猴病毒40衣殼蛋白vp1在作為細(xì)胞穿膜蛋白中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細(xì)胞穿膜蛋白中的應(yīng)用。猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于細(xì)胞質(zhì)中。將SV40 VPl蛋白與其它蛋白相融合，VPl可以把與其融合的外源蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，以基因治療、靶向蛋白質(zhì)藥物或多肽藥物為主的新的分子治療措施應(yīng)運(yùn)而生，但是這些治療手段往往以向細(xì)胞內(nèi)輸送大分子物質(zhì)為前提。由于細(xì)胞膜的選擇透過性作用，蛋白質(zhì)、多肽和DNA等極性強(qiáng)及分子量大的物質(zhì)不能自由穿過，必須借助特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制或一定的生物學(xué)手段才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。傳統(tǒng)的介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的技術(shù)包括電穿孔、微注射、病毒運(yùn)輸系統(tǒng)、反復(fù)凍融技術(shù)、脂質(zhì)體包裹等，但因?yàn)檫@些技術(shù)損傷性強(qiáng)、毒性大、效率低而在應(yīng)用上受到很大限制。另外，藥物進(jìn)入細(xì)胞后因?yàn)槿苊阁w的降解，實(shí)際利用度往往非常低。因此，尋找更加有效的運(yùn)輸載體是當(dāng)前藥物治療迫切需要解決的課題。
[0003]近二十年來，具有細(xì)胞穿透能力的蛋白質(zhì)與細(xì)胞穿透肽的發(fā)現(xiàn)給細(xì)胞內(nèi)藥物運(yùn)輸帶來了希望。細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或細(xì)胞穿透肽具有強(qiáng)大的細(xì)胞穿透能力，自身能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。到目前為止，許多細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或細(xì)胞穿透肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或細(xì)胞穿透肽可以分為兩大類:第一類需要與藥物共價(jià)連接后細(xì)胞攜帶藥物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞，第二類與藥物形成穩(wěn)定的非共價(jià)復(fù)合物，攜帶藥物進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或細(xì)胞穿透肽能夠可以攜帶多種物質(zhì)，包括親水性蛋白、多肽、DNA甚至顆粒性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，甚至可以攜帶其進(jìn)行細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，并且不受細(xì)胞類型的限制，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療學(xué)以及藥學(xué)等領(lǐng)域具有巨大潛力。在轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞后，能快速地從內(nèi)涵體中釋放，到達(dá)靶標(biāo)，具有高效性，沒有細(xì)胞毒作用，免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在物質(zhì)運(yùn)輸領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
[0004]目前一些具有穿透細(xì)胞膜功能的蛋白質(zhì)已經(jīng)用于外源物質(zhì)的運(yùn)輸，如HIV-1Tat蛋白、果蠅觸角足同源蛋白(pANTP)和HSV-1 VP22等。歷史上第一個(gè)顯示蛋白質(zhì)可能包含負(fù)責(zé)穿透細(xì)胞膜的序列是在1988年來自對(duì)HIV-1 Tat蛋白86個(gè)氨基酸長度的片段(Tat-86)被活細(xì)胞內(nèi)化的觀察。Frankel和Pabo發(fā)現(xiàn)HIV-1的轉(zhuǎn)錄激活因子Tat蛋白可以進(jìn)入細(xì)胞并轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核里。1991年P(guān)rochiantz研究小組證明60個(gè)氨基酸的果蠅觸角足蛋白(Drosophila Anten napedia homeoprotein, pANTP)能夠穿透細(xì)胞膜，被神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)化。這個(gè)研究工作是后來在1994年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)PTD或者叫CPP的起源。為了理解果蠅觸角蛋白的內(nèi)化驅(qū)動(dòng)力，對(duì)其同源域進(jìn)行點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)它的第三個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)是膜轉(zhuǎn)位的必要和充分條件，結(jié)果把這16個(gè)氨基酸長的CPP叫做穿透肽penetratin (RQIKIYFQNRRMKffKK)后來改稱為pAntp。很快其他CPPs例如HIV-1 Tat蛋白的基本序列，運(yùn)輸子嵌合多肽和人工合成的兩性分子模型多肽陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。
