專利名稱：凝血因子ix組合物及其制備和使用方法
凝血因子IX組合物及其制備和使用方法關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明在由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院授予的SBIR基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2009年8月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/236，493 ;2009年8月25日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/236，836，2009年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/280，955，2009年11月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 61/280，956，以及2010年2 月3日提交的美國(guó)申請(qǐng)No. 12/699，761的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所有這些申請(qǐng)，以及在代理人案號(hào)32808-719. 201下隨同提交的共同待決的申請(qǐng)，為了所有目的其全部?jī)?nèi)容以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
在血友病中，凝血受到缺乏某些血漿凝血因子的干擾。人因子IX(FIX)是一種絲氨酸蛋白酶的酶原，它是凝血級(jí)聯(lián)的內(nèi)源性途徑的一個(gè)重要組分。在沒有FIX缺乏的個(gè)體中，F(xiàn)IX的平均半衰期很短，約為18-24小時(shí)。在大約1/30000男性中發(fā)生的X-連鎖疾病引起的功能FIX缺陷導(dǎo)致血友病B，也稱為Christmas病，是以一位被發(fā)現(xiàn)缺乏該因子的叫做St印hen Christmas的年輕男孩命名的。已經(jīng)記載了超過100個(gè)因子IX的突變；其中一些不引起癥狀，但許多導(dǎo)致明顯的出血性疾病。如果不及時(shí)治療，血友病B與損傷后無法控制的肌肉、關(guān)節(jié)和體腔內(nèi)的出血有關(guān)，并可能導(dǎo)致死亡。此前，該疾病的治療包括施用由來自供體庫的人血漿制備的FIX，這具有隨之而來的感染血源性病毒的風(fēng)險(xiǎn)，包括人類免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)。最近，重組FIX產(chǎn)品已經(jīng)市售。外來提供的因子IX的體內(nèi)活性受到蛋白質(zhì)半衰期和凝血抑制劑(包括抗凝血酶III)的限制。因子IX組合物通常有短半衰期，這需要經(jīng)常注射。此外，目前的基于FIX的療法由于較差的生物利用度，需要靜脈內(nèi)施用。因此，需要當(dāng)作為血友病(包括血友病B)的預(yù)防和/或治療方案的一部分施用時(shí)具有延長(zhǎng)的半衰期和保留活性的因子IX組合物。因子VII是在肝臟中合成且作為具有約50kDa的分子量的單鏈酶原分泌入血中的凝血因子蛋白。FVII酶原通過蛋白水解性裂解被轉(zhuǎn)化成活化形式(FVIIa)，并且該活性形式當(dāng)與組織因子(TF)絡(luò)合時(shí)能夠?qū)⒁蜃覫X和因子X轉(zhuǎn)化成它們的活性形式，導(dǎo)致快速凝血酶產(chǎn)生和血纖蛋白形成。因?yàn)閞FVIIa的循環(huán)半衰期約2. 3小時(shí)(“Summary Basis forApproval for NovoSeven ”，F(xiàn)DA參考號(hào)96-0597)，所以對(duì)于血友病受試者和具有因子VII缺陷的受試者的出血病癥的治療，需要多次施用和頻繁施用。對(duì)治療蛋白的化學(xué)修飾可以降低其體內(nèi)清除率并隨后增加血清半衰期。常見修飾的一個(gè)實(shí)例是添加聚乙二醇(PEG)部分，聚乙二醇(PEG)部分通常通過PEG上與胺基(例如賴氨酸側(cè)鏈或N端)反應(yīng)的醛或N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)基團(tuán)而與蛋白質(zhì)偶聯(lián)。然而，偶聯(lián)步驟可導(dǎo)致需要分離的不均一產(chǎn)物混合物的形成，導(dǎo)致明顯的產(chǎn)物損失和生產(chǎn)復(fù)雜性，并且得不到化學(xué)上完全均一的產(chǎn)物。而且，如果治療蛋白結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸側(cè)鏈被PEG化過程所修飾，那么治療蛋白的藥理學(xué)功能可能受阻。Fe結(jié)構(gòu)域與治療蛋白的融合是增加治療蛋白大小，因此降低通過腎的清除率的另一種方法。此外，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域賦予結(jié)合溶酶體并通過FcRn受體從溶酶體再循環(huán)的能力，這導(dǎo)致增加的藥代動(dòng)力學(xué)半衰期。不幸的是，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域未能在重組表達(dá)期間有效折疊，并易于形成被稱為包涵體的不溶性沉淀。這些包涵體必須被溶解并且功能性蛋白質(zhì)必須從錯(cuò)誤折疊的聚集物復(fù)性，這種過程是耗時(shí)、低效且昂貴的。因此，依然需要具有增加半衰期的改善的凝血因子組合物，其能夠以較低頻率施用，和/或通過更簡(jiǎn)單的過程以更低成本生產(chǎn)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于治療或改善病癥或增強(qiáng)與施用凝血因子IX和/或VII相關(guān)的參數(shù)的組合物和方法。具體地，本發(fā)明提供了包含一種或多種延伸重組多肽(XTEN)的融合蛋白的組合物。主題XTEN通常為非重復(fù)序列和非結(jié)構(gòu)化構(gòu)象。XTEN與選自因子IX (“FIX”)、因子VII( “FVII”)、因子VII-因子IX雜種和其序列變體的凝血因子(“CF”)連接，形成凝血因子-XTEN融合蛋白(“CFXTEN”)。在某種程度上，本公開涉及包含融合蛋白的藥物組合物及其用于治療凝血因子相關(guān)的疾病、病癥或疾患。CFXTEN組合物與未連接XTEN的 CF相比具有增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，其可允許更便利的給藥和改善的藥效。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的CFXTEN組合物不具有選自以下的組分聚乙二醇(PEG)、白蛋白、抗體和抗體片段。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的因子IX融合蛋白，其包含與選自表I的氨基酸序列具有至少約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %同一性的因子IX序列。具有這種序列同一性的因子IX進(jìn)一步與具有至少約100至約3000個(gè)氨基酸殘基的延伸重組多肽(XTEN)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，XTEN與FIX或FVII CF的C-端連接。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的因子VII融合蛋白，其包含與選自表2的氨基酸序列具有至少約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %同一性的因子VII。具有這種序列的因子VII與延伸重組多肽(XTEN)連接。具有連接單個(gè)XTEN的單個(gè)FIX或單個(gè)FVII的CFXTEN的非限制性實(shí)例示于表41中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了與來自表41的CFXTEN相比具有至少約80%序列同一性，或者與來自表41的CFXTEN相比具有至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或約 100%序列同一性的CFXTEN組合物。在一些實(shí)施方案中，融合蛋白的CF和XTEN組分經(jīng)由可通過蛋白酶(包括內(nèi)源性哺乳動(dòng)物蛋白酶)裂解的裂解序列連接。這類蛋白酶的實(shí)例包括但不限于FXIa、FXIIa、激肽釋放酶、FVIIa、FIXa, FXa、凝血酶、彈性蛋白酶_2、粒酶B、MMP-12、MMP-13、MMP-17或MMP-20、TEV、腸激酶、鼻病毒3C蛋白酶和分選酶A，或選自表7的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有裂解序列的CFXTEN組合物與來自表42的CFXTEN相比具有至少約80%序列同一性的序列，或者與來自表42的CFXTEN相比具有至少約81%、82%、83%、84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99 %，或約100 %序列同一性。然而，本發(fā)明還提供了用表I或表2的任一個(gè)CF序列替換表42的序列中的CF，以及用表4的任一個(gè)XTEN序列替換表42的序列中的XTEN，以及用表7的任何裂解序列替換表42的序列中的裂解序列。在具有裂解序列的CFXTEN實(shí)施方案中，通過蛋白酶從CF釋放XTEN而裂解該裂解序列。在前述的一些實(shí)施方案中，一旦CF組分通過裂解序列的裂解而從XTEN釋放，它就會(huì)變得具有生物活性或活性增加，其中促凝活性與未連接XTEN的相應(yīng)的FIX或FVII相比至少為約30 %、或至少約40 %、或至少約50 %、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%。本發(fā)明提供了分離的CFXTEN融合蛋白，其包含約36至約3000個(gè)氨基酸殘基的第
二XTEN，該第二 XTEN可以與第一 XTEN相同或可以不同，其中所述第二 XTEN可以加入CF的任何兩個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)域之間，即在Gla、EFGl、EGF2、活化肽和蛋白酶結(jié)構(gòu)域之間，或加入CF的結(jié)構(gòu)域序列的現(xiàn)有環(huán)狀結(jié)構(gòu)域的序列內(nèi)，如實(shí)施例中更完全描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二 XTEN可以是選自表4或9-13中任一者的氨基酸序列，或可以與選自表4和9_13的序列相比表現(xiàn)出至少至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%序列同一性。在另一實(shí)施方案中，分離的融合蛋白包含約36至約3000個(gè)氨基酸殘基的第二 XTEN。融合蛋白可采用表6的多-XTEN構(gòu)型或其變體。本發(fā)明提供了包含連接因子VII的XTEN的CFXTEN組合物，該因子VII包含可通 過相同或不同的促凝蛋白酶裂解的一個(gè)或多個(gè)異源裂解序列。在前述的一些實(shí)施方案中，因子VII包含加入或替換FVII序列部分的因子XI的異源序列，形成了因子VII-因子IX雜種序列變體。在一些實(shí)施方案中，將來自FIX活化肽結(jié)構(gòu)域的部分或整個(gè)序列加入或替換橋連FVII組分的EFG2和蛋白酶結(jié)構(gòu)域之間結(jié)構(gòu)域的FVII序列，形成可以活化為凝血級(jí)聯(lián)內(nèi)源性系統(tǒng)的部分(例如，活化因子XI)的組合物。在這類情況中，因子VII-因子IXCFXTEN組合物可以在不存在組織因子的情況下由促凝蛋白酶活化，使得當(dāng)這類因子缺乏時(shí)(例如，在血友病A或B中)或當(dāng)存在對(duì)這些因子的抑制劑時(shí)，CFXTEN可以在內(nèi)源性凝血途徑中充當(dāng)因子VIII和IX的旁路。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VII-FIX序列變體加入全長(zhǎng)FIXAP結(jié)構(gòu)域加上至少約2個(gè)、或至少約3個(gè)、或至少約4個(gè)、或至少約5個(gè)、或至少約6個(gè)、或至少約7個(gè)、或至少約8個(gè)、或至少約9個(gè)、或至少約10個(gè)、或至少約11個(gè)、或至少約12個(gè)或更多氨基酸，該氨基酸側(cè)連在FIX AP結(jié)構(gòu)域的R145-A146和R180-V181裂解位點(diǎn)的一側(cè)或兩側(cè)上的氨基酸殘基(例如，在12個(gè)側(cè)翼氨基酸在N端側(cè)而5個(gè)側(cè)翼氨基酸在C端側(cè)的情況中，序列 RVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE)。在另一實(shí)施方案中，在最佳比對(duì)時(shí)，CFXTEN FVII-FIX序列變體包含與序列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV 相比表現(xiàn)出至少至少約 80 %、或至少約 90 %、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或100%同一性的異源FIX序列。在其它實(shí)施方案中，CFXTEN包含加入FIX AP的一部分的FVII-FIX序列變體，該FIX AP部分包括位于R145-A146裂解位點(diǎn)的一側(cè)或兩側(cè)的至少約2個(gè)、或至少約3個(gè)、或至少約4個(gè)、或至少約5個(gè)、或更多氨基酸的序列(例如，在6個(gè)側(cè)翼氨基酸在裂解位點(diǎn)任一側(cè)上的情況中，序列TSKLTRAETVFP)，或位于R180-V181裂解位點(diǎn)的一側(cè)或兩側(cè)的至少約2個(gè)、或至少約3個(gè)、或至少約4個(gè)、或至少約5個(gè)或更多氨基酸的序列(例如，在4個(gè)氨基酸在N端側(cè)翼上且纈氨酸作為來自FIX的裂解位點(diǎn)的C端的情況中的序列和DFTRV)。在前述的一個(gè)實(shí)施方案中，在最佳比對(duì)時(shí)，CFXTENFVII-FIX序列變體包含與選自TSKLTRAETVFP和FNDFTRV的序列相比表現(xiàn)出至少至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或100%同一性的異源FIX序列。
