗體溫育，洗滌并與轉染了HP9文庫的COS-7細胞溫育。然后將它們按O’Regan等的介紹進行磁分選[O’Regan，M.N.，Parsons，K.R.，Tregaskes，C.A.和Young，J.R.(1999)《免疫遺傳學》4968-71]。進行3輪這樣的選擇和富集。分離了24個陽性克隆。對能夠在轉染進COS-7細胞或雞胚成纖維細胞時表達AV37抗原的克隆進行測序。AV37基因由MWG-Bicotech(Milton Keynes，UK)使用LICOR 4200系統(tǒng)進行測序。對克隆進行兩條鏈的完整測序。
UW-GCG軟件包[Devereux，J.，Haeberli，P.和Smithies，O.(1984)《核酸探索》12387-395]被用來搜尋各種DNA數(shù)據(jù)。這些搜尋表明，AV37是腫瘤壞死因子受體超家族的一個成員。
成熟的AV37抗原是一種446aa的1型膜蛋白，與(1)人和小鼠CD30最為相似，它與人和小鼠CD30的全部氨基酸的同一性大約為32％。AV37抗原的氨基酸序列為直接測定氨基酸序列，從MDCC HP9細胞系直接分離AV37抗原。在對HP9細胞的膜蛋白裂解物進行免疫印跡(Western印跡)后，AV37抗體與一個70kDa的條帶反應。AV37單克隆通過在含有無免疫球蛋白血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞進行制備。AV37免疫球蛋白用蛋白A(Pharmacia)純化，接著與CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia)使用標準的技術偶聯(lián)[Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Marulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W(1999)《當代免疫學方法》第2版第8章，suppl.29，John Wiley和Sons Inc.]。膜蛋白裂解物從1010HP細胞制備，將裂解物通過AV37-Sepharose柱，洗脫含有AV37抗原的級份。對級份樣品進行免疫印跡來鑒定含有AV37抗原的級份。(在對HP9細胞的膜蛋白裂解物進行免疫印跡(Western印跡)后，AV37抗體與一個70kDa的條帶反應。)。將陽性級份混合，用丙酮沉淀，并制備來用于使用Edman降解進行N-末端測序[見Niall，HD(1973)《酶學方法》2卷，942-1010頁]。測定7個N-末端氨基酸，這證明了成熟AV37蛋白的預測起始位點(氨基酸22)。編碼AV37抗原的核酸在載體構建和免疫方法及組合物中的用途1.AV37 ORF的來源編碼AV37抗原的開放閱讀框(ORF)可使用PCR擴增一種cDNA克隆(pMAT1.AV37)來獲得，使用如下引物。
適用于獲得AV37基因的ORF的引物對舉例正向5’-TGG AAA GGA ACT GGA GTG-3’(SEQ ID No.6)反向5’-GCA AGC TGT GAA TTA GCC-3’(SEQ ID No.7)正向5’-CTG CTG CTT CTC CAG GAC ATT C-3’ (SEQ ID No.8)
反向5’-ATT CCT TTC CCT CCT CTT CCA C-3’ (SEQ ID No.9)正向5’-AGA CTT CAG GAG GAG CAA C-3’ (SEQ ID No.10)反向5’-GCT TCA CAC ACC TTC TCA G-3’ (SEQ ID No.11)這些引物被設計來擴增兩翼含有EcoRV位點的AV37的ORF。
應當理解，每種引物也可單獨用作雜交探針(如放射標記探針)，根據(jù)標準技術檢測圖5(a)(SEQ ID No.1)的AV37核苷酸序列的變異體。2.表達質粒的構建上面獲得的PCR產(chǎn)物可用EcoRV消化，并將片段克隆進表達質粒PI.18(圖1)的EcoRV位點。PI.18質粒獲自J.S.Robertson博士，National Institute of Biological Standards and Control，SouthMimms，EN6 3QG，UK。它由pUC質粒[Sambrook等(1989)《分子克隆實驗室手冊》Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY]衍生，并且是非活動性的。