[0005]1998年Lebleu研究小組定義了 Tat被細(xì)胞攝取所需要的最小肽段序列(47YGRKKRRQRRR57)。1997年，Heitz和Divita研究小組設(shè)計(jì)出第一個(gè)非共價(jià)CPP運(yùn)輸核酸MPG進(jìn)入細(xì)胞,緊接著又利用Pep-1運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)和多肽進(jìn)入細(xì)胞。Wender和Futaki兩個(gè)研究小組證明聚精氨酸序列(ArgS)可以攜帶分子進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而提出它們的攝取機(jī)制包括精氨酸胍鹽基團(tuán)和細(xì)胞膜上的磷酸基團(tuán)的二氫鍵相互作用。CPP研究領(lǐng)域最重要的突破來自它們?cè)诨蝮w內(nèi)的第一個(gè)應(yīng)用。Dowdy研究小組利用CPP運(yùn)輸小肽和大蛋白質(zhì)進(jìn)入體，Lange利用運(yùn)輸子嵌合多肽運(yùn)輸PNAs。自此，許多其他的CPPs都被設(shè)計(jì)出來攜帶外源物質(zhì)跨過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。
[0006]猴病毒40(SV40)屬于多瘤病毒科，是最簡單的dsDNA病毒之一，也是基因治療的候選載體之一，相對(duì)其它載體，SV40病毒具有免疫原性低、容易生產(chǎn)、更高的專一性、高滴度、高轉(zhuǎn)染率等優(yōu)勢。SV40病毒顆粒為直徑約45nm的正二十面體結(jié)構(gòu)。病毒衣殼由360拷貝的VPl和約30-60拷貝的VP2與VP3構(gòu)成。其中主要衣殼蛋白VPl可以自組裝形成24nm正二十面體病毒樣顆粒，且能以與野生型病毒類似的途徑“侵染”細(xì)胞。本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)后純化獲得VPl蛋白，在不形成正二十面體顆粒結(jié)構(gòu)的情況下與多種細(xì)胞孵育，發(fā)現(xiàn)VPl能夠穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)VPl蛋白與其它外源蛋白融合表達(dá)，VPl可以把與其融合的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì)，實(shí)現(xiàn)目的蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0007]由于細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)在蛋白和藥物運(yùn)輸中的巨大優(yōu)勢和潛力，申請(qǐng)人研究發(fā)現(xiàn)了SV40 VPl能夠穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，是一種新的細(xì)胞穿透蛋白，進(jìn)一步利用VPl細(xì)胞膜穿透能力，使其攜帶外源蛋白如突光蛋白mCherry和抑癌蛋白P53進(jìn)入細(xì)胞,說明VPl能夠運(yùn)輸外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞，是一種優(yōu)良的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是在于提供了猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細(xì)胞穿膜肽中的應(yīng)用，包括其轉(zhuǎn)導(dǎo)外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞的應(yīng)用。大腸桿菌表達(dá)的猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種細(xì)胞穿透蛋白。同時(shí)，其能攜帶外源蛋白穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì)。是一種簡單高效的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0010]猴病毒40衣殼蛋白VPl (在本發(fā)明中或稱SV40VP1或VPl)基因，其制備步驟如下:
[0011]以pSV21SphI_Nl質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得猴病毒40衣殼蛋白VPl基因片段，即為SV40VP1，其序列為SEQ ID N0.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示。
[0012]PCR 使用的上游引物:VP1_S(NcoI):5 ' CAGACCATGGATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCTATGAAGATG 3 '，下游引物:VP1_A(SacI):5 ' GCTTGAGCTCGCACTGCATTCTAGTTGTGG 3 ^。將SV40 VPl基因用NcoI和SacI雙酶切插入到pET28a表達(dá)載體，獲得pET28a-hisVPl 質(zhì)粒。