在另一實(shí)施方案中，CFXTEN包含上文所公開的FVII-FIX序列變體，該FVII-FIX序列變體進(jìn)一步包括與FVII組分C端和融合蛋白的XTEN組分之間的連接子相同的AP裂解序列，例如，F(xiàn)VII變體-AP序列-XTEN的N端至C端構(gòu)型，由此當(dāng)由與FVII向FVIIa轉(zhuǎn)變的促凝蛋白酶相同的促凝蛋白酶裂解時(shí)，允許FVII變體組分從CFXTEN融合蛋白中釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，任何前述實(shí)施方案的FVII-FIX CFXTEN都包括作為FVII-FIX序列和XTEN之間的連接子的因子XI裂解序列KLTRAET，由此使FVII變體組分從CFXTEN融合蛋白通過啟動(dòng)內(nèi)源 性凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)而釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有與來自表43的序列相比表現(xiàn)出至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%序列同一性的FVII-FIX雜種序列的CFXTEN。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有加入的FIX-衍生的AP裂解序列的FVII-FIX序列變體，所述AP裂解序列未連接XTEN。在一個(gè)實(shí)施方案中，不含XTEN的FVII-FIX序列與來自表43的不含XTEN的序列相比表現(xiàn)出至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%序列同一性。在CFXTEN組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式I的融合蛋白(XTEN) X-CF- (XTEN) y I其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，CF是凝血因子；x是O或I且y是O或1，其中x+y彡I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式II的融合蛋白(XTEN) x- (CF) - (S) y- (XTEN) y 11其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，CF是凝血因子a ；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列；x是O或I且y是O或1，其中x+y ^ I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白是式III (XTEN) x-⑶ x- (CF)-⑶「(XTEN) y III其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，CF是凝血因子；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列；x是O或I且y是O或I,其中x+y > I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式IV的分離融合蛋白(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (XTEN) w_ (AP) - (XTEN) x- (Pro) - (S)y- (XTEN) z IV其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，Gla是FIX的Gla結(jié)構(gòu)域；EGF1是FIX的EGFl結(jié)構(gòu)域；EGF2是FIX的EFG2結(jié)構(gòu)域；AP是FIX的激活肽；PR0是FIX的蛋白酶結(jié)構(gòu)域；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列；u是O或I ;v是O或I ;x是O或l;y是O或l;z是O或1，條件是u+v+w+x+z彡I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式V的分離的融合蛋白(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (API) - (XTEN) w- (AP2) - (XTEN)x-(Pro)-(S)y-(XTEN)z V其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，Gla是FIX的Gla結(jié)構(gòu)域；EGF1是FIX的EGFl結(jié)構(gòu)域；EGF2是FIX的EFG2結(jié)構(gòu)域；AP1是FIX的激活肽結(jié)構(gòu)域的N端序列部分，其包括AP結(jié)構(gòu)域的第一天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽結(jié)構(gòu)域的C端序列部分，其包括AP結(jié)構(gòu)域的第二天然裂解序列；PRO是FIX蛋白酶結(jié)構(gòu)域；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列；11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1;2是0或1，條件是u+v+w+x+z彡I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式VI的分離融合蛋白
(Gla) - (XTEN) u_ (EGFl) - (XTEN) v_ (EGF2) - (XTEN) w- (Pro) - (S) x- (XTEN) y VI其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，Gla是FVII的Gla結(jié)構(gòu)域；EGF1是FVII的EGFl結(jié)構(gòu)域；EGF2是FVII的EFG2結(jié)構(gòu)域；PR0是FVII的蛋白酶結(jié)構(gòu)域；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列；11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1，條件是u+v+w+y彡I ;且XTEN是延伸重組多肽。在CFXTEN組合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了式VII的分離融合蛋白(Gla) - (XTEN) t_ (EGFl) - (XTEN) u_ (EGF2) - (API) v_ (XTEN) w- (AP2) x- (Pro) - (S)y-(XTEN)z VII其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地，Gla是FVII的Gla結(jié)構(gòu)域；EGF1是FVII的EGFl結(jié)構(gòu)域；EGF2是FVII的EFG2結(jié)構(gòu)域；PR0是FVII的蛋白酶結(jié)構(gòu)域；AP1是FIX的激活肽結(jié)構(gòu)域的N端序列部分，其包括天然裂解序列；AP2是FIX的激活肽結(jié)構(gòu)域的C-端序列部分，其包括天然裂解序列；S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包括裂解序列4是0或1;11是0或1^是0或1;1是0或1;7是0或1;2是0或1，條件是t+u+w+z彡I ;且XTEN是延伸重組多肽。在該實(shí)施方案中，CFXTEN組合物可以包含整個(gè)所述FIX激活肽結(jié)構(gòu)域序列、或來自因子IX的激活肽結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩個(gè)裂解序列，例如，如上文更完全描述的，位于R145-A146裂解位點(diǎn)側(cè)翼的至少約3至約12個(gè)氨基酸的序列，以及位于R180-V181裂解位點(diǎn)側(cè)翼的至少約I至約5個(gè)氨基酸的序列。本發(fā)明還涵蓋表7中任何其它裂解序列替換AP裂解序列。使用本文所公開的任何適當(dāng)?shù)捏w外測(cè)定(例如，表40的測(cè)定或?qū)嵤├兴龅臏y(cè)定)，可以評(píng)估本文所述的實(shí)施方案的CFXTEN組合物的保留活性(包括在任何加入的XTEN-釋放裂解位點(diǎn)裂解后)，以確定該構(gòu)型在治療凝血-因子相關(guān)的疾病、疾患或病癥中用作治療劑的適合性。在一個(gè)實(shí)施方案中，CFXTEN與未連接XTEN的天然CF相比表現(xiàn)出至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%的活性。在另一實(shí)施方案中，通過酶促裂解連接CF和XTEN組分的加入的裂解序列而從CFXTEN釋放的CF組分與未連接XTEN的天然CF相比表現(xiàn)出至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%的活性。所述CFXTEN組合物的XTEN具有至少約200、或至少約400、或至少約800、或至少約900、或至少約1000、或至少約2000，最多約3000個(gè)氨基酸殘基。所述CFXTEN融合蛋白組合物的XTEN的特征在于它們具有下列特征的一種或多種(a)至少第一 XTEN包含顯示與類似長(zhǎng)度的選自表4所示序列的氨基酸序列具有至少約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97%、或約98%、或約99%同一性的至少約200個(gè)連續(xù)氨基酸；(b)當(dāng)通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析時(shí)，所述XTEN序列缺少預(yù)測(cè)的T細(xì)胞表位，其中所述ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法對(duì)所述XTEN序列中表位的預(yù)測(cè)是基于_5、或-6、或-7、或-8、或-9或更高的評(píng)分；(c)所述XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或甚至更小的序列評(píng)分；(d)天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的總和小于所述XTEN總氨基酸序列的10%; (e)蛋氨酸和色氨酸殘基的總和小于所述XTEN總氨基酸序列的2% ; (f)通過GOR算法確定，所述XTEN具有大于90%的無規(guī)卷曲形成、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %的無規(guī)卷曲形成；(g)如通過Chou-Fasman算法確定，所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折疊；和(h)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)殘基的總和構(gòu)成所述XTEN的總氨基酸殘基的超過約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99%。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于 天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的總和小于所述XTEN的總氨基酸序列的10%，甲硫氨酸和色氨酸 殘基的總和小于所述XTEN總氨基酸序列的2 %，所述XTEN序列具有小于5 %的帶正電荷的氨基酸殘基，通過GOR算法確定所述XTEN序列具有大于90 %的無規(guī)卷曲形成、或約95 %、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%的無規(guī)卷曲形成；并且通過Chou-Fasman算法確定所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折疊。在一些實(shí)施方案中，沒有一種類型的氨基酸構(gòu)成超過30 %的CFXTEN的XTEN序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于XTEN序列的至少約80 %、或至少約90 %、或至少約91%、或至少約92 %、或至少約93 %、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%由非重疊序列基序組成，其中每個(gè)序列基序具有約9至約14個(gè)氨基酸殘基，并且其中任何兩個(gè)連續(xù)氨基酸殘基的序列在每個(gè)序列基序中出現(xiàn)不超過兩次，所述序列基序由選自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、谷氨酸(E)和脯氨酸⑵的4至6個(gè)類型的氨基酸組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述XTEN特征在于至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%的XTEN序列由非重疊序列基序組成，其中所述基序選自表3。在一些實(shí)施方案中，所述XTEN具有其中沒有三個(gè)連續(xù)氨基酸是相同的序列，除非所述氨基酸是絲氨酸，在這種情況下，不超過三個(gè)連續(xù)氨基酸是絲氨酸殘基。在其它實(shí)施方案中，所述CFXTEN的XTEN組分具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或更小的序列得分。在該段的實(shí)施方案中，所述XTEN特征為“基本上非重復(fù)的”。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含至少第二 XTEN的CFXTEN，其中所述XTEN序列與來自表4、表9、表10、表11、表12或表13的序列相比表現(xiàn)出至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%序列同一性。