一種凝血因子基因突變的定點修復載體系統(tǒng)及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及凝血因子基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種凝血因子的原位修復方法 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 人類的凝血過程是由各種凝血因子(如凝血因子1、11、￥111、1乂、乂、乂1)等參與的一 個級聯(lián)反應(yīng)，在此反應(yīng)中的任何一種因子發(fā)生突變都可能導致級聯(lián)反應(yīng)無法進行，凝血過 程無法完成，臨床上就表現(xiàn)為凝血障礙、自發(fā)性出血(尤其發(fā)生在關(guān)節(jié)、肌肉以及軟組織。） 等血友病的癥狀。而絕大多數(shù)血友病是由于表達凝血因子VIIKFVIII或F8因子)或IX(FIX 或F9因子)的基因發(fā)生突變所導致的。其中由于VIII基因突變所造成凝血障礙稱為A型血友 病。VIII基因編碼凝血因子VIII，后者是一種血漿中的糖蛋白。在正常生理條件下與von Wi lebrand因子(vWF)結(jié)合，呈現(xiàn)靜息狀態(tài)。一旦機體出現(xiàn)傷口流血，便會通過凝血級連反應(yīng) 激活VIII因子，使得VIII因子脫離vWF，進而與IX因子結(jié)合一同切割X因子前體使其成為成 熟的Xa后者最終將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白引發(fā)凝血。目前，50~60 %的A型血友病是由 于編碼VIII因子的基因在蛋白活性區(qū)域發(fā)生錯意、終止突變而導致的，而其余40~50%的 發(fā)病是由于VIII基因內(nèi)部的重排和倒位所致。A型血友病患者占血友病發(fā)病總數(shù)的70~ 80%』型血友?。蜃覫X缺乏癥）的病因是由于上述反應(yīng)中表達凝血因子IX的基因 (Xq27.1)發(fā)生突變，導致凝血因子IX表達被提前終止或其蛋白質(zhì)功能喪失所導致的一種性 連鎖隱性遺傳疾病，其發(fā)病率約占血友病患者總?cè)藬?shù)的25%。凝血因子VIII與IX都位于人 類X染色體上，由于人類女性有兩條X染色體而男性只帶有一條X染色體，故此A/B型血友病 主要在男性中發(fā)病，男性A型血友病的發(fā)病率約為1/5000~1/10000;B型約為1/20000~1/ 30000。女性則多為一條X染色體上VIII基因或IX基因突變的攜帶者。另外，在沒有家族史的 病例中有多達1/3的病例是由于相關(guān)基因自發(fā)突變而發(fā)病的。
[0003] 臨床上根據(jù)血友病患者血液中相應(yīng)凝血因子的含量來劃分其病情。含量在0. Οδ-Ο. 40IU/mL 的為輕度患者 ，其發(fā)病表現(xiàn)主要為重大創(chuàng)傷或手術(shù)后大量流血 ，自 發(fā)性流血較為 少見;含量在0.01-0. 〇5IU/mL的為中度患者，其發(fā)病主要為微創(chuàng)手術(shù)后持續(xù)性流血或偶爾 伴有自發(fā)性流血;含量少于0.01IU/mL的則為重度患者，可見關(guān)節(jié)或肌肉的自發(fā)性流血。
[0004] 在過去30年間人類各個凝血因子的基因序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已經(jīng)被徹底解析。然而 對于血友病的治療手段進展卻較為緩慢。目前主要的臨床治療手段仍然為重組VIII因子或 IX因子的替代療法。這種方法雖能暫時緩解病情，但卻無法修復已經(jīng)突變的基因組，根治血 友病。重組因子在體內(nèi)會因半衰期逐漸被代謝，所以患者往往需要終身進行重組因子的注 射，總體費用十分昂貴。而在基因治療方面主要利用逆轉(zhuǎn)錄或腺相關(guān)病毒作為載體，將表達 凝血因子VIII或IX的基因輸送到患者體內(nèi)。已有臨床數(shù)據(jù)表明利用一種新型的腺相關(guān)病毒 載體能夠在病人體內(nèi)表達足夠量的IX因子將重型血友病患者緩解為輕型使其恢復基本生 活質(zhì)量。然而這種治療方法也存在著一些弊端。首先雖然腺相關(guān)病毒在大多數(shù)情況下只是 將外源基因插入到人類的安全位點(AAVS1)但是如果內(nèi)源基因發(fā)生隨機斷裂，也不能排除 病毒外源片段被插入到隨機斷裂DNA處的可能性，這種病毒基因在體內(nèi)的隨機整合是各種 癌癥的重大隱患。