能夠引起促凝血活性的識別組織因子途徑抑制劑的n-末端部分的抗體的制作方法
【專利說明】能夠引起促凝血活性的識別組織因子途徑抑制劑的N-末端部 分的抗體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及促凝血抗體和其組合物，所述抗體能夠特異性結(jié)合組織因子途徑抑制 劑(TFPI)的N-末端部分中的表位。本發(fā)明還涉及所述抗體的藥學(xué)和治療用途。
[0002] 背景 在出血個體中，當(dāng)血管外組織因子(TF)暴露于血液中的活化因子VII (FVIIa)時，凝血 通過TF/FVIIa復(fù)合物起始。TF/FVIIa復(fù)合物形成導(dǎo)致因子X (FX)激活成FXa，其連同活化因 子V (FVa)-起產(chǎn)生有限量的凝血酶。起始量的凝血酶激活血小板，其進(jìn)而導(dǎo)致血小板磷脂 的表面暴露，血小板磷脂支持了由活化因子VIII (FVIIIa)和活化因子IX (FIXa)組成的 tenase復(fù)合物的裝配和結(jié)合。tenase復(fù)合物是FX激活的非常有效的催化劑，和在該步驟中 產(chǎn)生的FXa用作負(fù)責(zé)最終凝血酶突發(fā)的FVa/FXa凝血酶原酶復(fù)合物中的活性蛋白酶。凝血酶 裂解纖維蛋白原以產(chǎn)生纖維蛋白單體，其聚合以形成纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)?？焖俸痛罅康哪?突發(fā)是形成固體和穩(wěn)定纖維蛋白凝塊的必要條件。
[0003] 由FVIII或FIX缺乏引起的FXa和凝血酶產(chǎn)生的不充分增長分別是血友病A或B患者 的出血素質(zhì)的根本原因。在患有血友病的人中，F(xiàn)Xa產(chǎn)生主要受TF/FVIIa復(fù)合物驅(qū)動:FVIII 或FIX缺乏導(dǎo)致通過tenase復(fù)合物的初步FXa產(chǎn)生。然而，TF/FVIIa-介導(dǎo)的FX激活成FXa是 暫時的，因為在自調(diào)節(jié)回路中組織因子途徑抑制劑(TFPI)抑制TF/FVIIa復(fù)合物。反饋抑制 導(dǎo)致形成TF/FVIIa/FXa/TFPI復(fù)合物。TFPI抑制的鈍化在起始凝血期間延長TF/FVIIa-介導(dǎo) 的FX激活，并促進(jìn)止血。由于例如FVIII或FIX缺乏所致，血友病患者罹患受損的tenase活 性。在這些患者中，TFPI抑制的阻斷可補(bǔ)償不充分的FXa產(chǎn)生和使出血素質(zhì)正?；?。
[0004] TFPI是緩慢的緊密-結(jié)合競爭性抑制劑，其通過抑制FXa和TF/FVIIa復(fù)合物兩者調(diào) 節(jié)FX激活。TFPI包含三個串聯(lián)排列的Kunitz-型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(KPI 1-3) JXa的TFPI 抑制發(fā)生在二相反應(yīng)中，其最初產(chǎn)生松散的TFPI-FXa復(fù)合物，然后緩慢重排成緊密結(jié)合的 TFPI-FXa復(fù)合物，其中KPI-2結(jié)合和阻斷FXa的活性位點。開始凝血后，TF/FVIIa-介導(dǎo)的FXa 產(chǎn)生被TFPI嚴(yán)格減量調(diào)節(jié)。TF/FVIIa在以下過程中被TFPI抑制，所述過程作為限速步驟，似 乎包括當(dāng)FXa結(jié)合至TF/FVIIa復(fù)合物或在TF/FVIIa復(fù)合物的附近結(jié)合到細(xì)胞膜上時FXa的 TFPI抑制（Baugh等，J Biol Chenu 1998; 273(8) :4378-86)。即1-1 有助于形成緊密的 TFPI-FXa復(fù)合物和直接結(jié)合以及阻斷TF-結(jié)合的FVIIa的活性位點（Girard等，Nature 1989; 338:518-520; Peraramelli等，Thromb. Haemost. 2012; 108:266-276)。
[0005] 在體內(nèi)，在數(shù)個細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)TFPIJFPI的主要部分與血管內(nèi)皮有關(guān)，次要部分 在血液中循環(huán)。已描述TFPI的兩種剪接變體TFPI alpha (TFPIa)和TFPI beta (TFPIP)S 在于人中。內(nèi)皮細(xì)胞是TFPI產(chǎn)生的主要部位，并表達(dá)兩種變體。內(nèi)皮細(xì)胞表面上的主要形式 推測是TFPie JFPIa被分泌至血漿中或存在于胞內(nèi)儲庫，其可在某種刺激時被釋放。分泌的 TFPIa在血液中作為全長蛋白（10%)或作為具有不同的分子質(zhì)量的修飾的蛋白（90%)循環(huán)； 后者可由于例如C-末端區(qū)的截短或與脂蛋白締合導(dǎo)致。分泌的TFPIa還可通過與例如糖胺 聚糖相互作用結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面。TFPIa還通過血小板產(chǎn)生和貯存在血小板中。