在一些實(shí)施方案中，CFXTEN融合蛋白與未連接XTEN的CF相比表現(xiàn)出增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，其中增強(qiáng)的性質(zhì)包括但不限于與未連接XTEN的CF相比更長(zhǎng)的終末半衰期、更大的曲線下面積、血藥濃度在治療窗內(nèi)維持時(shí)間的增加、連續(xù)劑量之間的時(shí)間的增加導(dǎo)致血藥濃度在治療窗內(nèi)、和隨時(shí)間的可施用的摩爾劑量的降低，仍會(huì)導(dǎo)致血藥濃度在組合物的治療窗內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，施用給受試者的CFXTEN融合蛋白的終末半衰期增加至以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的CF的終末半衰期的至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍、或至少約100倍、或甚至更高。在其它實(shí)施方案中，施用給受試者的CFXTEN融合蛋白的終末半衰期為至少約12h、或至少約24h、或至少約48h、或至少約72h、或至少約96h、或至少約120h、或至少約144h、或至少約21日或更長(zhǎng)。在其它實(shí)施方案中，增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)由以下事實(shí)反映=CFXTEN融合蛋白在給定時(shí)段在治療窗內(nèi)維持的血藥濃度是以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的CF的至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍、或至少約100倍。與未連接XTEN的相應(yīng)CF相比，半衰期和治療窗內(nèi)維持時(shí)間的增加允許較低頻率的給藥和施用給受試者的融合蛋白量(以摩爾當(dāng)量表示)的減少。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用治療-有效劑量方案向受試者施用CFXTEN導(dǎo)致融合蛋白的血藥水平的至少兩個(gè)連續(xù)Cmax峰和/或Cmin谷之間的時(shí)間增加至使用類似劑量方案施用給受試者的未連接至XTEN的CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍、或至少約100倍，或更高。在一些實(shí)施方案中，與未連接XTEN的生物活性蛋白相比，與XTEN連接時(shí)XTEN增 強(qiáng)了 CF的熱穩(wěn)定性，其中熱穩(wěn)定性通過在暴露于約37°C的溫度下至少約7天之后測(cè)量生物活性的保留來確定。在前述一個(gè)實(shí)施方案中，與未連接XTEN的CF相比，生物活性保留時(shí)間增加至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約100%、或約150%、至少約200%、至少約300%或約500%。在一些實(shí)施方案中，構(gòu)造分離的融合蛋白使之與未連接XTEN的相應(yīng)CF相比具有降低的對(duì)清除受體的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，CFXTEN融合蛋白對(duì)CF的清除受體表現(xiàn)出如下范圍的結(jié)合親和力未連接XTEN的相應(yīng)CF的結(jié)合親和力的約O. 01 % -30%、或約O. 1%至約20%、或約1%至約15%、或約2%至約10%。在另一實(shí)施方案中，親和力降低的CFXTEN融合蛋白可以具有降低的活性清除和相應(yīng)的半衰期增加，半衰期是未連接XTEN的相應(yīng)CF的至少約3倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約12倍、或至少約15倍、或至少約17倍、或至少約20倍、或至少約30倍、或至少約50倍、或至少約100倍。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 CFXTEN融合蛋白，其中CFXTEN在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出溶解度增加至未連接XTEN的CF的溶解度的至少3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。在一些實(shí)施方案中，通過尺寸排阻色譜測(cè)定，CFXTEN融合蛋白表現(xiàn)出與實(shí)際分子量相比增加的表觀分子量。在某些實(shí)施方案中，包含F(xiàn)IX和至少第一 XTEN的CF表現(xiàn)出至少約400kD、或至少約500kD、或至少約700kD、或至少約1000kD、或至少約1400kD、或至少約1600kD、或至少約1800kD、或至少約2000kD的表觀分子量，而融合蛋白的每個(gè)FIX組分的實(shí)際分子量為約50kD且融合蛋白的分子量的范圍為約70至約125kDa。在其它實(shí)施方案中，包含F(xiàn)VII和至少第一 XTEN的CF表現(xiàn)出至少約400kD、或至少約500kD、或至少約700kD、或至少約1000kD、或至少約1400kD、或至少約1600kD、或至少約1800kD、或至少約2000kD的表觀分子量，而融合蛋白的每個(gè)FIX組分的實(shí)際分子量為約50kD且融合蛋白的分子量為約70至約125kDa。因此，CFXTEN融合蛋白的表觀分子量可以是融合蛋白的實(shí)際分子量的約6倍、或約8倍、或約10倍、或約12倍、或約15倍。在一些情況下，本文所公開的任何實(shí)施方案的分離的CFXTEN融合蛋白在生理?xiàng)l件下表現(xiàn)出大于約4、或約5、或約6、或約7、或約8、或約10、或大于約15的表觀分子量因子。在一些實(shí)施方案中，治療有效劑量的式I-VII之一的融合蛋白施用給有相應(yīng)需要的受試者可以導(dǎo)致在融合蛋白治療窗內(nèi)維持的時(shí)間增加至以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)CF的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍或更多。在其它情況下，治療有效劑量的式I-VII的實(shí) 施方案的融合蛋白施用給有相應(yīng)需要的受試者可以導(dǎo)致與以類似劑量施用的未連接XTEN的CF相比，維持治療有效劑量方案所必需的連續(xù)劑量之間時(shí)間增加至少48h、或至少72h、或至少約96h、或至少約120h、或至少約7天、或至少約14天、或至少約21天。所公開的組合物的融合蛋白可以被設(shè)計(jì)為具有不同構(gòu)型，CF的N端至C端和XTEN以及任選的間隔區(qū)序列，包括但不限于XTEN-CF、CF-XTEN、XTEN-S-CF, CF-S-XTEN、XTEN-CF-XTEN、CF-CF-XTEN、XTEN-CF-CF, CF-S-CF-XTEN、XTEN-CF-S-CF 及其多聚體。如本文所公開的，構(gòu)型的選擇可以賦予特定的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、理化性質(zhì)或藥理性質(zhì)，包括就加入的裂解序列而言、CF的釋放伴隨活性增加。在一些實(shí)施方案中，所述CFXTEN融合蛋白特征在于(i)與在另外的等效劑量下施用于受試者的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，它在施用于受試者時(shí)具有更長(zhǎng)的半衰期；(ii)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時(shí),所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積(AUC)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時(shí)，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的治療效應(yīng)；(iv)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時(shí)，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積(AUC) ；(v)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時(shí)，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的治療效應(yīng)；(vi)與以另外等同的劑量期施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時(shí)，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積(AUC);或(vii)與以另外等同的劑量期施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，當(dāng)累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時(shí)，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的治療效應(yīng)。本發(fā)明提供了制備包含與一個(gè)或多個(gè)延伸重組多肽(XTEN)融合的因子VII或因子IX或因子VII-因子IX雜種凝血因子的融合蛋白的方法，該方法包括(a)提供包含編碼所述融合蛋白的重組多核苷酸分子的宿主細(xì)胞；(b)在允許所述融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和(C)從培養(yǎng)物中回收所述融合蛋白。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白的凝血因子與選自表I或表2的序列相比具有至少90%序列同一性。在該方法的另一實(shí)施方案中，所表達(dá)的融合蛋白的一個(gè)或多個(gè)XTEN與選自表4的序列相比具有至少約90%、或約91 %、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%至約100%序列同一性。在該方法的另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在該方法的另一實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在該方法的另一實(shí)施方案中，分離的融合蛋白以基本上可溶的形式從宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中回收。本發(fā)明提供了包含選自以下的多核苷酸序列的分離的核酸(a)編碼前述實(shí)施方案任一個(gè)的融合蛋白的多核苷酸，或(b) (a)的多核苷酸的互補(bǔ)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含與以下相比具有至少80%序列同一性、或約85%、或至少約90%、或約91 %、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%至約100%序列同一性的多核苷酸序列(a)選自表41和表42的類似長(zhǎng)度的多核苷酸序列；或(b) (a)的多核苷酸的互補(bǔ)體。本發(fā)明提供了包含與本段所述的上述實(shí)施方案任何一個(gè)的核酸的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，前述表達(dá)載體還包含與多核苷酸序列可操作連接的重組調(diào)控序列。在另一實(shí)施方案中，前述表達(dá)載體的多核苷酸序列與編碼分泌信號(hào)序列的多核苷酸在框內(nèi)融合，所述分泌信號(hào)序列可以是CF天然信號(hào)序列。本發(fā)明提供了宿主細(xì)胞，其包含本段描述的上述任何實(shí)施方案的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，所述是宿主細(xì)胞是HEK細(xì)胞。 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含前述實(shí)施方案的任何一個(gè)的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括包裝材料和包含前述實(shí)施方案的藥物組合物的至少第一容器以及標(biāo)識(shí)所述藥物組合物以及存儲(chǔ)和處理?xiàng)l件的標(biāo)簽，以及關(guān)于所述藥物組合的重建和/或施用給受試者的一張說明。本發(fā)明提供了治療受試者凝血紊亂或凝血因子相關(guān)的疾病、疾患或病癥的方法，該方法包括對(duì)所述受試者施用治療有效量的前述實(shí)施方案任一個(gè)的CFXTEN融合蛋白。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，凝血因子相關(guān)病癥選自出血疾患(例如，血小板功能缺損、血小板減少或von Willebrand病)、凝血紊亂(凝血的任何疾患,包括凝血因子缺乏)、血友病B(又稱為Christmas病)、因子IX-相關(guān)的出血疾患、因子VII缺乏、血友病A、血管損傷、未患血友病受試者的失控出血、創(chuàng)傷或手術(shù)引起的出血、由抗凝治療引起的出血和由肝病引起的出血。在治療方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血紊亂是血友病A。在治療方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述凝血紊亂是血友病B。在治療方法的另一實(shí)施方案中，所述凝血紊亂是因子VII缺乏。在治療方法的另一實(shí)施方案中，將所述CFXTEN施用于受試者以控制出血事件。在治療方法的另一實(shí)施方案中，將包含因子VII-因子IX序列雜種的CFXTEN施用于受試者以控制出血事件，其中所述CFXTEN由內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)的促凝蛋白酶(例如，活化因子XI)活化。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療受試者凝血因子缺乏的方法，該方法包括向所述受試者施用包含治療有效量的本文所提供的因子VII的組合物。