（〇. 02MNa-Citrate，0. 8MNaCL，甘氨酸1.0%(wt%)， 0.015MCaCL2，PH6.90-7.10)洗滌柱子，再用洗脫緩沖液（0.01MNa-Citrate，甘氨酸 0· 1% (wt%)，（λ002MCaCL2，PH6. 90-7. 10)洗脫，收集高純FVIII溶液；用（λ45μπι濾 芯過濾以上洗脫液； 6,用10Κ分子量的超濾膜（0. 1Μ2)濃縮以上濾液，然后恒體積透析5倍，再次濃縮；后 移出超濾膜包并后洗膜包，測得FVIII效價為35. 3IU/ml; 7,以上濃縮液加入WFI，將FVIII效價調至30IU/ml，后加入甘氨酸至2%(wt%)，后 調PH值至 6. 90-7. 10 ; 8-11，同實施例一。
[0019]表FVIII試制品收率及比活數(shù)據(jù)統(tǒng)計
【主權項】
1. 一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 冷沉淀溶解 按1:4-10的重量比，將冷沉淀投入預先配制的溶解緩沖液中，溫度控制在15-30°c， 攪拌1. 5-3小時，使其充分溶解； (2) 氫氧化鋁凝膠吸附與壓濾 步驟（1)所得到的溶解液中加入A1 (OH) 3凝膠，充分攪拌0. 5-1. 5小時，然后用頗爾公 司生產(chǎn)的Supradur50P濾板串聯(lián)1. 0μm濾芯過濾，收集澄清濾液，過濾前用步驟（1)所 述溶解緩沖液預洗濾板及濾芯； (3) S/D病毒滅活 步驟（2)所收集的濾液中加入Tween80至1. 0% (wt%)，TNBP(磷酸三丁酯）至0. 3% (wt%)，攪勻后升溫至24-26Γ，后保溫6-8小時，然后用0. 45μm濾芯澄清過濾，收集濾 液； (4) 陰離子交換柱層析 步驟（3)所收集的濾液上陰離子交換柱，柱子預先用平衡緩沖液A充分平衡，上柱結 束后，用平衡緩沖液A沖洗柱子，后用洗滌緩沖液A洗滌柱子，再用洗脫緩沖液A洗脫柱 子，收集洗脫液即為純化的FVIII溶液，及時用0. 45μm濾芯進行過濾，收集濾液； (5) 疏水柱層析 步驟（4)所收集的濾液中加入氯化鈉至1. 8M-2. 0M，然后上疏水柱，柱子預先用平衡 緩沖液B充分平衡，上柱結束后用平衡緩沖液B沖洗柱子，后用洗滌緩沖液B洗滌柱子， 再用洗脫緩沖液B洗脫柱子，收集洗脫液即為高純FVIII溶液；用0.45μπι或0. 22μπι濾 芯過濾以上洗脫液； (6)超濾 用超濾膜包濃縮以上濾液，然后恒體積透析5-7倍，再濃縮至FVIII效價高于35IU/ml;后移出超濾膜包并后洗膜包； (7) 加穩(wěn)定劑及調節(jié) 將FVIII效價調至所需值(一般規(guī)格為20-30IU/ml)，加入穩(wěn)定劑，后調PH值至 6. 50-7. 50 ； (8) 納米膜除病毒過濾 用0. 1ym濾芯串聯(lián)15-20納米濾芯進行除病毒過濾； (9) 除菌過濾及分裝 用0. 22μm濾芯對廣品進彳丁除囷過濾并分裝； (10) 凍干； (11) 干熱病毒滅活 在KKTC沸水浴中保溫0. 5-1小時，進行干熱病毒滅活。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (1)所述的溶解緩沖液由TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、氯化鈉、甘氨酸、肝素鈉及水組成，所 述的溶解緩沖液中TRIS的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 1M-0. 15M，甘氨酸的 濃度為〇. 5-1. 5%(wt%)，肝素鈉的加入量為2000-8000IU/升，所述的溶解緩沖液的PH值 為 6. 50-7. 50。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (2)所述的氫氧化鋁凝膠的加入量為80-160克/千克懸浮液。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (4)所述的陰離子交換柱充填的樹脂為DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、Qsepharose FF、CaptoQ及QSepharoseHP中的任意一種。5. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (4) 所述的平衡緩沖液A、洗滌緩沖液A及洗脫緩沖液A均由檸檬酸鈉、氯化鈉、甘氨酸、 氯化鈣及水組成；所述的平衡緩沖液A中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃 度為0. 075M-0. 