一種冷沉淀的制備方法以及用其制備凝血因子Ⅷ制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備冷沉淀的方法，它包括如下步驟：（1）融化：取新鮮冰凍血漿，升溫，得溫度為0～5℃融化血漿；（2）過濾：在融化血漿溫度為0～5℃的條件下，過濾，得濾液和濾渣；（3）離心：在濾液溫度為0～5℃的條件下，離心，得沉淀；（4）合并步驟（2）得到的濾渣和步驟（3）得到的沉淀，即為冷沉淀。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，制備的冷沉淀收率高，人凝血因子Ⅷ含量高，工業(yè)應(yīng)用前景良好。
【專利說明】—種冷沉淀的制備方法以及用其制備凝血因子WI制劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及血液制品的制備方法，特別涉及一種冷沉淀的制備方法以及用其制備凝血因子珊的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]冷沉淀是新鮮冰凍血漿在低溫條件下不溶解的白色沉淀物，主要含有第珊因子、纖維蛋白原、血管性血友病因子(VWF)、第XIII因子以及纖連蛋白等成分，是制備人凝血因子VDI制劑的原料。
[0003]目前，血漿的冷沉淀制備方法有兩種:快速融化離心法和虹吸法。虹吸法制得的冷沉淀中，人凝血因子VIII含量低，目前通常采用快速融化離心法。
[0004]快速融化離心法的具體步驟為:取出待制備冷沉淀的新鮮冰凍血漿，置4±2°C冰箱中過夜融化或在4 ± 2°C水浴裝置中融化；當(dāng)血漿基本融化時(shí)，取出血漿，在4± 2°C的環(huán)境下離心，離心的沉淀即為冷沉淀。但是，該方法制得的冷沉淀的量較少，通常每噸血漿僅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子珊的含量為39.951IU/g (見營(yíng)長(zhǎng)永等，“人凝血因子VIII分離純化工藝研究”，山東大學(xué)碩士學(xué)位論文)，對(duì)冷沉淀進(jìn)一步分離純化制得的人凝血因子VDI制劑的量也比較少，造成血漿資源的浪費(fèi)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的冷沉淀制備方法。
[0006]本發(fā)明制備冷沉淀`的方法，它包括如下步驟:
[0007]( I)融化:取新鮮冰凍血漿，升溫，得溫度為O~5°C融化血漿；
[0008](2)過濾:在融化血漿溫度為O~5°C的條件下，過濾，得濾液和濾渣；
[0009](3)離心:在濾液溫度為O~5°C的條件下，離心，得沉淀；
[0010](4)合并步驟(2)得到的濾渣和步驟(3)得到的沉淀，即為冷沉淀。
[0011]步驟(1)所述融化包括如下兩個(gè)步驟:
[0012]a、預(yù)融化:將新鮮冰凍血漿靜置于O~2°C環(huán)境中，使血漿升溫至-10°C~0°C ；
[0013]b、融化:再升溫，得O~5 °C融化血漿。
[0014]步驟a中，所述環(huán)境溫度為0°C。
[0015]步驟b中，所述升溫的方法是25~37°C水浴。
[0016]步驟(2)中，所述過濾采用堰式濾器過濾。
[0017]步驟(3)中，所述離心的離心力為14000~15900g。優(yōu)選地，所述離心采用型號(hào)為GQ142的高速管式離心機(jī)離心。
[0018]本發(fā)明制備凝血因子VDI的方法，它包括如下步驟:
[0019]a、按照前述方法制備冷沉淀；
[0020]b、溶解冷沉淀；[0021]C、用聚乙二醇沉淀法沉淀，離心，得上清；
[0022]d、SD法病毒滅活；
[0023]e、采用離子交換層析法或者用氯化鈉/甘氨酸鹽析法純化；
[0024]f、除菌、分裝、凍干、干熱滅活，即可。
[0025]步驟b中，溶解冷沉淀采用的緩沖液為0.02MTris緩沖液。
[0026]步驟c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇沉淀。
[0027]步驟e中，所述離子交換層析采用的凝膠為Toyopearl DEAE650M,緩沖液為0.0OlM~0.05M的枸櫞酸鈉緩沖液。
[0028]步驟e中，所述鹽析法采用氯化鈉/甘氨酸沉淀。
[0029]采用本發(fā)明方法制備冷沉淀，每噸血漿可以制備得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子珊的含量為39.43IU/g，有效提高了單位血漿制得的冷沉淀的量，也提高了單位血漿制得的人凝血因子珊制劑的量，經(jīng)濟(jì)效益好，充分利用了血漿資源，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前