在一些實(shí)施方案中，組合物可以皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物以治療有效量施用，其中所述施用導(dǎo)致與以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的融合蛋白的相應(yīng)CF相比，在融合蛋白的治療窗內(nèi)維持的時(shí)間增加。在治療窗內(nèi)維持的時(shí)間增加至未連接XTEN的CF的至少3倍，或者可選地是未連接XTEN的相應(yīng)CF的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少約30倍、或至少約50倍、或至少約100倍。在治療方法的一些實(shí)施方案中，(i)與以另外相同的劑量方案施用的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，施用較小摩爾量(例如，約1/2、或約1/3、或約1/4、或約1/5、或約1/6、或約1/8、或約1/100或更少)的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積和/或類似的治療效應(yīng)；(ii)與使用另外相同的劑量的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，所述融合蛋白以較低頻率(例如，每2天一次、約每7天一次、約每14天一次、約每21天一次、或約每月一次)施用，并且所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積和/或類似的治療效應(yīng)；或(iii)與以另外相同的劑量方案的未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子相比，施用累積較低摩爾量的所述融合蛋白(例如,約5%、或約10%、或約20%、或約40%、或約50%、或約60%、或約70%、或約80%、或約90% )，所述融合蛋白達(dá)到與未連接XTEN的相應(yīng)凝血因子類似的曲線下面積和/或類似的治療效應(yīng)。所述累積更低的摩爾量是針對(duì)至少約一周、或約14天、或約21天、或約一個(gè)月的時(shí)段的測(cè)量。在 治療方法的一些實(shí)施方案中，治療效應(yīng)是選自以下的測(cè)量參數(shù)凝血因子血藥濃度、凝血酶原(PT)測(cè)定、部分活化凝血酶原(aPTT)測(cè)定、出血時(shí)間測(cè)定、全血凝血時(shí)間(WBCT)和血栓彈力描記法。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療疾病、疾患或病癥的方法，包括利用使用治療有效劑量方案施用的多次連續(xù)劑量的藥物組合物給受試者施用上述藥物組合物。在前述的一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療有效劑量方案可以導(dǎo)致所述融合蛋白的血藥水平的至少兩個(gè)連續(xù)Cmax峰和/或Cmin谷之間的時(shí)間增加至以類似劑量方案施用給受試者的未連接所述融合蛋白的相應(yīng)融合蛋白的CF的至少3倍、或可選地至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少約30倍、或至少約50倍、或至少約100倍。前述另一實(shí)施方案中，與使用治療有效方案施用給受試者的未連接融合蛋白的相應(yīng)生物活性蛋白組分相比，使用藥物組合物的融合蛋白的較低頻率給藥或較低總劑量(以摩爾計(jì))施用融合蛋白導(dǎo)致凝血因子相關(guān)的疾病的至少一個(gè)測(cè)量參數(shù)的改善。本發(fā)明還提供了包含前述實(shí)施方案任何一個(gè)的融合蛋白的組合物在制備用于治療有相應(yīng)需要的受試者的疾病、疾患或病癥的藥劑中的用途。在前述一個(gè)實(shí)施方案中，所述疾病、疾患或病癥選自出血疾患、凝血紊亂、血友病B (又稱為Christmas病)、因子IX-相關(guān)的出血疾患、因子VII缺乏、血管損傷、創(chuàng)傷或手術(shù)引起的出血、由抗凝治療和肝病引起的出血。所公開的實(shí)施方案的任何一個(gè)可以根據(jù)感興趣的應(yīng)用而單獨(dú)實(shí)施或者組合實(shí)施。通過引用并入在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^引用的方式并入，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)明確且單獨(dú)地被指明而通過引用的方式并入。附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)可以參考以下詳述和列出示例性實(shí)施方案的附圖來進(jìn)一步解釋。圖I示出了示例性CFXTEN(FIX-XTEN)融合蛋白的示意圖。圖IA示出天然FIX的結(jié)構(gòu)域構(gòu)造，該天然FIX具有Y -羧基谷氨酸鹽結(jié)構(gòu)域、EGFl和EGF2結(jié)構(gòu)域、活化肽和蛋白酶結(jié)構(gòu)域，其中XTEN在C端連接。箭頭指示活化肽結(jié)構(gòu)域的裂解位點(diǎn)。圖IB示出具有經(jīng)由裂解序列連接至C端的XTEN多肽的FIX分子，并指示蛋白水解性裂解釋放XTEN的位點(diǎn)(箭頭指示活化肽結(jié)構(gòu)域的裂解位點(diǎn)和XTEN的釋放點(diǎn))。圖2顯示FIX-XTEN的CXTEN構(gòu)型和締合的蛋白酶裂解位點(diǎn)的若干實(shí)例。圖2A示出具有在FIX的活化肽內(nèi)的兩個(gè)蛋白水解性裂解位點(diǎn)的FIX-XTEN(箭頭)，以及無裂解位點(diǎn)連接子的C端XTEN。圖2B的構(gòu)型與圖2A相似，但C端XTEN經(jīng)由裂解序列連接，箭頭指示釋放位點(diǎn)。圖2C示出FIX-XTEN的三種構(gòu)型，其中XTEN在FIX的不同結(jié)構(gòu)域之間整合。圖2D示出具有插入天然裂解位點(diǎn)間的活化肽中的XTEN部分的FIX-XTEN，一旦FIX蛋白水解性活化，所述FIX-XTEN將會(huì)釋放XTEN。圖2E顯示包含插入不同結(jié)構(gòu)域之間的多XTEN序列并且在C端添加可釋放的XTEN的FIX-XTEN。圖2F顯示XTEN已插入FIX環(huán)狀結(jié)構(gòu)域內(nèi)情況下的FIX-XTEN。圖3是凝血級(jí)聯(lián)的示意圖，其示出外源性和內(nèi)源性途徑。圖4示出FVII-XTEN的CXTEN構(gòu)型的若干實(shí)例。圖4A示出并未活化的FVII-XTEN。圖4B示出在FVII-XTEN中肽已裂解，形成活化的FVIIa-XTEN ;圖4C顯示具有可釋放XTEN的裂解序列的FVII-XTEN組合物，其中FVII組分已被活化，含有活化蛋白酶(AP)的裂解位點(diǎn)和釋放蛋白酶(RP)的第二裂解位點(diǎn)。圖4D示出含有釋放蛋白酶的裂解位點(diǎn)的活化FVIIa-XTEN的組合物。
圖5顯示使用內(nèi)部XTEN的FVII-XTEN設(shè)計(jì)方法的策略。圖5A-D示出在FVII結(jié)構(gòu)域(左邊是未活化的FVII而在右邊是FVII活化形式)的邊界，XTEN插入的示例性位點(diǎn)(A =XTEN在Gla和EGFl結(jié)構(gòu)域之間插入，B =XTEN在EGFl和EGF2之間插入。C =XTEN在活化肽的C端插入，D :XTEN在活化肽的N端插入)。圖5E示出FVII-XTEN的實(shí)例，其中XTEN位于獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域融合蛋白內(nèi)的外環(huán)內(nèi)，左邊是未活化的FVII而右邊是FVIIa。相對(duì)于顯示為粗線的XTEN, FVII中的活化肽顯示為細(xì)線。圖6顯示與圖5基本上相同的構(gòu)建體，但是在每個(gè)構(gòu)建體的C端連接有XTEN。圖7示出一些不同部位的示意圖，其中XTEN可以內(nèi)插入凝血因子FVII或FIX序列。圖8是凝血系統(tǒng)主要組分的示意圖。圖7A :具有內(nèi)源性和外源性級(jí)聯(lián)組分的正常凝血系統(tǒng)。圖7B顯示一種變化，在該變化中FVII-XTEN的無活性/低活性形式(FVir)意欲在施用后被內(nèi)源性活化時(shí)旁路內(nèi)源性系統(tǒng)的FIX和FVIII組分。圖9是通過對(duì)來自pBC0014CH0-Kl轉(zhuǎn)化體的初步篩選的克隆進(jìn)行ELISA而得到的細(xì)胞群集大小分布(灰色條)和以ng/ml計(jì)的FVII ELISA滴度(黑色條)的圖(由于空間不夠，在條的下面并沒有標(biāo)記所有的克隆)(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。根據(jù)ELISA滴度低至高(從左至右)分選克隆。

圖10是前pBC0014克隆的細(xì)胞計(jì)數(shù)(白色條)和以ng/ml計(jì)的FVII滴度(黑色條)的圖(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。根據(jù)ELISA滴度低至高(從左至右)分選克隆。圖11是FVII滴度與前PBC0014克隆的細(xì)胞計(jì)數(shù)的比值的圖(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。根據(jù)比值低至高(從左至右)分選克隆。圖12是根據(jù)ELISA、凝血、ELISA/細(xì)胞計(jì)數(shù)和凝血/細(xì)胞計(jì)數(shù)比值的前pBC0014克隆的蛋白質(zhì)印跡(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。克隆6G1表達(dá)了截短產(chǎn)物，且并未進(jìn)一步評(píng)估。圖13是根據(jù)ELISA、凝血、ELISA/細(xì)胞計(jì)數(shù)和凝血/細(xì)胞計(jì)數(shù)比值的前pBC0016克隆的蛋白質(zhì)印跡(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。圖14是根據(jù)ELISA、凝血、ELISA/細(xì)胞計(jì)數(shù)和凝血/細(xì)胞計(jì)數(shù)比值的前pBC0018克隆的蛋白質(zhì)印跡(參見實(shí)施例25的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))?？寺?B2表達(dá)了截短產(chǎn)物，且并未進(jìn)一步評(píng)估。圖15示出通過抗GLA親和色譜純化FVII-AE864(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。SDS-PAGE分析表明從濃縮的上清液中純化FVII-AE864和純度> 90%的EDTA洗脫級(jí)分。圖16示出通過FXa處理將FVII-XTEN融合物活化為FVIIa-ΧΤΕΝ融合物(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。SDS-PAGE分析表明在Fxa處理后，而不是在未處理的樣本中，輕鏈條帶在還原條件下的外觀。此外，上面的條帶出現(xiàn)下移，這表明輕鏈損失。圖17示出表明FVII-XTEN融合物自體活化為FVIIa-XTEN融合物的SDS-PAGE(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。SDS-PAGE分析表明在FXa處理后且在4°C下用CaCl2高濃度孵育后，輕鏈條帶在還原條件下的外觀。此外，上面的條帶出現(xiàn)下移，這表明輕鏈損失。圖18示出FVII-AE864和FVII-AE288的SEC分析(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。SEC示出在柱的空體積( 22ml)處有極低污染而無聚集物的單分散群。 圖19示出由陰離子交換色譜純化FVII_AE864(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。色譜圖描繪了來自Macrocap Q柱的總蛋白質(zhì)含量和FVII活性物的洗脫圖，大量活性物遲于污染蛋白質(zhì)洗脫，產(chǎn)生凈5倍純化。圖20示出由疏水相互作用色譜純化FVII_AE864(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。色譜圖描繪了來自toyopearl phenyl柱的總蛋白質(zhì)含量和FVII活性物的洗脫圖，大量活性物早于污染蛋白質(zhì)洗脫，產(chǎn)生凈2倍純化。圖21示出兩種色譜法的產(chǎn)量，其表明用陰離子交換色譜從單體FVII-AE864中移除了聚集蛋白(參見實(shí)施例26的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。圖21A是描繪來自macrocap Q柱的FVII-XTEN洗脫圖的色譜圖，雙峰在緩沖相關(guān)的前峰后洗脫。圖21B示出前后macrocap Q峰的SEC色譜圖，表明在前峰中沒有聚集物。圖22示出ELISA或aPTT測(cè)定的結(jié)果，該結(jié)果示出與FIX-XTEN相比，F(xiàn)IX/cFXI/XTEN具有增高的活性(參見實(shí)施例29的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。短暫表達(dá)的FIX構(gòu)建體通過ELISA來測(cè)定抗原含量，并通過基于aPTT的測(cè)定來測(cè)定活性。當(dāng)FIX-XTEN與FIX/cFXI/XTEN構(gòu)建體的抗原含量相似時(shí)，活性顯著增加。在測(cè)定中這種增加歸因于FXI蛋白酶的特異作用，因?yàn)镕IX/cTEV/XTEN與FIX-XTEN并沒有示出顯著不同的活性。記錄FIX樣本的ELISA滴度為197ng/ml且在圖的比例之外。圖23示出給大鼠皮下施用單次劑量后藥代動(dòng)力學(xué)的圖，示出導(dǎo)出的當(dāng)量FIX濃度，如實(shí)施例30所述。圖24示出給大鼠皮下施用單次劑量后藥代動(dòng)力學(xué)的圖，示出導(dǎo)出的當(dāng)量FIX濃度，如實(shí)施例31所述。圖25示出在皮下或靜脈內(nèi)施用與不同長(zhǎng)度的非結(jié)構(gòu)化多肽連接的GFP的不同組合物的單次劑量后，食蟹猴的藥代動(dòng)力學(xué)的圖(血漿濃度)，如實(shí)施例39所述。所述組合物是 GFP-L288、GFP-L576、GFP_XTEN_AF576、GFP-Y576 和 XTEN_AD836_GFP。