[0006] 已知TFPI在人中的半壽期為約60-120分鐘，和已知總正常人血漿TFPI濃度為約 1.0-2.5 nM。相比之下，已知抗體在人中的半壽期很長：多至數(shù)周，這取決于免疫球蛋白亞 型、來源和具體的氨基酸組成。當(dāng)某些已知的TFPI抗體，例如公開于Augustsson等，J Thromb Haemost. 2013，11: s2, PA 4.14-2的mAb 0001 抗體與TFPI在循環(huán)中形成復(fù)合物 時，血漿中的總TFPI濃度（游離TFPI加 TFPI/抗體復(fù)合物）可上升至高達(dá)20-40 nM的濃度 (Augustsson等同上）。因此，體內(nèi)給予TFPI抗體可導(dǎo)致TFPI/抗體復(fù)合物累積至遠(yuǎn)高于TFPI 的給予前血漿濃度的濃度。在其中TFPI/抗體復(fù)合物的抑制活性未完全中和的情況下，累積 可逆轉(zhuǎn)否則促凝血的TFPI抗體的作用，導(dǎo)致凈抗凝血作用。
[0007] 本發(fā)明人展望，本文公開的抗體和包含所述抗體的藥物組合物可解決這樣的局限 性。
[0008] 簡述 本發(fā)明涉及特異性結(jié)合組織因子途徑抑制劑的N-末端部分的表位的抗體。
[0009] 在一個方面，本發(fā)明涉及TFPI抗體，其結(jié)合包含以下N-末端氨基酸殘基中的至少 一個的TFPI表位：SEQ ID NO: 1 的Leu 16、Pro 17、Leu 19、Lys 20、Leu 21、Met 22、Phe 25、Cys 35、Ala 37、Met 39、Arg 41、Tyr 56、Gly 57、Gly 58、Cys 59、Glu 60、Gly 61、Asn 62、Gln 63、Arg 65、Phe 66、Glu 67、Glu 71和Met 75。
[0010] 在本發(fā)明的一個方面，TFPI抗體表位包含以下N-末端氨基酸殘基：SEQ ID NO: I 的Arg 41、Arg 65和Glu 67。
[0011] 在一個方面，本發(fā)明的抗體通過例如與TF/FVIIa競爭結(jié)合TFPI-KPI-I，中和TF/ FVIIa復(fù)合物的TFPI抑制。TFPI (1-79)結(jié)合抗體結(jié)合、掩蔽或在構(gòu)象上改變TFPI (SEQ ID NO: 1)上的TF/FVIIa結(jié)合表面或其部分，從而在功能上阻斷TFPI-TF/FVIIa相互作用，可中 和TF/FVIIa復(fù)合物的TFPI抑制。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明的抗體中和TFPI KPI-I對導(dǎo)致在TFPI KPI-2和FXa之間形成 緊密復(fù)合物的反應(yīng)的刺激作用。
[0013] 在另一方面，本發(fā)明的TFPI (1-79)抗體結(jié)合和中和所有形式的TFPI。
[0014]在一個方面，本發(fā)明的抗體中和TFPI，甚至在其中循環(huán)中的總TFPI水平升高的環(huán) 境下，并且此外在這些條件下使凝血酶產(chǎn)生正?；?。
[0015] 本發(fā)明還涉及包含能夠特異性結(jié)合TFPI (1-79)中的表位的至少一種抗體和至少 一種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制劑。
[0016] 本發(fā)明的抗體或包含所述抗體的藥物制劑可用作藥物-例如在治療患有凝血病 的受試者中用作藥物。
[0017] 附圖簡述 圖1顯示數(shù)種TFPI (1-79)抗體對凝血酶產(chǎn)生的作用(TGT測定法），如在通過加入100 μ g/ml FVIII抗體獲得的血友病A-樣情況下使用正常人血漿(NHP)庫所測量。
[0018] 圖2顯示數(shù)種TFPI (1-79)抗體對凝血酶產(chǎn)生的作用(TGT測定法），如在通過加入5 nM重組全長TFPIa至NHP獲得的升高的TFPIa水平的情況下使用NHP庫所測量。血友病A-樣情 況通過加入100 μg/ml FVIII抗體獲得。
[0019] 序列簡述 SEQ ID NO: 1表示人TFPIa的氨基酸序列。