景
[0030]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0031]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0032]實(shí)施例1用本發(fā)明方法制備冷沉淀
[0033]1、實(shí)驗(yàn)儀器
[0034]堰式濾器:型號(hào)是FL-2023堰式罐形過濾器；
[0035]連續(xù)離心機(jī):GQ142的高速管式離心機(jī)離心。
[0036]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0037]( I)新鮮健康人血漿采集后，-20 V保存，不超過3年；
[0038](2)預(yù)融化:將新鮮冰凍血漿2500L (即2575Kg，人凝血因子VDI的含量為2500，000IU)，放置在環(huán)境溫度為0°C的條件下，升溫至-10°c~o°c ；
[0039](3)融化:在25°C水浴中融化，將血漿升溫至O~5°C，得融化血漿；
[0040](4)過濾:在維持融化血漿溫度為O~5°C條件下，采用堰式濾器過濾過濾，得濾液和濾渣；
[0041](5)離心:在維持濾液溫度為O~5°C條件下，采用連續(xù)離心機(jī)對(duì)濾液進(jìn)行離心，離心力為15900g，得沉淀；
[0042](6)合并步驟(4)得到的濾渣和步驟(5)得到的沉淀，即為冷沉淀。
[0043]稱量冷沉淀的重量,檢測(cè)冷沉淀中人凝血因子VDI的含量。
[0044]2、檢測(cè)結(jié)果
[0045]經(jīng)過檢測(cè),步驟(4)的濾洛重量為6.18kg,其人凝血因子VDI的含量為41IU/g,步驟
(5)的沉淀中，濾渣重量為22.5kg，其人凝血因子VDI的含量為39IU/g，將二者合并后得到的本發(fā)明冷沉淀，總重量為28.68Kg，冷沉淀中人凝血因子VDI的含量為39.43IU/g。[0046]因此，采用本發(fā)明方法制備冷沉淀，每噸血漿可以制備得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子VDI的含量為39.43IU/g，其中，過濾獲得冷沉淀為2.4Kg，占比21.55%，其人凝血因子VDI的含量為41IU/g，離心獲得冷沉淀為8.74Kg，占比78.45%，其人凝血因子VDI的含量為39IU/g。
[0047]實(shí)施例2用本發(fā)明方法制備冷沉淀
[0048]1、實(shí)驗(yàn)儀器
[0049]堰式濾器:型號(hào)是FL-2023堰式罐形過濾器；
[0050]連續(xù)離心機(jī):GQ142的高速管式離心機(jī)離心。
[0051]2、實(shí)驗(yàn)方法
[0052](I)新鮮健康人血漿采集后，-20 V保存，不超過3年；
[0053](2)預(yù)融化:將新鮮冰凍血漿2500L (即2575Kg，人凝血因子VDI的含量為2500，000IU)，放置在環(huán)境溫度為2°C的條件下，升溫至-10°c~0°C ；
[0054](3)融化:在37°C水浴中融化，將血漿升溫至O~5°C，得融化血漿；
[0055](4)過濾:在維持融化血漿溫度為O~5°C條件下，采用堰式濾器過濾過濾，得濾液和濾渣；
[0056](5)離心:在維持濾液溫度為O~5°C條件下，采用連續(xù)離心機(jī)對(duì)濾液進(jìn)行離心，離心力為14000g，得沉淀；
[0057](6)合并步驟(4)得`到的濾渣和步驟(5)得到的沉淀，即為冷沉淀。
[0058]實(shí)施例3采用本發(fā)明冷沉淀制備人凝血因子VDI制劑
[0059]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0060]實(shí)施例1步驟(4)過濾獲得的冷沉淀(濾渣)300g (重復(fù)三次)以及實(shí)施例1步驟
(5)離心獲得的冷沉淀(沉淀)(重量分別為3.8kg、3.525kg、2kg)分別按照如下方法純化制備人凝血因子VDI:
[0061](I)將冷沉淀用0.02M氨丁三醇(Tris)緩沖液溶解，30%聚乙二醇沉淀，離心，得
上清；
[0062](2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最終濃度分別為1%和0.3%, 250C ±1°C處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活(即SD病毒滅活)；