它已被用來通過遺傳工程在哺乳動物和禽細胞中表達外源基因。表達由HCMV的即時早期啟動子驅動，并通過在啟動子和克隆位點間含有一個內(nèi)含子來優(yōu)化。轉錄由CMV polyA信號終止。AV37片段的方向可用限制酶分析來檢測，并用測序來證明正確的方向。獲得的重組質粒(PI.18-AV37)可轉染進雞胚成纖維細胞，并且AV37抗原在CMV I.E.啟動子控制下的表達可使用mAb AV37進行免疫熒光方法來檢測。該質?？芍苯佑糜趯﹄u免疫接種。它優(yōu)選首先在QiagenTM陰離子交換樹脂上純化。免疫接種方法雞可以用各種劑量的重組質粒DNA(30-100ug)在腿和胸的多個位點進行免疫接種。加強免疫可在適當間隔后(例如15天)進行，并用一種MDV的毒性株(RB1B)對雞進行攻擊。僅用質粒PI.18免疫的雞用作對照。3.禽痘病毒重組體的構建在本實施例中，通過插入本發(fā)明的一種編碼AV37的核苷酸序列來對一種已知禽疫苗進行修飾。所產(chǎn)生的試劑因而含有本發(fā)明的一種核苷酸序列/多肽和一種已知禽疫苗的組合物。
含有AV37 ORF的EcoRV片段可從PI.18-AV37通過EcoRV消化獲得，并克隆進禽痘病毒轉移質粒pEFL29(圖2)的SmaI位點。AV37基因的正確方向可按照上面的介紹進行檢測。將該結構物轉染進雞胚成纖維細胞，該細胞已按照Yu等人(1994)[《疫苗》12227-237]和Li等人(1994)[《病毒學方法雜志》50185-196]的介紹預先轉染了禽痘病毒的FP9株。重組病毒子代可通過在存在Bluogal(Sigma)時形成蘭色空斑來鑒定，Bluogal是β-半乳糖苷酶的一種底物。可空斑純化一定數(shù)量的重組病毒，并使用單克隆抗體AV37通過免疫熒光技術檢測AV37的表達。免疫接種方法雞可通過i/m或皮內(nèi)接種，通常使用翅膀上劃痕，并可使用不同接種劑量(例如106-107空斑形成單位)的重組病毒。它們可在14天后使用相同的劑量和相同途徑進行第2次免疫來進行加強免疫。接種的雞和用FP9載體免疫的對照在6天后可用RB1B病毒攻擊。4.火雞皰疹病毒(HVT)重組體的構建在本實施例中，通過插入本發(fā)明的一種編碼AV37的核苷酸序列來對一種已知禽疫苗進行修飾。所產(chǎn)生的試劑因而含有本發(fā)明的一種核苷酸序列/多肽和一種已知禽疫苗的組合物。
按上面的介紹獲得的含有AV37 ORF的EcoRV片段可克隆進HVT轉移質粒pVECo4(圖3)[Sondermeijer等(1993)《疫苗》11349-358]的EcoRV位點。AV37基因的正確方向可按照上面的介紹進行檢測。將該結構物和感染性HVT DNA按介紹共轉染進CEF(Morgan等(1992)《禽類疾病》36858-870；Ross等(1993)《普通病毒學雜志》，74371-377)?？商羧∫欢〝?shù)量病毒空斑，并按照上面的介紹，通過篩選表達AV37的感染CEF對重組病毒進行鑒定。免疫接種方法雞可通過i/m接種1000至5000空斑形成單位的重組HVT或親本HVT，并可在6天后用RB1B病毒攻擊。5.桿狀病毒重組體含有AV37 ORF的EcoRV片段可克隆進桿狀病毒轉移質粒PACYMI(圖4)的多克隆位點(mcs)中的SmaI位點[Matsuura，Y.等(1987)《普通病毒學雜志》681233-1250]。重組質粒和線形化的桿狀病毒DNA可按照Matsuura，Y.等(1987)的介紹共轉染進SF9昆蟲細胞。空斑純化子代病毒，并通過上面介紹的免疫熒光方法檢測它們在SF9細胞中表達AV37抗原的能力。免疫接種方法感染SF9細胞的抽提物或用親和色譜純化的AV37抗原可用于免疫接種。對于初次接種，抗原可在福氏完全佐劑中乳化。在合適的間隔后(如3周)，使用不完全佐劑進行進一步的接種，最后一次接種不使用佐劑。在最后一次接種1周后，用RB1B病毒攻擊接種的雞。用感染了野生型桿狀病毒的昆蟲細胞抽提物免疫的雞作為對照。
在所有的接種策略中，提供的保護程度可以通過觀察受體禽的MD的臨床癥狀和腫瘤形成來測定?？稍诤线m的間隔時間后收集血樣品，篩選抗AV37抗原的抗體的存在。所有的受體禽可在例如15-26周后處死，并進行尸檢，檢測腫瘤的征兆。6.進一步免疫接種的方法雞可通過卵內(nèi)途徑進行接種。在孵化18天的受精卵的殼上鉆孔，將高達0.1ml的含有HVT、禽痘病毒載體或桿狀病毒載體中的重組AV37抗原或質粒DNA形式注射進正在發(fā)育的雞胚的尿囊腔或羊膜腔。非常有用的自動化卵注射裝置可從Embrex Inc.，USA獲得。