其次，雖然AAV會將部分外源基因在AAVS1位點能夠穩(wěn)定表達，但經(jīng)過長時 間的表達之后外源基因的啟動子可能會被機體的保護機制沉默導致療效下降，而且整合率 非常低，通常不能達到治療效果。雖然腺相關(guān)病毒能夠進入肝細胞進行復制并表達人的IX 因子，但由于病毒的基因組絕大部分是游離基因組，在肝細胞分裂增殖后將會丟失而失去 外源基因的表達而失去療效，并且由于病毒介導的基因治療會產(chǎn)生針對病毒的抗體，使得 同一血清型的病毒只能在同一個身上使用一次而不能進行二次治療，因此凝血因子基因的 穩(wěn)定表達是非常關(guān)鍵的。因此直接將外源凝血因子基因通過病毒導入到人體進行基因治療 很難達到長期有效，這是目前相關(guān)臨床研究的難題。另外，在自然情況下人體的凝血因子表 達受到內(nèi)源基因啟動子、增強子等的共同調(diào)控，從而對外界刺激(如傷口流血)做出應(yīng)答。而 位于AAVS1位點異位表達的凝血因子則不受內(nèi)源FVIII/FIX基因啟動子、增強子等上下游序 列的調(diào)控，存在潛在的致病危險性。
[0005] 隨著基因編輯技術(shù)的崛起，人們開始使用ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等技術(shù)對凝血因 子的基因編輯進行研究。其中ZFN技術(shù)是由一種能夠靶向特定DNA序列的鋅指蛋白組合和 Type IIS核酸內(nèi)切酶(如FokI)融合組成的人工重組蛋白。一般情況下FokI被改造成需要通 過二聚體發(fā)揮作用，所以需要一對靶向特定序列的ZFN，F(xiàn)okI才能夠切開DNA。通過在受精卵 階段顯微注射編碼ZFN的DNA或相應(yīng)mRNA，已實現(xiàn)對大鼠，小鼠，斑馬魚等模式生物的基因敲 除。雖然ZFN技術(shù)已經(jīng)在很大程度上使得基因編輯簡單化，不過其自身也存在一些不容忽視 的缺陷。比如對于不同的靶點序列需要構(gòu)建不同的ZFN表達載體，減緩了實驗速度，且鋅指 對于DNA的特異性會受到上下游鋅指結(jié)構(gòu)的影響，使得研究人員不得不對構(gòu)建好的鋅指進 行特異性篩選，從而再次使得實驗變的繁瑣且費時。
[0006] TALEN技術(shù)與ZFN技術(shù)類似，是將能夠與特定DNA序列結(jié)合的類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)元件 與卩〇1^1、1116831111〇16386等核酸酶融合形成人工核酸酶。141^1'1的0嫩結(jié)合域與2?1'1類似也是由 多個元件(TALE)構(gòu)成，每個TALE模塊由34個氨基酸組成其中第12、13位氨基酸負責識別特 異的DNA堿基。相比ZFN，TALEN的優(yōu)點在于每一個TALE模塊識別的DNA堿基是相互獨立且一 一對應(yīng)的，所以在特異性和效率上TALEN比ZFN更高。不過其缺點也與ZFN類似:對于新的靶 點需要重新構(gòu)建對應(yīng)的TALEN序列，而且切割DNA的活性不夠高。
[0007] 近幾年出現(xiàn)的CRISPR/Cas技術(shù)由于其高效和靈活性正被越來越多的使用到基因 編輯和治療的研究中。CRISPR/Cas來源于古細菌的一種抵御質(zhì)粒、噬菌體等外源DNA片段入 侵的獲得性免疫機制:在外源噬菌體入侵細菌后，CRISPR/Cas系統(tǒng)中的Cas蛋白能夠捕獲外 源噬菌體DNA的DNA將其整合如自身的基因組中，并轉(zhuǎn)錄成tracr: CrRNA復合RNA。這種復合 RNA能夠與CRISPR/Cas系統(tǒng)中的核酸酶Cas9結(jié)合并通過RNA與DNA的堿基互補將Cas9引導至 外源噬菌體DNA上，此時只要滿足RNA: DNA互補鏈的3 '端緊跟一個PAM序列(對于s. pyCas9來 說PAM序列為NGG)那么Cas9核酸酶就能夠?qū)⑺Y(jié)合的雙鏈DNA切斷。作為CRISPR/Cas系統(tǒng)的 核心部件，Cas9包含三個RuvC核酸酶結(jié)構(gòu)域、一個HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域以及一個羥基端的PAM 結(jié)合域。研究發(fā)現(xiàn)PAM結(jié)合域?qū)τ贑a s 9與DNA的結(jié)合以及Ca s 9的酶活起到了至關(guān)重要的作 用。而三個RuvC結(jié)構(gòu)域與一個HNH結(jié)構(gòu)域則分別切割雙鏈DNA的兩條鏈。經(jīng)過證實，突變氮端 RuvCI結(jié)構(gòu)域中的第10位天冬氨酸(D)為丙氨酸(A)，或者突變HNH結(jié)構(gòu)域中第840位的組氨 酸(H)為丙氨酸(A)都能夠使Cas9變成只切割單鏈DNA的切口酶。為了使CRISPR/Cas系統(tǒng)更 為方便地運用到基因編輯當中，研究人員改造了tracr:CrRNA使得原本獨立的tracRNA和 CrRNA融合表達成為新的單鏈引導RNA(sgRNA)。如此一來，在CRISPR/Cas系統(tǒng)中，靶向不同 的DNA序列只需要合成新的sgRNA，這使CRISPR/Cas技術(shù)在基因編輯中變的相當靈活，免去 了CRISPR/Cas系統(tǒng)出現(xiàn)之前TALEN與ZFN系統(tǒng)中需要重新構(gòu)建載體的繁瑣步驟。