[0013]猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細(xì)胞穿膜肽中的應(yīng)用，將純化的VPl蛋白加入三種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Vero細(xì)胞、Hela細(xì)胞、293T細(xì)胞)中，孵育，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，VPl蛋白穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并定位于細(xì)胞質(zhì)。
[0014]細(xì)胞穿透蛋白VPl轉(zhuǎn)導(dǎo)外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞的應(yīng)用，包括將SV40 VPl基因與外源蛋白基因連接表達(dá)后，攜帶外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞。
[0015]SV40 VPl攜帶mCherry蛋白穿膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì):
[0016](I)熒光蛋白mCherry基因通過SacI和XhoI雙酶切位點(diǎn)插入到pET28a_hisVPl載體上，構(gòu)建出質(zhì)粒pET28a_VPImCherry。
[0017](2)質(zhì)粒 pET28a_VPImCherry 轉(zhuǎn)化入 E.CoIi Rosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，獲得VPl-mCherry蛋白。
[0018](3)純化的VPl-mCherry蛋白加入培養(yǎng)于直徑35毫米小皿的Vero細(xì)胞中，冰上孵育，觀察mCherry的突光信號(hào),發(fā)現(xiàn)VPl-mCherry融合蛋白的突光信號(hào)位于細(xì)胞質(zhì)中。
[0019]SV40 VPl攜帶P53蛋白穿膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì):
[0020](1)P53蛋白的基因通過SacI和XhoI雙酶切位點(diǎn)插入到pET28a_hisVPl載體上，構(gòu)建出質(zhì)粒pET28a-VPlP53，雙酶切驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0021](2)質(zhì)粒 pET28a_VPlP53 轉(zhuǎn)化入 E.coll Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，獲得融合蛋白VP1-P53，其序列為SEQ ID N0.3所示。
[0022](3)純化的VP1-P53蛋白加入培養(yǎng)于直徑35毫米小皿的Vero細(xì)胞中，冰上孵育，免疫熒光測定發(fā)現(xiàn)VP1-P53進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于細(xì)胞質(zhì)。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具體以下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0024]本研究首次發(fā)現(xiàn)猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并定位于細(xì)胞質(zhì)中，是一種新的細(xì)胞穿透蛋白?；赩Pl蛋白可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的功能，如果VPl蛋白與其它蛋白相融合，VPl可以把與其融合的外源蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì)。以熒光蛋白mCherry和抑癌蛋白P53為模型，說明了 VPl可以攜帶熒光蛋白mCherry或P53蛋白穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞并定位于細(xì)胞質(zhì),所以本發(fā)明提供了一種簡單高效的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，并且實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞質(zhì)中的亞細(xì)胞定位。另外，所構(gòu)建的VP1-P53蛋白還有望在腫瘤靶向治療等方面有所應(yīng)用。
【附圖說明】
[0025]圖1-a pET28a-hisVPl酶切鑒定電泳圖譜。
[0026]泳道1: DNA Marker ;泳道 2: pET28a_hisVPl 質(zhì)粒用 NcoI 和 SacI 雙酶切。。
[0027]圖1-b pET28a_VPlmCherry酶切鑒定電泳圖譜。
[0028]泳道1:DNA Marker ;泳道 2:pET28a_VPImCherry 質(zhì)粒用 SacI 和 XhoI 雙酶切。
[0029]圖1-c pET28a_VPlP53酶切鑒定電泳圖譜。
[0030]泳道1:DNA Marker ;泳道 2:pET28a_VPlP53 質(zhì)粒用 SacI 和 XhoI 雙酶切。
[0031]圖2聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的蛋白質(zhì)。
[0032]泳道a:VPl蛋白，泳道b:融合蛋白VPl-mCherry,泳道c:融合蛋白VPl_p53。