[0063](3)氯化鈉/氨基酸鹽析:SD病毒滅活結(jié)束后，加入液體體積15% (w/v)的氯化鈉和7.5% (w/v)的甘氨酸進(jìn)行沉淀，4000rpm離心,收集沉淀；
[0064](4)超濾配制:用含0.01M枸櫞酸鈉、0.0OlM氯化鈣、0.19M鹽酸精氨酸的緩沖液對(duì)步驟I獲得的洗脫液進(jìn)行超濾透析，制得的溶液成分為人凝血因子珊、枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸，超濾完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的濃度為8g/L的比例，得超濾液；
[0065](5)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C 72小時(shí)的干熱處理，即得終產(chǎn)品:人凝血因子VIII制劑。
[0066]檢測(cè)各步驟產(chǎn)物以及終產(chǎn)品的效價(jià)，計(jì)算效價(jià)回收率。
[0067]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068]實(shí)施例1步驟(4)過濾獲得的冷沉淀的檢測(cè)結(jié)果如下表1:
[0069]表1人凝血因子VIII的效價(jià)回收[0070]
【權(quán)利要求】
1.一種制備冷沉淀的方法，其特征在于:它包括如下步驟: (1)融化:取新鮮冰凍血漿，升溫，得溫度為O~5°C融化血漿； (2)過濾:在融化血漿溫度為O~5°C的條件下，過濾，得濾液和濾渣； (3)離心:在濾液溫度為O~5°C的條件下，離心，得沉淀； (4)合并步驟(2)得到的濾渣和步驟(3)得到的沉淀，即為冷沉淀。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)所述融化包括如下兩個(gè)步驟:a、預(yù)融化:將新鮮冰凍血漿靜置于O~2°C環(huán)境中，使血漿升溫至-10°C~0°C； b、融化:再升溫，得O~5°C融化血漿。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟a中，所述環(huán)境溫度為0°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:步驟b中，所述升溫的方法是25~37°C水浴。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述過濾采用堰式濾器過濾。
6.根據(jù) 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述離心的離心力為14000 ~15900g。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述離心采用型號(hào)為GQ142的高速管式離心機(jī)離心。
8.一種制備凝血因子珊制劑的方法，其特征在于:它包括如下步驟: a、按照權(quán)利要求1~7任意一項(xiàng)所述方法制備冷沉淀； b、溶解冷沉淀； C、用聚乙二醇沉淀法沉淀，離心，得上清； d、SD法病毒滅活； e、采用離子交換層析法或者用氯化鈉/甘氨酸鹽析法純化； f、除菌、分裝、凍干、干熱滅活，即可。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:步驟b中，溶解冷沉淀采用的緩沖液為，0.02MTris 緩沖液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:步驟c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇進(jìn)行沉淀； 步驟e中，所述離子交換層析采用的凝膠為Toyopearl DEAE650M，緩沖液為0.0OlM~，0.05M的枸櫞酸鈉緩沖液； 步驟e中，所述氯化鈉/甘氨酸鹽析法中，溶液中氯化鈉的終濃度為15%(w/v)，甘氨酸的終濃度為7.5% (w/v)0
【文檔編號(hào)】C07K14/755GK103848886SQ201410121302
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】牟蕾, 魯濤, 初毅波, 苗松, 鄧紅, 王黔川, 李偉, 余偉 申請(qǐng)人:成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司