無佐劑的進一步接種可在合適的間隔后(例如2-3周)經(jīng)適當途徑給予孵化的雞。接種的雞在最后一次接種1周后用RB1B病毒攻擊。將HVT、禽痘病毒或用野生型桿狀病毒感染的昆蟲細胞的抽提物免疫的雞用作各自的對照。7.在MDV感染的雞中誘導了一種針對AV37的明顯免疫應答從下列途徑獲得血清(1)已用一種毒性MDV超感染的遺傳抗性雞和(2)已用毒性MDV感染并產(chǎn)生淋巴瘤的易感雞。這些血清在免疫吸附試驗中與純化的AV37抗原陽性反應(圖6)。相反，來自無病雞的對照血清在免疫吸附試驗中不與純化的AV37抗原反應。這說明MDV感染的雞和免疫的雞產(chǎn)生了針對AV37抗原的抗體。另外，當這些血清與純化的AV37抗原預溫育時，抗體從血清中排除，陽性讀數(shù)消失(圖7)。實驗簡述品系6的雞對MD具有遺傳抗性，他們通過重復注射一種MDV致癌株(HPRS-16株)進行超免疫。收集血清，并貯存于-20℃以備分析。此外，對MD易感的羅德島紅雞用MDV(HPRS-16株)感染，并在產(chǎn)生馬力克氏病淋巴瘤后收集血清。對照血清從處于無病環(huán)境的相同品系的雞中收集。
AV37單克隆通過在含有無免疫球蛋白血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞制備。免疫球蛋白用蛋白A(Pharmacia)純化，接著與CNBr-活化的Sepharose(Pharmacia)使用標準的技術偶聯(lián)[Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Marulies，D.H.，Shevach，E.M.和Strober，W(1999)《當代免疫學方法》第2版第8章，suppl.29，John Wiley和Sons Inc.]。膜蛋白裂解物從1010HP細胞制備，將裂解物通過AV37-Sepharose柱，洗脫含有AV37抗原的級份。對級份樣品進行免疫印跡來鑒定含有AV37抗原的級份。
通過在4℃溫育含有純化的AV37抗原的裂解物過夜，將AV37抗原包被到塑料微滴定板的孔中。洗滌板并用含有牛血清白蛋白作為封閉試劑的封閉緩沖液進行封閉。稀釋來自MDV免疫雞的超免疫血清、來自帶有腫瘤的MDV感染雞血清或來自未感染雞的對照血清，并在AV37包被的孔中溫育。將板洗滌3次，然后與已經(jīng)接合了Europium的抗雞免疫球蛋白溫育，并用于解離增強的鑭熒光試驗(DELFIA)[Wood，P.& Barnard，G.(1997)《免疫試驗的原理和實踐》PriceDavid C.P.編輯，17章，Newman Macmillan，London]。與來自來感染的雞的血清相比，超免疫血清和來自帶有腫瘤的MDV感染雞的血清反應為陽性(鑭熒光較強)(見圖6)。
為檢測該應答是否為特異性的，將相同的血清在已經(jīng)包被了純化的AV37抗原或馬血清的孔中預溫育。然后將樣品用于DELFIA。超免疫血清和來自帶有腫瘤的MDV感染雞的血清在DELFIA中不能反應(圖7)，這表明，血清中的AV37特異性抗體已被除去。
序列表<110>Institute of Animal Health<120>生物物質及其使用<130>INST-P20757PC<140><141><150>GB 9809070.7<151>1998-04-29<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1956<212>DNA<213>Gallus sp.<220><221>成熟肽<222>(205)..(1605)<400>1tcgagaattc acgcgtggta cctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgctgga 60aaggaactgg agtggccctg gacttggtga gcggacactg agcgaggctg gactggacgc 120tgggagggtc ccagacttca ggaggagcaa cctggctgtc agacctgcaa tgctgggaga 180tcaggaaagc taacgccact gcagatggct tcctgcagcc tgagactggg actgtggctc 240ctgctgcttc tccaggacat tcagggagcc