[0008] Nathwani ,A.^A(Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.New England Journal of Medicine,365(25),2357-2365)報 道了一種臨床上對于B型血友病的基因治療方法，包括給6位患者靜脈注射了表達人類FIX 因子完整編碼序列的AAV8病毒。治療過程中并沒有使用免疫抑制類藥物。治療16個月后，在 所有參與患者血液內(nèi)均檢測到了 FIX因子，所有患者均出現(xiàn)一定程度的癥狀緩解或減輕。然 而，該報道也指出這種利用AAV8病毒直接轉(zhuǎn)基因整合，其缺點在于整合效率較低并且整合 的基因有可能再次被機體沉默，因此需要進一步改進。
[0009] Park, C.-Y等人(Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9.Cell Stem Cell ,2015)報道了一種將CRISPR/Cas系統(tǒng)轉(zhuǎn)入到由A型血友病患者誘導 而來的IPS細胞內(nèi)的研究方法。與上文一樣，Park, C等人（Targeted inversion and reversion of the blood coagulation factor8gene in human iPS cells using TALENs.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(25) ,9253-9258.)也報道了一種基于iPS細胞的研究方法，即利用TALEN在 iPS細胞中造成DSB，將FVIII基因上跨度140kbp的序列顛倒，已造成一個人工血友病A的模 式細胞，然后利用同樣的方法將這140kbp的序列在iPS細胞中再次顛倒回來。然而，這些方 法所利用CRISPR/Cas或TALEN的方法都是在iPS細胞模型中的簡單嘗試，而iPS由于其有隨 機突變的風險所以其最終用于臨床的缺陷還沒有被突破。
[0010] 綜上所述，目前以上針對凝血因子的基因編輯研究都是采用基因替代或基因整合 的方法，就是將一個完整的外源性凝血因子的表達框通過表達載體(例如表達質(zhì)粒)導入缺 陷細胞內(nèi)，從而發(fā)揮作用以替代缺陷的基因。例如，是利用腺相關(guān)病毒的特性定點整合入安 全位點AAVS1。然后這種基因方法需要將完整外源基因?qū)肴毕菁毎?，所導入的基因系統(tǒng) 過大將影響基因?qū)氲男屎蜏蚀_度。此外，該技術(shù)本身并沒有得到修復該缺陷基因，因此 需要不斷地進行持續(xù)導入，從而影響到基因編輯的研究效果。
[0011]理論上，針對凝血因子突變基因最理想的研究策略是原位修復，即直接將缺陷基 因在原位通過基因互補技術(shù)使得基因修復完整，從而為下一步的是否進行基因治療提供參 考依據(jù)。因此開發(fā)一種針對凝血因子突變位點進行原位修復的研究方法，這對于進一步的 臨床治療方法的研發(fā)尤為重要。
[0012]中國專利申請201510053175.3、發(fā)明名稱"人凝血因子VIII基因22號內(nèi)含子倒位 型突變的原位修復質(zhì)粒、試劑盒及方法"公開了利用TALENs系統(tǒng)將F8因子23-26號外顯子的 編碼序列及polyA信號通過同源重組的方式添加到22號外顯子及其內(nèi)含子的交界處，從而 將22號內(nèi)含子倒位型突變的F8基因的遺傳信息補全。盡管該方法能夠通過原位修復的方式 在一定程度上修復凝血因子F8,然而，該方法需要導入多個完整基因（即23-26號外顯子）， 其仍然需要過于龐大的TALENs系統(tǒng)，并且并不適合其他的基因缺陷，例如缺失突變、重復突 變、異位突變等。此外，由于凝血因子F9和F8發(fā)生突變的主要類型的不同，天然情況下大約 只有40-50%的F8基因突變是22號染色題的倒位，而F9的突變則主要是單個或多個單堿基 組合的點突變，因此該方法并不適合原位修復凝血因子F9。
[0013] 因此，目前需要利用改進的CRISPR/Cas系統(tǒng)，提供一種針對凝血因子突變位點進 行原位修復的研究方法。
【發(fā)明