在注射后不同時(shí)間分析血樣，并使用抗GFP的多克隆抗體用于捕獲以及使用相同多克隆抗體的生物素化制劑用于檢測(cè)，通過ELISA測(cè)定GFP在血漿中的濃度。結(jié)果顯示為相對(duì)于給藥后時(shí)間(小時(shí))的血漿濃度，并且示出，特別是XTEN_AD836-GFP (具有最長(zhǎng)序列長(zhǎng)度的XTEN的組合物)的半衰期顯著增加。構(gòu)建體的序列長(zhǎng)度越短，GFP-L288半衰期越短。圖26示出來自與GFP的N端融合的融合蛋白XTEN_AE864的穩(wěn)定性研究的樣本SDS-PAGE凝膠(參見實(shí)施例40)。使GFP-XTEN在食蟹猴血漿和大鼠腎裂解物中于37°C下孵育達(dá)7天。此外，還評(píng)估了施用給食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1和7天提取樣本并通過SDS PAGE分析，隨后使用Western分析和抗GFP抗體進(jìn)行檢測(cè)。圖27示出用于來自LCW546、LCW547和LCW552的克隆的N端序列中第三和第四密碼子的三個(gè)隨機(jī)文庫(參見實(shí)施例14的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。如所示的，將文庫設(shè)計(jì)為第三和第四殘基被修飾而使得允許的XTEN密碼子的所有組合存在于這些位置。為了使每個(gè)文庫包含所有這些允許的XTEN密碼子，設(shè)計(jì)具有第三和第四殘基密碼子多樣性的編碼12個(gè)氨基酸的9對(duì)寡核苷酸、使其退火并連接到Ndel/Bsal限制酶消化的填充載體pCW0551 (填充片段-XTEN_AM875-GFP)，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21Gold(DE3)感受態(tài)細(xì)胞以獲得三個(gè)文庫LCW0569、LCW0570 和 LCW0571 的菌落。圖28示出如實(shí)施例15所述優(yōu)化步驟之后針對(duì)前75個(gè)克隆的GFP熒光信號(hào)的再測(cè)試的直方圖，相對(duì)于基準(zhǔn)CBD_AM875構(gòu)建體。結(jié)果指示幾個(gè)克隆目前優(yōu)于基準(zhǔn)克隆。圖29是為聯(lián)合N端48個(gè)氨基酸的兩個(gè)區(qū)域的密碼子優(yōu)化偏好而進(jìn)行的重組方法 的示意圖(參見實(shí)施例16的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié))。該方法在XTEN蛋白的N端產(chǎn)生新的48mer,用于評(píng)估表達(dá)優(yōu)化，所述表達(dá)優(yōu)化得到可能是XTEN蛋白表達(dá)的解決方案的前導(dǎo)序列，其中XTEN在CF的N端。圖30示出證實(shí)獲自XTEN N端密碼子優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選密碼子表達(dá)的SDS-PAGE凝膠，與在構(gòu)建體序列的N端包含CBD前導(dǎo)序列的基準(zhǔn)XTEN克隆相比較，如實(shí)施例17所述。圖31是XTEN的組裝、產(chǎn)生和評(píng)估中代表性步驟的示意流程圖。圖32是編碼融合蛋白的CFXTEN多核苷酸構(gòu)建體組裝中代表性步驟的示意流程圖。單個(gè)寡核苷酸501被退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其隨后與含有BbsI和KpnI限制性位點(diǎn)503的寡聚體連接。來自文庫的其它序列基序被退火成12-mer，直到獲得期望長(zhǎng)度的XTEN基因504。將XTEN基因克隆到填充載體。在這種情況下，該載體編碼任選的Flag序列506，隨后是兩側(cè)具有BsaI、BbsI和KpnI位點(diǎn)的終止序列507和FVII基因508，得到編碼XTEN-FVII融合蛋白的基因500。圖33是在編碼包含CF和XTEN的融合蛋白的基因的組裝、其表達(dá)和作為融合蛋白回收、及其作為候選CFXTEN產(chǎn)物的評(píng)估中代表性步驟的示意流程圖。圖34是使用不同的加工策略設(shè)計(jì)CFXTEN表達(dá)載體的示意圖。圖34A示出編碼與FVII編碼序列3'端融合的XTEN的表達(dá)載體。注意，該載體中不需要額外的前導(dǎo)序列。圖7B描繪了編碼與FVII編碼序列5'端融合的XTEN的表達(dá)載體，其具有CBD前導(dǎo)序列和TEV蛋白酶位點(diǎn)。圖7C描繪了圖7B中CBD和TEV加工位點(diǎn)被優(yōu)化的N端前導(dǎo)序列(NTS)所替代的表達(dá)載體。圖7D描繪了編碼NTS序列、XTEN、VFII編碼序列和第二個(gè)XTEN編碼序列的表達(dá)載體。圖35示出根據(jù)已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量的胰高血糖素-XTEN構(gòu)建體樣本的尺寸排阻色譜分析結(jié)果，其中圖形輸出為吸光度對(duì)保留體積，如實(shí)施例37所述。胰高血糖素-XTEN構(gòu)建體是I)胰高血糖素-Y288 ；2)胰高血糖素Y-144 ；3)胰高血糖素-Y72 ;和4)胰高血糖素-Y36。結(jié)果指示表觀分子量隨著XTEN部分長(zhǎng)度的增加而增加。圖36示出天然FIX、天然FVII和FVII-FIX序列雜種部分間的序列比對(duì)，這些序列具有加入跨EGF2和Pro結(jié)構(gòu)域分子部分的AP結(jié)構(gòu)域不同部分。該圖例提供了構(gòu)建體名稱。單獨(dú)序列中的空位(破折號(hào))表示FIX的非同源性延伸，但是為連續(xù)的、連接的序列。加下劃線的氨基酸是FIX-衍生序列。發(fā)明詳述在描述本發(fā)明實(shí)施方案之前，要理解，這些實(shí)施方案僅作為例子而提供，并且可以采用本文描述的本發(fā)明實(shí)施方案的各種替代方案來實(shí)施本發(fā)明。本領(lǐng)技術(shù)人員現(xiàn)在將可以想到不背離本發(fā)明的許多改變、變化和替代。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管與本文描述的那些類似或等同的方法和材料可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明，但下面描述了合適的方法和材料。沖突時(shí)，以包括定義在內(nèi)的本專利說明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)例僅是示例說明性的而不旨在限制。本領(lǐng)技術(shù)人員現(xiàn)在會(huì)想到不背離本發(fā)明的許多改變、變化和替代。定義 除非另外規(guī)定，如本文使用的以下術(shù)語具有歸屬于它們的含義。除非上下文另外清楚地指明，說明書和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。例如，術(shù)語“一種細(xì)胞”包括多個(gè)細(xì)胞，包括其混合物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是線性或分支的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其間可以插入非氨基酸。這些術(shù)語還包括例如通過二硫鍵形成、糖基化、酯化、乙?；?、磷酸化或任何其它操作(例如與標(biāo)記組分偶聯(lián))而被修飾的氨基酸聚合物。本文使用的術(shù)語“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于D或L旋光異構(gòu)體，以及氨基酸類似物和肽模擬物。使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母密碼指定氨基酸。術(shù)語“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光異構(gòu)體形式甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、組氨酸(H)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)。應(yīng)用于序列并在本文使用的術(shù)語“非天然存在的”指沒有哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列的對(duì)應(yīng)物、與哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列不互補(bǔ)、或與哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。例如，適當(dāng)比對(duì)時(shí)，非天然存在的多肽或片段可以與天然序列共享不超過99198195%,90%,80%,70%,60%,50%或甚至更低的氨基酸序列同一性。術(shù)語“親水性”和“疏水性”指物質(zhì)具有的與水的親和力程度。親水性物質(zhì)對(duì)水具有強(qiáng)親和力，易于溶解于水、與水混合或被水潤(rùn)濕，而疏水性物質(zhì)基本缺乏對(duì)水的親和力，易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或與水混合或被水潤(rùn)濕。氨基酸可以根據(jù)其疏水性來表征。已經(jīng)發(fā)展了許多量表。一個(gè)實(shí)例是由Levitt，M等，J Mol Biol (1976) 104 59發(fā)展的量表，其列于 Hopp，TP 等，Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 78 :3824?！坝H水性氨基酸”的實(shí)例是精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特別關(guān)注的親水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸和甘氨酸?！笆杷园被帷钡膶?shí)例是色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。
“片段”是保留至少一部分治療活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式?！白凅w”是與天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白質(zhì)，保留了生物活性蛋白的至少一部分治療活性和/或生物活性。例如，變體蛋白可以與參考生物活性蛋白相比共享至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。本文使用的術(shù)語“生物活性蛋白部分”包括例如通過定點(diǎn)誘變、插入而有意修飾或通過突變而意外修飾的蛋白質(zhì)。如本文使用的，“內(nèi)部XTEN”指已插入凝血因子序列中的XTEN序列。內(nèi)部XTEN可以通過XTEN序列插入例如FIX或FVII的凝血因子的序列中，通過在凝血因子的兩個(gè)相鄰氨基酸之間、或結(jié)構(gòu)域之間插入、或其中XTEN替代凝血因子的部分、內(nèi)源性序列而構(gòu)建。如本文使用的，“末端XTEN”指已與凝血因子的N端或C端融合的、或融合入其中的，或與蛋白水解性裂解序列在凝血因子的N或C端融合的XTEN序列。末端XTEN可以與凝血因子的天然末端融合?；蛘撸┒薠TEN可以替代凝血因子的末端序列。 術(shù)語“XTEN釋放位點(diǎn)”指CFXTEN融合蛋白中可以被哺乳動(dòng)物蛋白酶識(shí)別和裂解，引起XTEN或XTEN的部分從CFXTEN融合蛋白中釋放的序列。如本文使用的，“哺乳動(dòng)物蛋白酶”意指正常存在于哺乳動(dòng)物的體液、細(xì)胞或組織中的蛋白酶。XTEN釋放位點(diǎn)可以設(shè)計(jì)為由各種哺乳動(dòng)物蛋白酶(又稱為“XTEN釋放蛋白酶”)裂解，例如FXIa、FXIIa、激肽釋放酶、FVIIa、FIXa、FXa、FIIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17、MMP_20、或在凝血事件期間存在的任何蛋白酶。適用于本文提供的CFXTEN多肽的形式的“活性”，指保留天然凝血因子的生物活性，其中“生物活性”指體外或體內(nèi)生物學(xué)功能或效應(yīng)，包括但不限于受體或配體結(jié)合的酶促活性、或凝血因子對(duì)本領(lǐng)域通常已知的凝血因子的效應(yīng)。適用于形成本文提供的CFXTEN多肽的形式的“治療效應(yīng)”指生理效應(yīng)，包括但不限于人或其它動(dòng)物中疾病或病癥的治愈、緩和、逆轉(zhuǎn)、緩解或預(yù)防、或指以其它方法增強(qiáng)人或動(dòng)物的生理或精神狀態(tài)?！爸委熡行Я俊币庵赣行ьA(yù)防、減輕、逆轉(zhuǎn)或緩解疾病或病癥的癥狀(例如，出血事件)或延長(zhǎng)所治療受試者的存活的化合物的量。治療有效量的測(cè)定完全是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，尤其是根據(jù)本文所提供的詳細(xì)公開內(nèi)容?！八拗骷?xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是主題載體的受體的個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代。由于天然、意外或有意的突變，后代不一定與原始親代細(xì)胞完全相同(形態(tài)方面或者總DNA互補(bǔ)體的基因組方面)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。當(dāng)用于描述本文公開的各種多肽時(shí)，“分離的”指已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染組分是通常會(huì)干擾所述多肽的診斷或治療用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要“分離”以使之與其天然存在的對(duì)應(yīng)物相區(qū)分。此外，“濃縮的”、“分離的”或“稀釋的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段可與其天然存在對(duì)應(yīng)物相區(qū)分，因?yàn)闈舛然蛎矿w積的分子數(shù)目一般大于其天然存在的對(duì)應(yīng)物。