ccacagccac cgttcacctc atctcattcc 300tgtgacacac tcaagaattg gttctatgat gaaacattag ggaggtgctg ttaccagtgc 360ccttcaggct atgctaaaaa gaaatcatgt cccatggatc cagatgaaga ctgcatgaga 420tgtggacctg agcaatacct gaatcagtcc ccaaagccac gatgtgatgc ttgtgtgtta 480tgcaccaaag aatttgacct tgtggagaag gccccctgct ccttcaattc cagccgggtg 540tgtgagtgtc gaccagggat gttttgccag actgctgcta agaacacctg catgcgatgc 600cagcggcaca ctgcttgcaa gcctggtttt ggggtcaaaa tcagaggcac ttcagagact 660gatgtttcat gtgaggaatg ccctcctggg accttctctg accaaagctc cagcactgac 720gtctgcaagc cccacacgga ctgtgccaag ttgaacaaag tagcacaagg caaaggaaat 780gccacccatg atcaggtttg cacggaccaa ttgccctcct acctcacccc agacacctcc 840tccatcagaa tcaccaatga gacagatgac tctgacgtac tgaagcgtaa tgcaaacccg 900gtgacccttg ctagcatcct ttcaagtgcc acaaccgaaa ttcccggttc aactcccgag 960gaggaagctc tggctggcac ttctcccacc ttagccaagg gggaaacaac aacgagaggt 1020cttgttttct gggcagtggt tctctctgtg atggtgctac ctgtgggcat gctgtcattt 1080tggcaatgga aggtctgcaa gaaacggatc ttcatcctca aacaaaagcg ttctgatcta 1140gtggacaaat atgcaaagat cacactgacc actgacaaat gtccagaaga ggaggagtta 1200actgacagga gcctcccttt ggaaaccaac aacaacaact tgatctccag tgctgaaaaa 1260gcaggtagtc ctgttctgag tctgactgaa gtgacgcaga gcaatggaaa agcgccagat 1320ggccccattg attctcaagt gagagaccac acaaataatc agattggaaa aatattcatc 1380atgaacgccg ataccgttat tgtggggtct tcaaaaacgc ctggtatcaa gagctgcact 1440gctaggggat atgaaactga tgttgatctc caggaaaaga tggaagagga gctgtcaatg 1500cactatccag agcaggagac agaggttttt ccagggaatg atgtcatggt tcctgtggaa 1560gaggagggaa aggaattcca tcaccccacc acggccactg agaagtgatc gcctgctgag 1620aaggtgtgtg aagctacagc aacatccagt gacactaagc ctgaacccac actgagggag 1680gtaaacccag agtgtcttac acgacctgaa aactcacgta aagcaccaaa aacattcagc 1740ttatttcatc cagctaattg agaggatcat ccagaccact ggttcacatc aaacactttt 1800ccttgccctc ccagaatcat gctggaaaca aactggaatc aaagttacag aattcagagg 1860acttctggag gctaattcac agcttgcttt gtctgcatga agggatggaa ttaaaatggt 1920tactcctatt agctctgaaa aaaaaaaaaa aaaaaa1956<210>2<211>467<212>PRT<213>Gallus sp.