[0020] SEQ ID NO: 2表示TFPI (1-79)的氨基酸序列。
[0021] SEQ ID NO: 3表示TFPI (1-161)的氨基酸序列。
[0022] SEQ ID NO: 4表示單克隆抗體(mAb) 2F3的可變重鏈的氨基酸序列。
[0023] SEQ ID NO: 5表示單克隆抗體(mAb) 2F3的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0024] SEQ ID NO: 6表示單克隆抗體(mAb) 2F22的可變重鏈的氨基酸序列。
[0025] SEQ ID NO: 7表示單克隆抗體(mAb) 2F22的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0026] SEQ ID NO: 8表示單克隆抗體(mAb) 2F45的可變重鏈的氨基酸序列。
[0027] SEQ ID NO: 9表示單克隆抗體(mAb) 2F45的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0028] SEQ ID NO: 10表示單克隆抗體(mAb) 1F91的可變重鏈的氨基酸序列。
[0029] SEQ ID NO: 11表示單克隆抗體(mAb) 1F91的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0030] SEQ ID NO: 12表示單克隆抗體(mAb) 2F35的可變重鏈的氨基酸序列。
[0031] SEQ ID NO: 13表示單克隆抗體(mAb) 2F35的可變輕鏈的氨基酸序列。
[0032] SEQ ID NO: 14表示用于克隆抗體重鏈的引物的核酸序列。
[0033] SEQ ID NO: 15表示用于克隆抗體輕鏈的引物的核酸序列。
[0034] SEQ ID NO: 16表示Fab 0296的截短的鼠-人嵌合重鏈的氨基酸序列。
[0035] SEQ ID NO: 17表示單克隆抗體mAb 0294和Fab 0296的鼠-人嵌合輕鏈的氨基酸 序列。
[0036] SEQ ID NO: 18表示標(biāo)記的TFPI KPI-1/N-末端的氨基酸序列。
[0037] SEQ ID NO: 19表示單克隆抗體mAb 0294的鼠-人嵌合重鏈的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID NO: 20表示Fab 0295的截短的鼠-人嵌合重鏈的氨基酸序列。
[0039] 描述 成熟人TFPIa是276個氨基酸的蛋白（SEQ ID NO: 1)，其由酸性N-末端區(qū)、由接頭區(qū)交 替的三個串聯(lián)的Kunitz-型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(KPI-UKPI-2和KPI-3)和堿性C-末端區(qū)組 成。KPI-UKPI-2和KPI-3分別定義為SEQ ID NO: 1的殘基26-76、殘基97-147和殘基189-239。成熟TFPI0是糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定的193個氨基酸蛋白，其中前181個氨基酸與 TFPIa (對應(yīng)于SEQ IDN0: 1的殘基1-181)相同，但其中C-末端12個氨基酸序列與TFPIa無 關(guān)，并具有添加至殘基193的GPI-鍵合。
[0040] 本發(fā)明涉及能夠結(jié)合TFPI區(qū)的抗體，所述TFPI區(qū)表示TFPI的酸性N-末端區(qū)和KPI-1結(jié)構(gòu)域，或其任何部分。
[0041 ]本文使用的術(shù)語"TFPI"包括任何天然存在形式的TFPI，其可源自任何合適的生物 體。例如，按本文所述使用的TFPI可以是哺乳動物TFPI，例如人、小鼠、兔、大鼠、靈長類動 物、牛、羊或豬TFPI。優(yōu)選地，TFPI是人TFPI。TFPI可以是成熟形式的TFPI，例如已在合適細(xì) 胞內(nèi)經(jīng)歷翻譯后加工的TFPI蛋白。這樣的成熟TFPI蛋白可例如被糖基化。TFPI可以是全長 TFPI蛋白。術(shù)語TFPI還包括這樣的TFPI分子的變體、同工型和其它同源物。變體TFPI分子的 特征可在于具有與天然存在的TFPI相同類型的活性，例如中和FXa的催化活性的能力，或抑 制TF/FVIIa復(fù)合物或三元TF/FVIIa/FXa復(fù)合物的能力。
[0042]術(shù)語"抗體"在本文是指自種系免疫球蛋白序列衍生的蛋白，其能夠特異性結(jié)合抗 原或其部分：即TFPI (1-79)。術(shù)語抗體包括任何類型（或同種型）的全長抗體，即IgA、IgD、 IgE、IgG、IgM和/或IgY。特異性結(jié)合抗原或其部分的抗體可專門結(jié)合抗原或其部分，或其可 結(jié)合有限數(shù)量的同源抗原或其部分。