一般而言，通過重組方式制備并在宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽被認(rèn)為是“分離的”?！胺蛛x的”多核苷酸或多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸是從所述多肽編碼核酸的天然來源中正常伴隨的至少一種污染核酸分子鑒定和分離的核酸分子。分離的多肽編碼核酸不同于其天然存在的形式或環(huán)境。因此，分離的多肽編碼核酸分子可與天然細(xì)胞中存在的特定多肽編碼核酸分子相區(qū)分。然而，分離的多肽編碼核酸分子包括正常表達(dá)所述多肽的細(xì)胞中含有的多肽編碼核酸分子，此時(shí)，例如，核酸分子處于不同于天然細(xì)胞核酸分子的染色體內(nèi)或者染色體外位置。“嵌合”蛋白含有至少一個(gè)融合多肽，包含與天然存在不同的序列位置的區(qū)域。所述區(qū)域可以正常存在于不同的蛋白質(zhì)中并且在融合 多肽中匯集在一起；或者它們可以正常存在于相同的蛋白質(zhì)中但在融合多肽中處于新的排列。嵌合蛋白可以通過例如化學(xué)合成或者通過產(chǎn)生并翻譯其中肽區(qū)域以期望關(guān)系編碼的多核苷酸來產(chǎn)生。“偶聯(lián)的”、“連接的”、“融合的”和“融合”在本文可互換使用。這些術(shù)語指通過包括化學(xué)偶聯(lián)或重組方式在內(nèi)的任何方式使兩個(gè)或多個(gè)化學(xué)元素或組分結(jié)合在一起。例如，如果啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與所述序列是可操作連接的。一般而言，“可操作連接”表示被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在閱讀相內(nèi)或框內(nèi)?！翱騼?nèi)融合”指兩個(gè)或多個(gè)開放閱讀框(ORF)以保持原始ORF正確閱讀框的方式結(jié)合形成連續(xù)更長(zhǎng)的0RF。因此，得到的重組融合蛋白是含有對(duì)應(yīng)于由原始ORF編碼的多肽的兩個(gè)或多個(gè)片段的單個(gè)蛋白質(zhì)(所述片段通常本質(zhì)上不會(huì)如此結(jié)合)。多肽上下文中，“線性序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端方向的氨基酸順序，序列中彼此鄰接的殘基在多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的?！安糠中蛄小笔且阎谝粋€(gè)或兩個(gè)方向包含額外殘基的多肽的一部分的線性序列?！爱愒吹摹敝秆苌耘c進(jìn)行比較的實(shí)體其余部分基因型不同的實(shí)體。例如，從其天然編碼序列取出并可操作連接至不同于天然序列的編碼序列的富含甘氨酸序列是異源的富含甘氨酸序列。術(shù)語“異源的”應(yīng)用于多核苷酸、多肽時(shí)指所述多核苷酸或多肽衍生自與進(jìn)行比較的實(shí)體其余部分基因型不同的實(shí)體。術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們指任何長(zhǎng)度的核苷酸的聚合體形式，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以發(fā)揮已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實(shí)例基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、通過連鎖分析確定的基因座(基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在聚合物組裝之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸組分。多核苷酸可以在聚合之后進(jìn)一步修飾，例如通過與標(biāo)記組分的偶聯(lián)。術(shù)語“多核苷酸的互補(bǔ)體”表示與參考序列相比具有互補(bǔ)堿基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互補(bǔ)體可以與具有完全保真性的參考序列雜交?！爸亟M的”應(yīng)用至多核苷酸時(shí)指該多核苷酸是體外克隆、限制酶消化和/或連接步驟以及產(chǎn)生可能在宿主細(xì)胞中表達(dá)的構(gòu)建體的其它程序的各種組合的產(chǎn)物。術(shù)語“基因”和“基因片段”在本文可互換使用。它們指含有能夠在被轉(zhuǎn)錄和翻譯之后編碼特定蛋白質(zhì)的至少一個(gè)開放閱讀框的多核苷酸。基因或基因片段可以是基因組或cDNA，只要該多核苷酸含有至少一個(gè)開放閱讀框，該開放閱讀框可以涵蓋整體編碼區(qū)或其片段?！叭诤匣颉笔怯芍辽賰蓚€(gè)連接在一起的異源多核苷酸構(gòu)成的基因?！巴葱浴被颉巴吹摹敝竷蓚€(gè)或多個(gè)多核苷酸序列或兩個(gè)或多個(gè)多肽序列之間的序列相似性或可互換性。當(dāng)使用例如BestFit等程序來測(cè)定兩個(gè)不同氨基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時(shí)，可以使用缺省設(shè)置，或者可以選擇適當(dāng)?shù)脑u(píng)分矩陣?yán)鏱losum45或blosum80來優(yōu)化同一'丨生、相似性或同源性評(píng)分。優(yōu)選地，同源的多核苷酸是在本文定義的嚴(yán)格條件下雜交的那些序列并且與那些序列相比具有至少70%、優(yōu)選至少80 %、更優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選95 %、更優(yōu)選97 %、更優(yōu)選98 %和甚至更優(yōu)選99 %序列同一性?！斑B接”指在兩個(gè)核酸片段或基因之間形成磷酸二酯鍵而使它們連接在一起的過程。為了使DNA片段或基因連接在一起，DNA末端必須彼此相容。在一些情況下，末端在核酸內(nèi)切酶消化之后即是相容的。然而，可能必須首先將通常由核酸內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的交錯(cuò)末端轉(zhuǎn)化成平末端以使它們適合連接。術(shù)語“嚴(yán)格的條件”或“嚴(yán)格的雜交條件”包括提及多核苷酸將以比其它序列可檢 測(cè)地更大程度(例如，超過背景至少2倍)與其靶序列雜交的條件。一般而言，雜交的嚴(yán)格性部分地參考進(jìn)行洗滌步驟的溫度和鹽濃度來表示。通常，嚴(yán)格條件是如下條件其中pH 7. O至8. 3下的鹽濃度小于約I. 5M Na離子、通常約O. 01至I. OM Na離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對(duì)于短的多核苷酸(例如，10至50個(gè)核苷酸)是至少約30°C并且對(duì)于長(zhǎng)的多核苷酸(例如，大于50個(gè)核苷酸)是至少約60°C—例如，“嚴(yán)格的條件”可以包括在37°C下50%甲酰胺、IM NaClU % SDS中雜交，以及在O. 1XSSC/1% SDS中于60°C下至65°C下
三次洗滌，每次15分鐘?？蛇x地，可以使用約65°C、60°C、55°C或42°C的溫度。SSC濃度可以從約O. I至2XSSC變化，其中SDS以約O. 1%存在。這種洗滌溫度通常被選擇為比確定離子強(qiáng)度和PH下特定序列的熱力學(xué)熔點(diǎn)低約5°C至20°C。Tm是50%的靶序列與完美匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的離子強(qiáng)度和PH下)。計(jì)算Tm的方程和核酸雜交條件是熟知的并且可以參見 Sambrook, J.等(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2 版,第 1-3 卷,Cold Spring Harbor Press,Plainview N. Y.;特別參見第 2 卷第 9 章。通常，使用阻斷試劑來阻斷非特異性雜交。這種阻斷試劑包括例如約100-200yg/ml的經(jīng)剪切和變性的鮭魚精子DNA。在特定情況下，例如對(duì)于RNA = DNA雜交，還可以使用有機(jī)溶劑，例如濃度約35-50% v/v的甲酰胺。對(duì)這些洗滌條件的有用改變對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而目是明顯的。術(shù)語“同一性百分比”和“同一性應(yīng)用于多核苷酸序列時(shí)指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法比對(duì)的至少兩個(gè)多核苷酸序列之間的殘基匹配百分比。這種算法可以標(biāo)準(zhǔn)化且可重復(fù)的方式在被比較的序列中插入空位以優(yōu)化兩個(gè)序列之間的比對(duì)，并因此實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列的更有意義的比較?？梢詫?duì)整體確定的多核苷酸序列長(zhǎng)度測(cè)量百分比同一性，或者可以對(duì)較短長(zhǎng)度例如對(duì)獲自較大的確定的多核苷酸序列的片段長(zhǎng)度測(cè)量百分比同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450個(gè)連續(xù)殘基的片段。這些長(zhǎng)度僅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附圖或序列表中示出的序列所支持的任何片段長(zhǎng)度可以被用來描述可被測(cè)量百分比同一性的長(zhǎng)度。有關(guān)本文鑒定的多肽序列的“序列同一性百分比) ”被定義為比對(duì)序列并引入空位(如果必要)以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性并且不將任何保守取代視為序列同一性的一部分，詢問序列中與另一個(gè)參考多肽序列或其部分的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基百分比。旨在測(cè)定百分比氨基酸序列同一性的比對(duì)可以本領(lǐng)域技術(shù)中的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用公開可獲得的計(jì)算機(jī)軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括對(duì)被比較的序列的全長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法?？梢詫?duì)整體確定的多肽序列長(zhǎng)度測(cè)量百分比同一性，或者可以對(duì)較短長(zhǎng)度例如對(duì)獲自較大的確定的多肽序列的片段長(zhǎng)度測(cè)量百分比同一性，所述片段例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150個(gè)連續(xù)殘基的片段。這些長(zhǎng)度僅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附圖或序列表中顯示的序列所支持的任何片段長(zhǎng)度可以被用來描述可被測(cè)量百分比同一性的長(zhǎng)度。本文多肽上下文中使用的術(shù)語“非重復(fù)性”指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的內(nèi)部同源性。例如，術(shù)語“基本上非重復(fù)的”可以指例如序列中很少或沒有四個(gè)連續(xù)氨基酸是相同的氨基酸類型，或者多肽具有10或更小的子序列評(píng)分(下文定義)，或者沒有構(gòu)成多肽序列的序列基序從N端至C端順序的模式。本文多肽上下文中使用的術(shù)語“重復(fù)性”指肽或多肽序列中內(nèi)部同源性程度。相反，“重復(fù)的”序列可以含有短氨基酸序列的多個(gè)相同拷貝。例如，目標(biāo)多肽序列可以被分成n-mer序列，并且相同序列的數(shù)目可以被計(jì)數(shù)。高 度重復(fù)的序列含有大比例的相同序列，而非重復(fù)的序列含有很少的相同序列。在多肽上下文中，序列可以含有確定或可變長(zhǎng)度的較短序列或基序的多個(gè)拷貝，其中基序本身具有非重復(fù)序列，使全長(zhǎng)多肽是基本上非重復(fù)的。其中測(cè)量非重復(fù)性的多肽長(zhǎng)度可以是3個(gè)氨基酸至約200個(gè)氨基酸、約6至約50個(gè)氨基酸、或約9至約14個(gè)氨基酸。多核苷酸序列的上下文中使用的“重復(fù)性”指序列內(nèi)部同源性程度，例如，給定長(zhǎng)度的相同核苷酸序列的頻率。重復(fù)性可以例如通過分析相同序列的頻率來測(cè)量?！拜d體”是優(yōu)選在適當(dāng)宿主中自我復(fù)制的核酸分子，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞中和/或在宿主細(xì)胞之間。該術(shù)語包括主要功能是將DNA或RNA插入細(xì)胞的載體，主要功能是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，以及功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達(dá)載體。還包括提供不止一種上述功能的載體。“表達(dá)載體”是被引入適當(dāng)宿主細(xì)胞時(shí)可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸?！氨磉_(dá)系統(tǒng)”通常表示包含可以用于產(chǎn)生期望的表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體的適合的宿主細(xì)胞?！把褰到饪剐浴睉?yīng)用于多肽時(shí)指多肽在血液或其組分中抵抗降解的能力，血清或血漿中通常包括蛋白酶。血清降解抗性可以通過使蛋白質(zhì)與人(或視情況為小鼠、大鼠、猴)血清或血漿通常在約37°C混合通常一定天數(shù)(例如O. 25、0.5、1、2、4、8、16天)來測(cè)量。可對(duì)這些時(shí)間點(diǎn)的樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，并使用抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)?？