<400>2Met Ala Ser Cys Ser Leu Arg Leu Gly Leu Trp Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Gln Asp Ile Gln Gly Ala Pro Gln Pro Pro Phe Thr Ser Ser His Ser20 25 30Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp Phe Tyr Asp Glu Thr Leu Gly Arg Cys35 40 45Cys Tyr Gln Cys Pro Ser Gly Tyr Ala Lys Lys Lys Ser Cys Pro Met50 55 60Asp Pro Asp Glu Asp Cys Met Arg Cys Gly Pro Glu Gln Tyr Leu Asn65 70 75 80Gln Ser Pro Lys Pro Arg Cys Asp Ala Cys Val Leu Cys Thr Lys Glu85 90 95Phe Asp Leu Val Glu Lys Ala Pro Cys Ser Phe Asn Ser Ser Arg Val100 105 110Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Phe Cys Gln Thr Ala Ala Lys Asn Thr115 120 125Cys Met Arg Cys Gln Arg His Thr Ala Cys Lys Pro Gly Phe Gly Val130 135 140Lys Ile Arg Gly Thr Ser Glu Thr Asp Val Ser Cys Glu Glu Cys Pro145 150 155 160Pro Gly Thr Phe Ser Asp Gln Ser Ser Ser Thr Asp Val Cys Lys Pro165 170 175His Thr Asp Cys Ala Lys Leu Asn Lys Val Ala Gln Gly Lys Gly Asn180 185 190Ala Thr His Asp Gln Val Cys Thr Asp Gln Leu Pro Ser Tyr Leu Thr195 200 205Pro Asp Thr Ser Ser Ile Arg Ile Thr Asn Glu Thr Asp Asp Ser Asp210 215 220Val Leu Lys Arg Asn Ala Asn Pro Val Thr Leu Ala Ser Ile Leu Ser225 230 235 240Ser Ala Thr Thr Glu Ile Pro Gly Ser Thr Pro Glu Glu Glu Ala Leu245 250 255Ala Gly Thr Ser Pro Thr Leu Ala Lys Gly Glu Thr Thr Thr Arg Gly260 265 270Leu Val Phe Trp Ala Val Val Leu Ser Val Met Val Leu Pro Val Gly275 280 285Met Leu Ser Phe Trp Gln Trp Lys Val Cys Lys Lys Arg Ile Phe Ile290 295 300Leu Lys Gln Lys Arg Ser Asp Leu Val Asp Lys Tyr Ala Lys Ile Thr305 310 315 320Leu Thr Thr Asp Lys Cys Pro Glu Glu Glu Glu Leu Thr Asp Arg Ser325 330 335Leu Pro Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asn Leu Ile Ser Ser Ala Glu Lys340 345 350Ala Gly Ser Pro Val Leu Ser Leu Thr Glu Val Thr Gln Ser Asn Gly355 360 365Lys Ala Pro Asp Gly Pro Ile Asp Ser Gln Val Arg Asp His Thr Asn370 375 380Asn Gln Ile Gly Lys Ile Phe Ile Met Asn Ala Asp Thr Val Ile Val385 390 395 400Gly Ser Ser Lys Thr Pro Gly Ile Lys Ser Cys Thr Ala Arg Gly Tyr