[0043] 天然全長抗體通常包含至少4條多肽鏈:通過二硫鍵連接的兩條重(H)鏈和兩條輕 (L)鏈。在一些情況下，天然抗體由少于四條鏈組成，如在在駱駝(came I i d)中發(fā)現(xiàn)的僅重鏈 抗體(VhH片段)和在軟骨魚綱中發(fā)現(xiàn)的IgNAR的情況下。一類具有特別的藥用益處的免疫球 蛋白是IgG類。在人中，基于它們的重鏈恒定區(qū)的序列，可將IgG類分成四個亞類：IgGU IgG2、IgG3和IgG4?；谒鼈兊男蛄薪M成差異，可將輕鏈分成兩種類型：κ和λ鏈。IgG分子由 通過兩個或更多個二硫鍵互連的兩條重鏈和各自通過二硫鍵與重鏈連接的兩條輕鏈組成。 IgG重鏈可包含重鏈可變區(qū)(VH)和至多三個重鏈恒定(CH)區(qū)：CHl、CH2和CH3。輕鏈可包含輕 鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū)（CL) JH和VL區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為稱為互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)或高度 可變區(qū)(HvR)的高變區(qū)，其交替有更保守的稱為框架區(qū)(FR)的區(qū)。VH和VL區(qū)通常由三個CDR 和四個FR構(gòu)成，從氨基端至羧基端按以下順序排列:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。具 有重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)的可變結(jié)構(gòu)域形成能夠與抗原相互作用的結(jié)構(gòu)域，同時抗體的 恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子結(jié)合，所述宿主組織或因子包括但不限于免疫 系統(tǒng)的各種細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞）、Fc受體和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的Cl復(fù)合物的第一成分(Clq)。
[0044] 本發(fā)明的抗體可以是分離的。術(shù)語"分離的抗體"是指已從其所產(chǎn)生的環(huán)境中的其 它（另一)成分中分離和/或回收和/或已從其所產(chǎn)生的環(huán)境中存在的成分的混合物中純化 的抗體。
[0045] 在本發(fā)明的抗體代表自單個B-細(xì)胞或通過B細(xì)胞的克隆群表達(dá)的一組獨特的重鏈 和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的意義上，它們可以是單克隆抗體。本發(fā)明的抗體可使用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的各種方法產(chǎn)生和純化。例如，抗體可自雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生?？贵w可通過B-細(xì)胞擴(kuò) 增產(chǎn)生?？贵w或其片段可在哺乳動物或微生物表達(dá)系統(tǒng)中重組表達(dá)，或通過體外翻譯產(chǎn)生。 抗體或其片段還可通過例如噬菌體展示、細(xì)菌展示、酵母展示、哺乳動物細(xì)胞展示、核糖體 或mRNA展示的方式，作為細(xì)胞表面結(jié)合分子重組表達(dá)。一旦產(chǎn)生，抗體可針對其結(jié)合TFPI (包括亞結(jié)構(gòu)域例如TFPI (1-79) (SEQ ID NO: 2))的能力進(jìn)行篩選。
[0046] 抗體的各種抗原-結(jié)合片段也可以是本發(fā)明的抗體，因為已表明抗體的抗原結(jié)合 功能可通過全長抗體的片段實現(xiàn)。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合片段"是指保留特異性結(jié)合或識別 抗原(例如本文所述的人TFPI (1-79)或另一靶分子）的能力的抗體的一個或多個片段?？?