贵w可以針對(duì)蛋白中的標(biāo)簽。如果蛋白質(zhì)在印跡(western)上顯示單條帶，其中蛋白質(zhì)大小與注射蛋白質(zhì)大小相同，則沒有發(fā)生降解。在該示例性方法中，通過蛋白質(zhì)印跡或等效技術(shù)判斷50%蛋白被降解的時(shí)間點(diǎn)是蛋白質(zhì)的血清降解半衰期或“血清半衰期”。本文使用的術(shù)語“t1/2”指終末半衰期，計(jì)算為In⑵/Kel。Kel是通過log濃度對(duì)時(shí)間曲線的終末線性部分的線性回歸而計(jì)算的終末消除速率常數(shù)。半衰期通常指活生物體中儲(chǔ)存的施用物質(zhì)的半數(shù)被正常生物過程代謝或消除所需的時(shí)間。術(shù)語“t1/2”、“終末半衰期”、“消除半衰期”和“循環(huán)半衰期”在本文可互換使用。“主動(dòng)清除”指下述機(jī)制通過該機(jī)制將CF從循環(huán)中移除，除了通過過濾或凝血以夕卜，且該機(jī)制包括從CF的細(xì)胞、受體、代謝或降解介導(dǎo)的循環(huán)中移除?！氨碛^分子量因子”和“表觀分子量”是相關(guān)術(shù)語，指特定氨基酸序列表現(xiàn)出的表觀分子量的相對(duì)增加或降低的量度。表觀分子量使用尺寸排阻色譜(SEC)和類似方法與球狀蛋白標(biāo)準(zhǔn)品相比較來測(cè)定，并且以“表觀kD”單位來度量。表觀分子量因子是表觀分子量和實(shí)際分子量之間的比率；后者通過基于氨基酸組成而加合組成中每種氨基酸的計(jì)算分子量，或通過對(duì)比SDS電泳凝膠中的分子量標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估來預(yù)測(cè)。術(shù)語“流體動(dòng)力學(xué)半徑”或“Stokes半徑”是分子在溶液中的有效半徑(Rh，以nm計(jì))，通過假設(shè)它是穿過溶液并受溶液粘性抵抗的主體來測(cè)量。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，XTEN融合蛋白的流體動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)量與‘表觀分子量因子’相關(guān)聯(lián)，表觀分子量因子是更直觀的量度。蛋白質(zhì)的“流體動(dòng)力學(xué)半徑”影響其在水溶液中的擴(kuò)散速率以及其在大分子凝膠中遷移的能力。蛋白質(zhì)的流體動(dòng)力學(xué)半徑由其分子量以及其結(jié)構(gòu)(包括形狀和致密度)決定。測(cè)定流體動(dòng)力學(xué)半徑的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如通過使用尺寸排阻色譜(SEC)jn美國(guó)專利No. 6，406，632和No. 7，294，513所述。大多數(shù)蛋白質(zhì)具有球形結(jié)構(gòu)，這是蛋白質(zhì)在最小流體動(dòng)力學(xué)半徑下可以具有的最致密的三維結(jié)構(gòu)。一些蛋白質(zhì)具有隨機(jī)和開放的非 結(jié)構(gòu)化或‘線性’構(gòu)象，因此與類似分子量的典型球形蛋白質(zhì)相比具有大得多的流體動(dòng)力學(xué)半徑?！吧?xiàng)l件”指活宿主中的一組條件以及模擬活受試者那些條件的體外條件，包括溫度、鹽濃度、pH。已經(jīng)確立了用于體外分析的許多生理相關(guān)條件。一般而言，生理緩沖液包含生理濃度的鹽并且被調(diào)節(jié)至中性pH，范圍從約6. 5至約7. 8，并且優(yōu)選約7. O至約7. 5。許多生理緩沖液列于Sambrook等(1989)。生理相關(guān)溫度范圍從約25°C至約38°C并且優(yōu)選約35°C至約37 °C。“反應(yīng)基”是可以與另一反應(yīng)基偶聯(lián)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。反應(yīng)基的實(shí)例是氨基、羧基、巰基、羥基、醛基、疊氮基。一些反應(yīng)基可以被活化以促進(jìn)與另一反應(yīng)基的偶聯(lián)?；罨姆窍拗菩詫?shí)例是羧基與碳二亞胺反應(yīng)，羧基轉(zhuǎn)化為活化的酯，或者羧基轉(zhuǎn)化為疊氮化物官能?！翱蒯寗?、“緩釋劑”、“貯庫制劑”和“持續(xù)釋放劑”可互換使用，指與多肽在缺乏這些物質(zhì)而施用時(shí)的釋放持續(xù)時(shí)間相比能夠延長(zhǎng)本發(fā)明多肽釋放持續(xù)時(shí)間的物質(zhì)。本發(fā)明的不同實(shí)施方案可以具有不同的釋放速率，導(dǎo)致不同的治療量。術(shù)語“抗原”、“靶抗原”和“免疫原”在本文可互換使用，指抗體片段或基于抗體片段的治療劑與之結(jié)合或?qū)χ哂刑禺愋缘慕Y(jié)構(gòu)或結(jié)合決定簇。本文使用的術(shù)語“有效負(fù)載”指具有生物活性或治療活性的蛋白質(zhì)或肽序列；小分子藥效團(tuán)的對(duì)應(yīng)物。有效負(fù)載的實(shí)例包括但不限于細(xì)胞因子、酶、激素和血液和生長(zhǎng)因子。有效負(fù)載還可以包含基因融合或化學(xué)偶聯(lián)的部分，例如化療劑、抗病毒化合物、毒素或造影齊U。這些偶聯(lián)部分可以通過連接子連接至多肽其余部分，所述連接子可以是可裂解的或不可裂解的。本文使用的術(shù)語“拮抗劑”包括部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鑒定多肽拮抗劑的方法可以包括使天然多肽與候選拮抗劑分子接觸并測(cè)量通常與天然多肽相關(guān)的一種或多種生物活性的可檢測(cè)的變化。在本發(fā)明上下文中，拮抗劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類、抗體或降低生物活性蛋白效應(yīng)的任何其它分子。術(shù)語“激動(dòng)劑”以最廣泛的含義使用并且包括模擬本文公開的天然多肽的生物活性的任何分子。適合的激動(dòng)劑分子具體包括激動(dòng)劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、小有機(jī)分子等。用于鑒定天然多肽的激動(dòng)劑的方法可以包括使天然多肽與候選激動(dòng)劑分子接觸并測(cè)量通常與天然多肽相關(guān)的一種或多種生物活性的可檢測(cè)的變化?！盎钚浴背鲇诒疚哪康闹溉诤系鞍捉M分與相應(yīng)的天然生物活性蛋白一致的作用或效應(yīng),其中“生物活性”指體外或體內(nèi)生物功能或效應(yīng)，包括但不限于受體結(jié)合、拮抗劑活性、激動(dòng)劑活性或細(xì)胞或生理反應(yīng)。本文使用的“治療(treatment) ”或“治療(治療)”或“減輕(Palliating) ”或“緩解(ameliorating)”在本文可互換使用。這些術(shù)語指獲得包括但不限于治療益處和/或預(yù)防益處的有益或期望結(jié)果的方法。所謂治療益處是指被治療的潛在疾患的消除或緩解。而且，隨著與潛在疾患相關(guān)的一種或多種生理癥狀的消除或緩解使得在受試者中觀察到改善而實(shí)現(xiàn)治療益處，盡管受試者可能依然受累于所述潛在疾患。為了預(yù)防益處，組合物可以被施用給處于發(fā)展特定疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者或者報(bào)告了疾病的一種或多種生理癥狀的受試者，盡管可能還未做出該疾病的診斷。 本文使用的“治療效應(yīng)”指生理效應(yīng)，包括但不限于人或其它動(dòng)物中疾病的治愈、緩和、緩解或預(yù)防，或者指除此以外增強(qiáng)人或動(dòng)物的生理或精神狀態(tài)，這是由本發(fā)明融合多肽而非誘導(dǎo)生成針對(duì)生物活性蛋白具有的抗原表位的抗體的能力引起的。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細(xì)公開內(nèi)容。本文使用的術(shù)語“治療有效量”和“治療有效劑量”指單獨(dú)或作為融合蛋白組合物的一部分的生物活性蛋白的量，所述生物活性蛋白一次或重復(fù)劑量施用給受試者時(shí)能夠?qū)膊顟B(tài)或病癥的任何癥狀、方面、測(cè)量參數(shù)或特征具有任何可檢測(cè)的有益效應(yīng)。這種效應(yīng)不一定絕對(duì)是有益的。本文使用的術(shù)語“治療有效劑量方案”指單獨(dú)或作為融合蛋白組合物的一部分的生物活性蛋白的連續(xù)施用的多個(gè)劑量(即，至少兩個(gè)或更多個(gè))的計(jì)劃表，其中所述劑以治療有效量給予以對(duì)疾病狀態(tài)或病癥的任何癥狀、方面、測(cè)量參數(shù)或特征產(chǎn)生持續(xù)有益的效應(yīng)。I). —般技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明實(shí)踐采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的免疫學(xué)、生物化學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。參見Sambrook，J.等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual,，，第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2001 ;“Current protocols in molecular biology”，F(xiàn). M. Ausubel 等編輯，1987 ;系列 “Methods in Enzymology,，，Academic Press, San Diego, CA. ;“PCR 2 a practicalapproach”，M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 編輯，Oxford University Press,1995 ;“Antibodies, a laboratory manual，，Harlow, E.和 Lane, D.編輯，Cold SpringHarbor Laboratory,1988 ;“Goodman & Gilman’ s The Pharmacological Basis ofTherapeutics, ” 第 11 版，McGraw-Hi 11, 2005 ；和 Freshney, R. I. ,“Culture of AnimalCells A Manual of Basic Technique,，，第 4 版，John Wiley & Sons,Somerset,NJ,2000,這些參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過引用的方式并入本文。II).凝血因子
本發(fā)明部分涉及包含凝血因子(CF)的融合蛋白組合物。如本文使用的，“凝血因子”或“CF”指因子IX(FIX)、因子VII (FVII) ,FVII和FIX的序列組合、或其模擬物、序列變體以及截短形式。(a)因子 IX“因子IX”或“FIX”指凝血因子蛋白及其種類和序列變體，并且包括但不限于人FIX前體多肽(“前原”)的461單鏈氨基酸序列和成人FIX的415單鏈氨基酸序列。FIX包括具有血液凝血因子IX的典型特征的因子IX分子的任何形式。如本文使用的“因子IX”和“FIX”意欲包含多肽，其包含結(jié)構(gòu)域Gla (含有Y -羧基谷氨酸殘基的區(qū)域)、EGF1和EGF2 (含有與人表皮生長(zhǎng)因子同源的序列區(qū)域)、活化肽(由成熟FIX的殘基R136-R180形成)，以及C端蛋白酶結(jié)構(gòu)域(“前”)、或本領(lǐng)域已知結(jié)構(gòu)域的同義密碼子，或可以是截短片段或保留天然蛋白質(zhì)生物活性的至少一部分的序列變體。FIX或序列變體已被克隆，如美國(guó)專利No. 4，770, 999,7, 700, 734中所述，并且人因子IX的cDNA編碼已被分離、表征并克隆至表達(dá)載體(參見，例如 Choo 等人，Nature299 :178-180 (1982) ;Fair 等人，Blood 64 194-204 (1984);和 Kurachi 等人，Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. A. 79 :6461-6464 (1982))。人因子IX(FIX)由位于X-染色體q27. I處的單拷貝基因編碼。人FIX mRNA由5’非翻譯區(qū)的205個(gè)堿基、前原因子IX的1383個(gè)堿基、終止密碼子和3’非翻譯區(qū)的1392個(gè)堿基組成。FIX多肽為55kDa，合成為由以下三個(gè)區(qū)組成的前原多肽鏈28個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、18個(gè)氨基酸的前肽(其對(duì)于谷氨酸殘基的Y羧化是必需的)和415個(gè)氨基酸的成熟因子IX。所述前肽是N端連接Y羧基谷氨酸鹽結(jié)構(gòu)域的18-氨基酸殘基序列。該前肽結(jié)合維生素K依賴性Y羧化酶，然后通過內(nèi)源性蛋白酶(最可能是PACE(成對(duì)的堿性氨基酸裂解酶)，還被稱為弗林蛋白酶或PCSK3)從FIX的前體多肽裂解。在沒有Y羧化酶的前提下，Gla結(jié)構(gòu)域不能結(jié)合鈣，以設(shè)定需將蛋白質(zhì)錨定于帶負(fù)電荷的磷脂表面所需的正確的構(gòu)象，由此使因子IX無功能。即使它被羧化，該Gla結(jié)構(gòu)域也取決于正確功能的前肽的裂解，因?yàn)楸Ａ舻那半母蓴_了與鈣和磷脂優(yōu)化結(jié)合所需的Gla結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變化。在人中，生成的成熟因子IX由肝細(xì)胞分泌至血流中作為無活性酶原，一種含有按重量計(jì)約17%碳水化合物的415個(gè)氨基酸殘基的單鏈蛋白(Schmidt,A. E.等人(2003)Trends CardiovascMed, 13 39)。成熟因子IX由在N端至C端構(gòu)型中如下的若干結(jié)構(gòu)域組成Gla結(jié)構(gòu)域、EGFl結(jié)構(gòu)域、EGF2結(jié)構(gòu)域、活化肽(AP)結(jié)構(gòu)域和蛋白酶(或催化的)結(jié)構(gòu)域。FIX含有分別由R145-A146和R180-V181形成的兩種活化肽。隨后的活化，單鏈FIX變成2鏈分子，其中這兩條鏈由連接酶和Gla結(jié)構(gòu)域的二硫鍵連接?？