405 410 415Glu Thr Asp Val Asp Leu Gln Glu Lys Met Glu Glu Glu Leu Ser Met420 425 430His Tyr Pro Glu Gln Glu Thr Glu Val Phe Pro Gly Asn Asp Val Met435 440 445Val Pro Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Phe His His Pro Thr Thr Ala450 455 460Thr Glu Lys465<210>3<211>16<212>PRT<213>Gallus sp.<400>3Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp Phe Tyr Asp Glu Thr Leu Gly Arg Cys1 5 10 15<210>4<211>22<212>PRT<213>Gallus sp.<400>4Asp Val Met Val Pro Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Phe His His Pro1 5 10 15Thr Thr Ala Thr Glu Lys20<210>5<211>22<212>PRT<213>Gallus sp.<400>5Gln Pro Pro Phe Thr Ser Ser His Ser Cys Asp Thr Leu Lys Asn Trp1 5 10 15Phe Tyr Asp Glu Thr Leu
20<210>6<211>18<212>DNA<213>Gallus sp.<400>6tggaaaggaa ctggagtg 18<210>7<211>18<212>DNA<213>Gallus sp.<400>7gcaagctgtg aattagcc 18<210>8<211>22<212>DNA<213>Gallus sp.<400>8ctgctgcttc tccaggacat tc 22<210>9<211>22<212>DNA<213>Gallus sp.<400>9attcctttcc ctcctcttcc ac 22<210>10<211>19<212>DNA<213>Gallus sp.<400>10agacttcagg aggagcaac 19<210>11<211>19<212>DNA<213>Gallus sp.<400>11gcttcacaca ccttctcag19
權利要求
1.一種能被雜交瘤AV37分泌的單克隆抗體識別的純化多肽，其中該雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約于1998年3月3日保藏在位于英國的歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)，保藏號為98030304。
2.權利要求1的多肽，其中多肽表達在被一種致癌禽病毒轉化的細胞系上。
3.權利要求2的多肽，其中致癌性禽病毒選自馬力克氏病病毒、禽白血病病毒、勞氏相關病毒或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒。
4.權利要求3的多肽，其中病毒是馬力克氏病病毒。
5.一種多肽，優(yōu)選是權利要求1-4任一項的多肽，其中該多肽含有圖5(b)(SEQ ID No.2)的氨基酸序列的全部或一個片段或變異體。
6.權利要求5的多肽，它具有選自如下的AV37多肽的氨基酸序列(a)NH2-QPPFTSSHSCDTLKNWFYDETL-COOH(SEQ ID No.5)；和(b)NH2-DVMVPVEEEGKEFHHPTTATEK-COOH(SEQ ID No.4)；和/或(c)NH2-CDTLKNWFYDETLGRC-COOH(SEQ ID No.3)。
7.針對權利要求1-6任一項的多肽制備的單克隆抗體。
