專利名稱：外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的 方法。
背景技術(shù)：
二十二碳六烯酸(DHA)是一種重要的omega-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃 金”，具有促進(jìn)腦細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、降血脂、降血糖、保護(hù)視力、抗癌及提高免疫能力等多種重 要的生理功能，被譽(yù)為新一代功能保健因子，受到世人極大的關(guān)注。傳統(tǒng)深海魚油提取的 DHA受魚的品種、季節(jié)及地理位置的影響而不穩(wěn)定，且膽固醇和其它不飽和脂肪酸含量高， 導(dǎo)致DHA產(chǎn)量有限、分離純化困難，成本較高等問(wèn)題。隨著魚油原料來(lái)源日漸緊缺，難以實(shí) 現(xiàn)DHA這種高附加值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥等行業(yè)中的廣泛應(yīng)用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)DHA可克 服傳統(tǒng)魚油提取的不足，可用于大量生產(chǎn)DHA，不斷滿足人們的需求，具有廣闊的應(yīng)用前景， 備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。能夠合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壺 菌(Thraustochytrium)、裂殖壺菌(Schizochytrium)、隱甲藻(Crythecodinium cohnii)寸。合成脂肪酸的關(guān)鍵前體物質(zhì)是乙酰_CoA。其含量的多少直接影響到多不飽和脂肪 酸(如DHA、DPA)含量。由于另一條競(jìng)爭(zhēng)途徑一甲羥戊酸途徑和脂肪酸合成途徑共用相 同的前體物質(zhì)乙酰-CoA。因此通過(guò)添加前提物質(zhì)和抑制甲羥戊酸途徑，使更多的前體物質(zhì) 乙酰-CoA流向脂肪酸途徑，從而有利于多不飽和脂肪酸的生物合成。目前，關(guān)于對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)DHA的研究，概括來(lái)說(shuō)，國(guó)內(nèi)已公開的相關(guān)專利主要集 中在以下3個(gè)方面1、關(guān)于DHA生產(chǎn)菌株的誘變篩選方法，如中國(guó)海洋大學(xué)的《海洋真菌裂殖壺菌 0UC88的工業(yè)應(yīng)用》(200410075426. X)、南京工業(yè)大學(xué)的《一種二十二碳六烯酸生產(chǎn)菌株及 其誘變篩選方法和其應(yīng)用》(200910033493. 8)等；2、關(guān)于培養(yǎng)基的組成，如南京工業(yè)大學(xué)的《一種裂殖弧菌及利用其生產(chǎn)DHA油脂 的方法》(200910033869. 5)等；3、關(guān)于油脂的提取精制，如南京工業(yè)大學(xué)的《一種從隱甲藻中提取并精制富含DHA 脂肪酸的工藝》(200710025079. 3)、內(nèi)蒙古金達(dá)威藥業(yè)有限公司等的《從雙鞭甲藻發(fā)酵液中 提取DHA不飽和脂肪酸的方法》(200910159368. 1)等；但是上述幾種方法，雖然在某種程度上提高了 DHA的合成能力，但是卻沒有從源 頭上提高微生物合成DHA的潛力，尤其是通過(guò)改善其代謝過(guò)程以促進(jìn)微生物合成DHA，目前 研究中還未有通過(guò)簡(jiǎn)單的添加外源物質(zhì)了促進(jìn)微生物合成DHA的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳 六烯酸的方法，該方法針對(duì)微生物生物合成脂肪酸過(guò)程與其競(jìng)爭(zhēng)途徑共用相同的前體物
3質(zhì)，保證更多的前體物質(zhì)流向脂肪酸合成，以提高對(duì)前體的利用率以及DHA的發(fā)酵水平，降 低生產(chǎn)成本。 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的思路是在生物體內(nèi)(如裂殖壺菌、破囊壺菌和隱 甲藻等)，長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸如DHA的合成是一個(gè)碳鏈延長(zhǎng)和耗能的過(guò)程，需要關(guān)鍵前體 物質(zhì)乙酰-CoA，且乙酰-CoA是脂肪酸合成的起始物質(zhì)。乙酰CoA的持續(xù)供應(yīng)是保證微生物 合成多不飽和脂肪酸必要前體。在進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加因子如合 成脂肪酸的前體物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)途徑關(guān)鍵酶的抑制劑；或者，在進(jìn)行發(fā)酵后期為保證足夠的前 體物質(zhì)流向脂肪酸合成，向培養(yǎng)基中添加合成脂肪酸的前提物質(zhì)。
具體采用的技術(shù)方案如下外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，將微生物接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中進(jìn)行發(fā)酵合成二十二碳六烯酸，在進(jìn)行發(fā)酵合成前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加因子， 和/或在發(fā)酵合成中加入合成脂肪酸的前體物質(zhì)；其中，所述的微生物為破囊壺菌、裂殖壺 菌和隱甲藻中的任意一種；所述的外源添加因子為乙酸、檸檬酸、和辛伐他汀中的任意一種 或幾種的組合；所述的合成脂肪酸的前體物質(zhì)是乙酸。其中，發(fā)酵前期外源添加因子乙酸的添加量為3 6mM。其中，外源添加因子檸檬酸的添加量為2 8mM。其中，外源添加因子辛伐他汀的添加量為0. 5 4μΜ。其中，合成脂肪酸的前體物質(zhì)乙酸的添加量為3 9mM。其中，優(yōu)選的是，外源添加因子采用乙酸和檸檬酸組合的形式，乙酸的添加量為 6mM，檸檬酸的添加量?jī)?yōu)選為2 4mM。其中，優(yōu)選的是，外源添加因子采用乙酸和辛伐他汀組合的形式，乙酸的添加量為 6mM,辛伐他汀的添加量為1 μ Μ。其中，優(yōu)選的是，在發(fā)酵前期向培養(yǎng)基加入乙酸，添加量為6mM，并且在發(fā)酵后期， 即發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低至20 25g/L時(shí)，加入乙酸，添加量為6mM。有益效果本發(fā)明通過(guò)添加脂肪酸合成前體物質(zhì)和競(jìng)爭(zhēng)途徑關(guān)鍵酶的抑制劑改善 DHA生產(chǎn)菌株的代謝過(guò)程。實(shí)現(xiàn)代謝向DHA生物合成支路的定向調(diào)控，從而提高DHA的生物 合成水平，提高DHA占總脂肪酸的百分含量。