原結(jié)合片段的實例包括Fab、Fab '、Fab2、Fab ' 2、FabS、Fv (典型地，抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu) 域）、單鏈 Fv (scFv;參見例如Bird 等，Science 1988; 242:423-426;和 Huston 等 PNAS 1988; 85:5879-5883)、dsFv、Fd (典型地，VH和CHI結(jié)構(gòu)域）和dAb (典型地，VH結(jié)構(gòu)域）片 段;VH、VL、VhH和V-NAR結(jié)構(gòu)域;包含單一 VH和單一 VL鏈的單價分子;微型抗體、雙抗體、三鏈 抗體、四鏈抗體和〖抗體(參見例如111等Protein Eng 1997; 10:949-57);駱駝IgG; IgNAR; 以及一個或多個分離的CDR或功能互補(bǔ)位，其中分離的CDR或抗原-結(jié)合殘基或多肽可締合 或連接在一起，以形成功能抗體片段。各種類型的抗體片段已描述或綜述于例如，Hol Iiger 和Hudson, Nat Biotechnol 2005; 23: 1126-1136;W02005040219和美國專利申請 20050238646和20020161201。這些抗體片段可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得， 和這些片段可以與完整抗體相同的方式針對效用進(jìn)行篩選。
[0047] 抗體的"Fab片段"，包括"Fab"、"Fab '"和"Fab ' 2"片段，通過在鉸鏈區(qū)中在連接抗 體的重鏈的鉸鏈半胱氨酸殘基的N-末端或C-末端側(cè)上裂解重鏈而源自所述抗體。"Fab"片 段包括輕鏈的可變和恒定結(jié)構(gòu)域以及重鏈的可變結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(CHI)。"Fab V' 片段包含一對"Fab'"片段，其通常通過它們的鉸鏈半胱氨酸共價連接。Fab '在形式上通過 裂解連接Fab ' 2中的重鏈的鉸鏈二硫鍵而源自Fab ' 2片段?？贵w片段的二硫鍵以外的其它化 學(xué)偶聯(lián)也是本領(lǐng)域已知的。Fab片段保留母體抗體結(jié)合其抗原的能力，可能具有較低的親和 力。Fab'2片段能夠二價結(jié)合，而Fab和Fab'片段可單價結(jié)合。通常，F(xiàn)ab片段缺少恒定CH2和 CH3結(jié)構(gòu)域，即其中會發(fā)生與Fc受體相互作用的Fc部分。因此，F(xiàn)ab片段通常沒有效應(yīng)器功 能。Fab片段可通過本領(lǐng)域已知的方法，通過酶裂解抗體產(chǎn)生，例如使用木瓜蛋白酶以獲得 Fab或使用胃蛋白酶以獲得Fab ' 2。Fab片段，包括Fab、Fab '、Fab ' 2，也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的技術(shù)重組產(chǎn)生。
[0048] "Fv"片段是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的抗體片段，和通常包含締合的一個重 鏈可變結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的二聚體，所述締合在性質(zhì)上可為共價的；例如在單 鏈可變結(jié)構(gòu)域片段(scFv)中。在該構(gòu)型中，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個高度可變區(qū)相互作用以 在VH-VL二聚體表面上規(guī)定抗原結(jié)合位點。總的來說，六個高度可變區(qū)或其子集賦予抗體抗 原結(jié)合特異性。然而，甚至包含僅三個對抗原特異性的高度可變區(qū)的單一可變結(jié)構(gòu)域可保 留識別和結(jié)合抗原的能力，盡管通常親和力低于完整的結(jié)合位點（Cai & Garen，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285，1996)。例如，僅具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VHH)的天 然存在的駱駝抗體可結(jié)合抗原(Desmyter等，J. Biol. Chem.，277: 23645-23650,2002; Bond等，J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655)。