8.能被權利要求7的單克隆抗體識別的純化多肽。
9.編碼權利要求1至6任一項或8的多肽的分離核苷酸序列或其變異體。
10.編碼權利要求1至6任一項或8的多肽的分離DNA序列或其變異體。
11.權利要求10的DNA序列，它包含示于圖5(a)(SEQ ID No.1)的核苷酸序列的全部或部分。
12.含有權利要求9至11任一項的核苷酸序列的多核苷酸載體結構物。
13.含有權利要求10或11的DNA序列的表達載體，其中DNA序列被安排在載體中，使該DNA序列在一種合適的宿主細胞中表達。
14.權利要求13的表達載體，其中載體包括質粒。
15.權利要求13的表達載體，其中載體包括病毒DNA。
16.權利要求15的表達載體，其中病毒DNA來自禽痘病毒、火雞皰疹病毒和/或桿狀病毒。
17.權利要求12至16任一項的載體或權利要求1至6任一項或8的多肽在制備一種醫(yī)藥用組合物中的用途。
18.權利要求12至16任一項的載體或權利要求1至6任一項或8的多肽在制備一種疫苗用組合物中的用途。
19.權利要求17或18的用途，用于制備治療或預防禽腫瘤的組合物。
20.權利要求18的用途，其中疫苗是針對一種或多種致癌禽病毒。
21.權利要求20的用途，其中致癌性禽病毒選自馬力克氏病病毒、禽白血病病毒、勞氏相關病毒或網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增殖病毒中的一種或多種。
22.權利要求17至21任一項的用途，與另一種疫苗組合使用。
23.權利要求22的用途，其中另一種疫苗選自HVT和禽痘病毒。
24.含有權利要求1至6任一項或8的多肽以及一種可藥用賦形劑的組合物。
25.含有權利要求1至6任一項或8的多肽以及一種佐劑的組合物。
26.一種制備多肽的方法，包括在一種合適細胞中表達權利要求8至10任一項的核苷酸序列或其變異體，并純化多肽。
27.根據(jù)布達佩斯條約于1998年3月3日保藏在ECACC，UK的雜交瘤AV37，其保藏號為98030304。
28.權利要求27的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
29.權利要求7或28的單克隆抗體在一種鑒定多肽或其片段的方法中的用途。
30.用權利要求12至16任一項的多核苷酸載體結構物轉化的宿主細胞。
31.選自如下序列的核苷酸序列5’-TGG AAA GGA ACT GGA GTG-3’(SEQ ID No.6)5’-GCA AGC TGT GAA TTA GCC-3’(SEQ ID No.7)5’-CTG CTG CTT CTC CAG GAC ATT C-3’ (SEQ ID No.8)5’-ATT CCT TTC CCT CCT CTT CCA C-3’ (SEQ ID No.9)5’-AGA CTT CAG GAG GAG CAA C-3’ (SEQ ID No.10)5’-GCT TCA CAC ACC TTC TCA G-3’ (SEQ ID No.11)
32.權利要求31的一種或多種核苷酸序列作為引物在核酸擴增反應中的用途。
33.權利要求31的一種或多種核苷酸序列作為雜交探針在檢測權利要求9至11的核苷酸序列的變異體中的用途。
34.一種制備抗體的方法，包括提供權利要求1至6任一項或8的多肽或其片段或變異體；將該多肽或其片段或變異體給藥于一種哺乳動物來產(chǎn)生抗體應答，并從該哺乳動物獲得抗體。
35.一種制備能產(chǎn)生一種單克隆的雜交瘤的方法，包括提供權利要求1至6任一項或8的多肽或其片段或變異體；將該多肽或其片段或變異體給藥于一種哺乳動物來產(chǎn)生抗體應答，從該哺乳動物中獲得一種抗體產(chǎn)生細胞，并將它與一種永生細胞融合，形成一種能分泌單克隆抗體的雜交瘤。
36.通過權利要求34的方法獲得的抗體。
37.用權利要求35的雜交瘤制備的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼與禽腫瘤特別是馬力克氏病病毒相關的禽腫瘤有關的抗原的核酸和氨基酸序列。本發(fā)明還涉及這些序列在醫(yī)藥,特別是用于治療和預防禽腫瘤的組合物的制備中的用途。
文檔編號C12N15/12GK1307638SQ99808080
公開日2001年8月8日 申請日期1999年3月22日 優(yōu)先權日1998年4月29日
發(fā)明者S·C·布格斯, T·F·達維森, L·J·N·羅斯 申請人:動物健康研究所有限公司