赏ㄟ^替代它們的活化肽、形成改變的活化特異性，來設(shè)計(jì)CF。在哺乳動(dòng)物中，成熟FIX必定由活化因子XI活化，以得到因子IXa。一旦FIX活化為FIXa，該蛋白酶結(jié)構(gòu)域提供了 FIX的催化活性。活化因子VIII (FVIIIa)是用于完全表達(dá)FIXa活性的特異性輔因子。涉及凝血的蛋白質(zhì)包括因子I、因子II、因子III、因子IV、因子V、因子VI、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、蛋白質(zhì)C和組織因子(“凝血蛋白”)。多數(shù)凝血蛋白以酶原形式存在，其在活化時(shí)表現(xiàn)出促凝蛋白酶活性以活化其它凝血蛋白，促進(jìn)內(nèi)源性或外源性凝血途徑和血塊形成。在凝血級(jí)聯(lián)的內(nèi)源性途徑中，F(xiàn)IX與活化因子VIII、因子X、鈣和磷脂復(fù)合物相關(guān)。在該復(fù)合物中，F(xiàn)IX由因子XIa活化。因子 IX 的活化由從分子(Bajaj 等人，Human factor IX and factor IXa, in METHODS INENZYMOLOGY. 1993)中兩步移除活化肽(Ala 146-Arg 180)實(shí)現(xiàn)。通過因子XIa或因子VIIa/組織因子在Argl45-Alal46位點(diǎn)進(jìn)行第一次裂解。第二次和限速裂解在Arg 180-Val181處進(jìn)行?；罨瞥?35個(gè)殘基?；罨娜艘蜃覫X以C端重鏈(28kDa)和N端輕鏈(ISkDa)(通過連接酶和Gla結(jié)構(gòu)域的一個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起)的異源二聚體存在。因子Ixa與活化的因子VIII —起輪流活化因子X?；蛘?，因子IX和X都可以通過與脂化組織因子復(fù)合的因子VIIa活化，經(jīng)由外源性途徑產(chǎn)生。因子Xa隨后參與最終共同途徑，由此凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟福⑶夷敢来问估w維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白以形成凝塊。凝血過程缺陷可導(dǎo)致出血疾患，在該疾患中血塊形成的時(shí)間延長(zhǎng)。這種缺陷可能是天生的或后天的。例如，血友病A和B是特征在于分別缺乏因子VIII (FVIII)和FIX的遺傳疾病。用這些蛋白質(zhì)(通常制備為重組蛋白質(zhì))的補(bǔ)充療法可以用于治療性干預(yù)血友病B(Christmas病)和因子IX-相關(guān)的出血疾患。因子IX可以用于治療這兩種病癥。然而，在某些情況下，患者發(fā)展了抗所施用蛋白質(zhì)的抗體，所述抗體降低或取消了治療效應(yīng)。本發(fā)明考慮在CFXTEN組合物中加入與FIX序列具有同源性的FIX序列、例如來自 人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、哺乳動(dòng)物(包括家養(yǎng)動(dòng)物)的天然的序列片段、以及保留了 FIX的至少一部分生物活性或生物學(xué)功能和/或用于預(yù)防、治療、調(diào)節(jié)或緩解凝血因子相關(guān)的疾病、缺乏、疾患或病癥(例如，與凝血因子缺乏的創(chuàng)傷、手術(shù)相關(guān)的出血事件)的非天然序列變體。與人FIX同源的序列可以通過標(biāo)準(zhǔn)同源性檢索技術(shù)例如NCBI BLAST來發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，加入主題組合物的FIX是具有對(duì)應(yīng)于天然存在蛋白質(zhì)的序列的重組多肽。在另一實(shí)施方案中，F(xiàn)IX是天然序列的序列變體、片段、同源物或模擬物，保留了相應(yīng)天然FIX的至少一部分生物活性。表I提供了本發(fā)明CFXTEN融合蛋白所涵蓋的、FIX氨基酸序列的非限制性列表。待加入融合蛋白組合物的任何FIX序列或同源衍生物可以通過改組表I的氨基酸序列之間的個(gè)體突變而構(gòu)建，并評(píng)估其活性。保留天然FIX的至少一部分生物活性的FIX序列或同源衍生物可用于本發(fā)明的融合蛋白組合物?？杉尤隒FXTEN融合蛋白的FIX包括與選自表I的氨基酸序列相比具有至少約80 %序列同一性、或可選地 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列同一性的蛋白質(zhì)。表I :FK氨基酸和核酸序列名稱__雜糾列_
FIX 前體多 MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVO 肽GNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDIN
SYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKWCSCTEGYRLAENQK SCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRV VGGEDAKPGQFPWQWLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITWAGEH NIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNA
權(quán)利要求
1.一種分離的因子VII多肽，其包含延伸重組多肽(XTEN)，所述XTEN包含至少200個(gè)氨基酸殘基，其中所述因子IX多肽當(dāng)施用給受試者時(shí)表現(xiàn)出大于約12小時(shí)的終末半衰期。
2.權(quán)利要求I所述的分離的因子IX多肽，其中所述因子IX多肽當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)與選自表2的序列相比表現(xiàn)出至少90%序列同一性。
3.權(quán)利要求I或2所述的分離的因子IX多肽，其中所述因子VII在其C-端與所述XTEN連接。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其與XTEN經(jīng)由可由哺乳動(dòng)物蛋白酶裂解的裂解序列連接，所述哺乳動(dòng)物蛋白酶選自由因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP_12、MMP13、MMP-17和MMP-20組成的組。
5.權(quán)利要求4所述的分離的因子IX多肽，其中通過哺乳動(dòng)物蛋白酶引起的在所述裂解序列處的裂解從所述因子IX多肽釋放所述XTEN。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其中所述XTEN的特征在于 (a)XTEN氨基酸殘基的累計(jì)總數(shù)大于200至約3000個(gè)氨基酸殘基； (b)天冬酰胺和谷氨酰胺殘基的總和小于所述XTEN的總氨基酸序列的10%； (c)蛋氨酸和色氨酸殘基的總和小于所述XTEN的總氨基酸序列的2%； (d)所述XTEN序列具有小于10的亞序列得分； (e)通過GOR算法確定，所述XTEN序列具有大于90%的無規(guī)卷曲形成；和 (f)通過Chou-Fasman算法確定，所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折疊。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其表現(xiàn)出至少約4的表觀分子量因子。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其中所述XTEN表現(xiàn)出與類似長(zhǎng)度的選自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90%序列同一性。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其根據(jù)式VII來構(gòu)建 (Gla) - (XTEN) u- (EGFl) - (XTEN) v- (EGF2) - (API) - (XTEN) w- (AP2) - (XTEN) x- (Pro) - (S)y-(XTEN)z VII 其中對(duì)于每次出現(xiàn)獨(dú)立地， (a)Gla是因子IX的Gla結(jié)構(gòu)域； (b)EGFl是因子IX的EGFl結(jié)構(gòu)域； (c)EGF2是因子IXI的EFG2結(jié)構(gòu)域； (d)APl是因子IX的激活肽結(jié)構(gòu)域的一部分； (e)AP2是包括至少第一裂解序列的因子IX的激活肽結(jié)構(gòu)域的一部分； (f)PRO是因子IX的蛋白酶結(jié)構(gòu)域； (g)S是具有I至約50個(gè)氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選包括裂解序列； (h)XTEN是延伸重組多肽，所述延伸重組多肽表現(xiàn)出與類似長(zhǎng)度的選自表4、表9、表10、表11、表12或表13的氨基酸序列具有至少90%序列同一性；(i)u是 O 或 I ；(j) V 是 或 I ；(k) X 是 O 或 I ; (l)y是O或I ;且 (m) z是O或I,條件是u+v+x+y+z彡I。
10.權(quán)利要求9所述的分離的因子IX多肽，其中y=I且S包含可由哺乳動(dòng)物蛋白酶裂解的裂解序列，所述哺乳動(dòng)物蛋白酶選自由FXIa、FXIIa、激肽釋放酶、FVIIa, FIXa, FXa,FIIa(凝血酶)、彈性蛋白酶-2、MMP-12、MMP13、MMP-17和MMP-20組成的組。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其包含一個(gè)以上的XTEN。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，其中所述XTEN在所述因子IX中包含的任何兩個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)域之間引入，其中所述兩個(gè)相鄰結(jié)構(gòu)域選自由Gla、EGFl、EGF2、AP和肽酶SI (Pro)組成的組。
13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的分離的因子IX多肽，特征在于 (i)與以類似摩爾劑量施用給哺乳動(dòng)物時(shí)的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，所述分離的因子IX多肽在施用給哺乳動(dòng)物時(shí)具有更長(zhǎng)的終末半衰期； ( )與以另外等同的劑量方案施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，當(dāng)較小摩爾量的所述因子IX多肽施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的曲線下面積(AUC)； (iii)與以另外等同的劑量方案施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相t匕，當(dāng)較小摩爾量的所述因子IX多肽施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的治療效應(yīng)； (iv)與以另外等同的摩爾量施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，當(dāng)所述因子IX多肽以較低頻率施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的曲線下面積(AUC)； (v)與以另外等同的摩爾量施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，當(dāng)所述因子IX多肽以較低頻率施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的治療效應(yīng)； (vi)與以另外等同的劑量期施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，當(dāng)累積較小摩爾量的所述因子IX多肽施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的曲線下面積(AUC);或 (vii)與以另外等同的劑量期施用給哺乳動(dòng)物的缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX相比，當(dāng)累積較小摩爾量的所述因子IX多肽施用給哺乳動(dòng)物時(shí)，所述因子IX多肽達(dá)到與缺少所述XTEN的相應(yīng)因子IX類似的治療效應(yīng)。
14.一種治療受試者的凝血紊亂的方法，其包括給所述受試者施用包含治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的因子IX多肽的組合物。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述凝血紊亂是血友病B。
16.一種治療受試者的出血事件的方法，其包括給所述受試者施用包含治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的因子IX多肽的組合物。
17.一種治療受試者的凝血蛋白不足的方法，其包括給所述受試者施用包含治療有效量的權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的因子IX的組合物。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述凝血蛋白替換野生型因子VII、因子IX或因子xi
全文摘要
本發(fā)明涉及包含與延伸重組多肽(XTEN)連接的因子DC凝血因子的組合物、編碼所述組合物的分離的核酸和含有所述分離的核酸的載體和宿主細(xì)胞，以及制備所述組合物的方法和使用所述組合物治療凝血因子相關(guān)的疾病、疾患和病癥的方法。
文檔編號(hào)C07K14/475GK102741275SQ201080047903
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者B·斯平克, C-W·王, J·西爾維爾曼, N·C·吉特欣格, V·舍倫貝格爾, W·P·斯特默, W·托 申請(qǐng)人:阿穆尼克斯運(yùn)營(yíng)公司