[0049] "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單 一多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽還包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，其使scFv能夠形成抗原 結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。對于scFv的綜述，參見Pliickthun, 1994的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg和Moore編輯· Springer-Verlag, New York,第269-315頁。
[0050] 術(shù)語"雙抗體"是指具有兩個抗原結(jié)合位點的小的抗體片段，其中所述片段包含在 相同多肽鏈(VH和VL)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用因太 短而不允許在相同鏈上的兩個可變結(jié)構(gòu)域之間配對的接頭，可變結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的 互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對，產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更全面地描述于例如，EP 404,097; WO 93/11161;和Hollinger等，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448。
[0051] 表述"線性抗體"是指描述于Zapata等，1995，Protein Eng.，8(10): 1057-1062 中的抗體。簡言之，這些抗體包含一對串聯(lián)的Fd區(qū)段(VH-CH1-VH-CH1)，其連同互補(bǔ)輕鏈多 肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)。
[0052] 本文使用的術(shù)語"單抗體(monobody)"是指具有重鏈可變結(jié)構(gòu)域和沒有輕鏈可變 結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合分子。單抗體可在不存在輕鏈時結(jié)合抗原和通常具有三個高度可變區(qū)， 例如稱為⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3的⑶R。重鏈IgG單抗體具有通過二硫鍵連接的兩個重鏈抗原 結(jié)合分子。重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含一個或多個高度可變區(qū)，優(yōu)選地CDRH3或HVL-H3區(qū)。
[0053]在本文中，術(shù)語"抗原"可指用于免疫具有免疫能力的脊椎動物以產(chǎn)生識別其的抗 體或其片段的實體。在本發(fā)明的情況下，適合于免疫的抗原包括全長人TFPIa、人TFPI (1-79)和人TFPI (1-161)。術(shù)語抗原另外意圖包括被抗體特異性識別的靶分子，因此包括用于 免疫過程或用于分離/產(chǎn)生和表征抗體的其它方法(例如噬菌體展示、ELISA或SPR)的分子 的片段或模擬物。
[0054] 本發(fā)明的抗體可以能夠與另一分子(例如天然存在的配體或受體或另一抗體)競 爭結(jié)合TFPI，由此影響與這些相互作用有關(guān)的功能?？贵w與天然配體/受體競爭的能力可通 過測量對TFPI抑制的表觀心的影響的各種活性測定法評價。然后，Kd值可自表觀K 1值推導(dǎo) 出。
[0055] 因此，抗體片段可使用常規(guī)重組或蛋白工程改造技術(shù)獲得，和所述片段可針對與 TFPI或其亞結(jié)構(gòu)域例如人TFPI (1-79)結(jié)合以與完整抗體相同的方式進(jìn)行篩選。
[0056]本發(fā)明的抗體片段可通過截短制備，例如通過自多肽的N和/或C-末端除去一個或 多個氨基酸制備。片段也可通過一個或多個內(nèi)部缺失產(chǎn)生。
[0057] 本發(fā)明的抗體可以是人或人源化的抗體。本文使用的術(shù)語"人抗體"意圖包括具有 可變區(qū)的抗體，其中至少一部分的框架區(qū)和/或至少一部分的CDR區(qū)源自人種系免疫球蛋白 序列。（例如，人抗體可具有可變區(qū)，其中框架區(qū)和CDR區(qū)兩者都源自人種系免疫球蛋白序 列。）此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則恒定區(qū)也源自人種系免疫球蛋白序列。本發(fā)明的人抗體 可包括并非通過人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基