15M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為0. 005M-0. 015M， PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗滌緩沖液A中，檸檬酸鈉的濃度為0.01M-0.02M，氯化鈉 的濃度為〇. 2M-0. 3M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為0. 005M-0. 015M， PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脫緩沖A液中，檸檬酸鈉的濃度為0.01M-0.02M，氯化鈉 的濃度為〇. 5M-2. 0M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為0. 001M-0. 005M， PH值為PH6. 50-7. 50。6. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步 驟（5)所述的疏水柱的填料為CaptoPhenyl(LS),PhenylSepharose6FF(LS),Octyl Sepharose4FF中的任意一種。7. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (5) 所述平衡緩沖液B、洗滌緩沖液B均由檸檬酸鈉、氯化鈉、甘氨酸、氯化鈣及水組成； 所述的平衡緩沖液B中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為1. 8M-2M，甘 氨酸的濃度為〇. 5-1.5% (wt%)，氯化鈣的濃度為0. 01M-0. 02M，PH值為PH6. 50-7. 50 ; 所述的洗滌緩沖液B中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 6M-1. 6M， 甘氨酸的濃度為〇. 5-1.5%(wt%)，氯化鈣的濃度為0. 01M-0. 02M，PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脫緩沖液B由檸檬酸鈉、甘氨酸、氯化鈣及水組成；所述的洗脫緩沖液B中， 檸檬酸鈉的濃度為〇. 005M-0. 01M，甘氨酸的濃度為0. 1-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為 0· 001M-0. 003M，PH值為PH6. 50-7. 50。8. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (6) 所述的超濾膜包的超濾膜截留分子量為10K-30K。9. 根據(jù)權利要求1所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：步驟 (7) 所述的穩(wěn)定劑為甘氨酸、組氨酸、亮氨酸及谷氨酸中的一種或幾種組合，所述甘氨酸的 加入量為〇. 5-3% (wt%)，所述組氨酸的加入量為0. 5-3% (wt%)，所述亮氨酸的加入量為 0. 1-3% (wt%)，所述谷氨酸的加入量為0.1-3% (wt%)。10. 根據(jù)權利要求1-9所述的一種高純人凝血因子VIII的制備方法，其特征在于：人 凝血因子VIII產(chǎn)品在整個制備流程中經(jīng)過S/D、納米膜過濾及干熱三步病毒滅除步驟。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從人血漿組分冷沉淀中制備高純人凝血因子VIII的方法，包括如下步驟：(1）冷沉淀的溶解；(2）氫氧化鋁凝膠吸附與壓濾；(3）S/D病毒滅活；(4)陰離子交換樹脂柱層析；(5）疏水柱層析；(6）超濾透析及濃縮；(7）加穩(wěn)定劑及效價調節(jié)；(8）納米膜除病毒過濾；(9）除菌過濾及分裝；(10）凍干；(11）干熱病毒滅活。本發(fā)明采用兩步柱層析工藝純化人凝血因子VIII，制得高純度的產(chǎn)品，比活可達3OO？IU/mg左右，遠高于傳統(tǒng)工藝約50？IU/mg的水平，產(chǎn)品的外觀及熱穩(wěn)定性明顯改善；制備過程中采用三種病毒滅除方式使產(chǎn)品的臨床使用安全性大大提高。
【IPC分類】C07K14/755, C07K1/20, C07K1/22, C07K1/18, C07K1/36, C07K1/30, C07K1/34
【公開號】CN105348382
【申請?zhí)枴緾N201510879625
【發(fā)明人】李春洲
【申請人】上海洲躍生物科技有限公司
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月5日