這種方法的益處在于提高底物的轉(zhuǎn)化率，顯著 提高DHA濃度和強(qiáng)度；且本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，不需要額外的人工和設(shè)備，僅通過(guò)較低的附加投 入，就可以提高底物的轉(zhuǎn)化率和目標(biāo)產(chǎn)物DHA的濃度，從而降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例中所用的菌種為裂殖壺菌(Schizochytriumsp. )HX-308, CCTCC No :Μ 209059 ；破囊壺菌(thraustochytrium sp. )ATCC No 26185 ；隱甲藻(C. cohnni) =ATCC 30556。裂殖壺菌和破囊壺菌種子培養(yǎng)基D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸鈉10g/L、MgCl2 3g/L、CaCl2·2Η20 lg/L,KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgS04·7Η20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。(參考《一種裂殖壺菌及利用其生產(chǎn)DHA油脂的方法》，申請(qǐng)?zhí)?00910033869. 5)。裂殖壺菌和破囊壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基D_葡萄糖40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸鈉10g/L、 MgCl2 3g/L、(MM)2SO4 6g/L、KH2PO4 4g/L、KCl 2g/L、NaCl 15g/L、MgSO4 · 7H20 5g/L、FeCl3 0. lg/L。(參考《一種裂殖壺菌及利用其生產(chǎn)DHA油脂的方法》，申請(qǐng)?zhí)?00910033869. 5)。隱甲藻種子和發(fā)酵培養(yǎng)基D-葡萄糖25g/L、酵母膏4g/L，NaCl 16g/L， MgSO4 · 7H2010g/L, KH2PO4 llg/L, KN035g/L, (NH4)2SO4 12g/L, VH 6mg/L, VB121 μ g/L。(參 見《利用Crypthecodinium cohnii高密度發(fā)酵生產(chǎn)DHA的流加策略研究》，食品與發(fā)酵工 業(yè)，2007 Vol. 33 No. 1. PP :25-27).以下實(shí)施例所用的發(fā)酵培養(yǎng)方法如下種子培養(yǎng)三代，前兩代種子在250mL三角瓶中進(jìn)行，裝液量為50mL，第三代種子在 500mL進(jìn)行，裝液量為IOOmL,每代都按5% (ν/ν)的接種量，將第三代種子按9 % (ν/ν)的 接種量接入裝液量為IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中(500mL)；在25°C、150r條件下培養(yǎng)。實(shí)施例1 在發(fā)酵前，分別向裂殖壺菌和破囊壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的乙酸。利用 生物傳感儀測(cè)定培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度，當(dāng)培養(yǎng)基中殘留葡萄糖濃度為0g/L停止發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1和2所示表1外源乙酸對(duì)裂殖壺菌發(fā)酵的影響
權(quán)利要求
外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，將微生物接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵合成二十二碳六烯酸，其特征在于在進(jìn)行發(fā)酵合成前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加因子，和/或在發(fā)酵合成中加入合成脂肪酸的前體物質(zhì)；其中，所述的微生物為破囊壺菌、裂殖壺菌和隱甲藻中的任意一種；所述的外源添加因子為乙酸、檸檬酸、和辛伐他汀中的任意一種或幾種的組合；所述的合成脂肪酸的前體物質(zhì)是乙酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其特 征在于外源添加因子乙酸的添加量為3 6mM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其特 征在于外源添加因子檸檬酸的添加量為2 8mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其特 征在于外源添加因子辛伐他汀的添加量為0. 5 4 μ M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其 特征在于在發(fā)酵合成后期加入合成脂肪酸的前體物質(zhì)，即發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降低至 20 25g/L時(shí)加入合成脂肪酸的前體物質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，其特 征在于合成脂肪酸的前體物質(zhì)乙酸的添加量為3 9mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種外源添加因子促進(jìn)微生物合成二十二碳六烯酸的方法，將微生物接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵合成二十二碳六烯酸，在進(jìn)行發(fā)酵合成前向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入外源添加因子，和/或在發(fā)酵合成中加入合成脂肪酸的前體物質(zhì)；所述的微生物為破囊壺菌、裂殖壺菌和隱甲藻中的任意一種；所述的外源添加因子為乙酸、檸檬酸、和辛伐他汀中的任意一種或幾種的組合；所述的合成脂肪酸的前體物質(zhì)是乙酸。本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單有效的發(fā)酵調(diào)控，提高底物轉(zhuǎn)化率，操作簡(jiǎn)單，不增加額外的人工和設(shè)備，僅通過(guò)較低的附加投入，就可以提高目標(biāo)產(chǎn)物合成濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度，從而降低生產(chǎn)成本。且該方法不危害環(huán)境，不增加人力物力，并降低了成本，簡(jiǎn)單方便且具有經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101979623SQ20101050463
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者仝倩倩, 任路靜, 紀(jì)曉俊, 肖愛華, 魏萍, 黃和 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)