高效檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒及使用方法，該試劑盒包括以下組份：一抗羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷、聚乙二醇（PEG）4000、pH=7.4的磷酸緩沖液（PBS緩沖液）、3H閃爍液、pH=7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris緩沖液）、含有或者不含有烏本苷。本發(fā)明試劑盒具有操作簡單方便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，并且能夠穩(wěn)定可靠的早期診斷孕期子癇，為之后的治療提供有利依托。
【專利說明】高效檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于屬于醫(yī)療器械【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種高效檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]孕期先兆子癇(孕期早癇)是一種病發(fā)原因復(fù)雜的綜合征，如果不及時治療，可發(fā)展為子癇，危及生命。主要癥狀有高血壓、蛋白尿，水腫，驚厥，腎功能損傷等，已成為世界上孕婦致死率最高的一種疾病，目前具體病因不明。有研究證明，胎盤產(chǎn)生的一種導(dǎo)致易感婦女母體血管內(nèi)皮功能障礙的物質(zhì)可能是早癇病發(fā)的其中一個原因。血壓升高是該疾病最明顯的標志，同時造成對產(chǎn)婦內(nèi)皮，腎臟和肝臟的損害。
[0003]先兆子癇(早癇)在全球孕婦中發(fā)病率為6_8%，通常發(fā)病于妊娠二期晚期或妊娠三期，大部分在孕期32周之后發(fā)病(32周前發(fā)病被認為是早期發(fā)病)，極少數(shù)孕婦會在孕期20周發(fā)病。初次懷孕的孕婦發(fā)病率最高，并且隨著妊娠次數(shù)的增加，該疾病發(fā)病率大幅度降低。早癇多發(fā)于具有高血壓史，糖尿病史，肥胖癥史，自身免疫性疾病史如狼瘡，和多胎妊娠(雙胞胎或多胞胎)的孕婦中，其發(fā)病過程因人而異，大多數(shù)病例可以在分娩前被確診。少數(shù)病例在分娩后六周才被確診，稱為“產(chǎn)后早癇”，確診后除了剖腹產(chǎn)或引產(chǎn)手術(shù)，沒有其他治療方式。早癇是最常見的的妊娠綜合癥，同時影響母親和胎兒，導(dǎo)致早產(chǎn)兒甚至對母嬰造成生命危險。
[0004]傳統(tǒng)上早癇的確診標志是孕期高血壓(兩個獨立的至少相隔六小時的測量值，收縮壓為140以上和/或舒張壓為90以上)和24小時尿液樣本中的蛋白含量高于300毫克(蛋白尿)。比基線血壓(BP)高30毫米汞柱的收縮壓或高15毫米汞柱的舒張壓，不能達到140/90的絕對標準，仍然被認為是重要發(fā)病信號，但并不能就此確診。腫脹或水腫(尤其是在手和臉)最初曾被認為是診斷早癇的一個重要標志，但目前的醫(yī)學(xué)實踐證明，只有高血壓和蛋白尿可以作為診斷標準。
[0005]雖然早癇是一種致命性疾病，但其早期發(fā)病通常無癥狀，且一般情況下，早癇的信號都不是特異性的，比如孕期驚厥，在懷孕過程中，其他原因比子癇更容易導(dǎo)致驚厥，因此早癇的早期診斷一直是醫(yī)學(xué)界無法攻克的一個難題。
[0006]在早癇病人的癥狀中，一種鈉鉀泵抑制因子-內(nèi)源性洋地黃樣因子(endogenousdigitalis-likefactor, EDLF)水平的升高,是早癇的重要標志。這種因子能夠?qū)е卵獕荷?，存在于人體和動物組織及體液中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與植物洋地黃中提取的類固醇強心劑相似，故名“洋地黃樣因子”，此因子能夠以與地高辛等強心劑類似的機制結(jié)合到鈉鉀泵上，并抑制其活性，但目前為止，此類因子的具體化學(xué)結(jié)構(gòu)仍然未知。許多高血壓病癥均發(fā)現(xiàn)伴隨內(nèi)源性洋地黃樣因子水平的升高，因此，該因子很可能是造成高血壓的原因。
[0007]研究表明，地高辛抗體可以逆轉(zhuǎn)植物來源的鈉鉀泵抑制因子以及內(nèi)源性洋地黃樣因子的作用，特別是一種曾經(jīng)用于地高辛攝入過量治療的，名為Digibind的特異性地高辛抗體片段，此抗體能夠與內(nèi)源性洋地黃樣因子結(jié)合并抑制其作用，降低血壓。在早癇婦女的臨床隨機雙盲實驗中，接受地高辛抗體治療的婦女血壓比安慰劑對照組明顯降低，腎功能損傷也有大幅改善，這些證據(jù)進一步證明了內(nèi)源性洋地黃樣因子在早癇成因中的作用，地高辛抗體通過與該因子結(jié)合，起到緩解病癥的效果。
[0008]為了實現(xiàn)對妊娠早癇的早期診斷，達到早期治療的目的，需要以地高辛抗體作為工具，開發(fā)一種可以特異性精確測量樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的方法，并制成操作簡便快捷的試劑盒。在此因子被發(fā)現(xiàn)后的幾十年中，研究的最大困難在于，其在體內(nèi)的含量非常低，并且由于結(jié)構(gòu)還未被確定，目前還沒有方法可以把它(們)從體內(nèi)分離出來。因此，本發(fā)明中的試劑盒提供了一種在臨床上不需將其分離，但仍可以靈敏測定該因子濃度，并作為早癇早期診斷的依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單方便、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定可靠的高效檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒及使用方法，本試劑盒的檢測可以達到nM即納摩爾/升，為后續(xù)治療提供有利依托。
[0010]本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下:
[0011]一種檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒，包括如下組份
[0012]一抗羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷、聚乙二醇4000、pH=7.4的磷酸緩沖液、3H閃爍液、pH=7.4的Tris緩沖液。
[0013]而且,還包括烏本苷。
[0014]而且，所述一抗羊抗人地高辛多克隆抗體濃度12微克/毫升，所述二抗鼠抗羊IgG濃度5X 10_7摩爾/升，所述3H標記烏本苷濃度為10.0Ci/mmol，所述聚乙二醇4000濃度為 30wt%。
[0015]而且，所述試劑盒用于檢測人體血清、胎盤組織分泌液、以及冷凍胎盤組織中的內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量。
[0016]一種如權(quán)利要求1所述的檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒使用方法，步驟如下
[0017]⑴采集胎盤，切成組織塊，液氮冷凍，保存于_80°C ；
[0018]⑵將冷凍胎盤組織塊切成薄片，置于勻漿器中，放入液氮罐中冷凍I分鐘；以1500rpm的速度將組織薄片勻漿5分鐘；
[0019]⑶收集勻漿組織，加入等量的甲醇，混勻，以2000rpm的速度離心5分鐘，去除蛋
白；收集離心上清液，真空濃縮，4°C保存；
[0020]⑷取出試劑盒中羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷、pH=7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，分別等量加入，與等量待測樣品充分混合，室溫孵育；
[0021](5)再加入等量的PEG4000溶液，8000rpm離心10分鐘，得到沉淀物；
[0022](6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入3H閃爍液；
[0023](7)測量樣品放射量，根據(jù)標準曲線計算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。
[0024]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是:
[0025]1、本發(fā)明提供了一種檢測快速、操作簡單方便、特異性強、穩(wěn)定性好及靈敏性高的試劑盒，能有效檢測出樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量，解決了長期以來對早癇的早期診斷研究的重大困難。
[0026]2、本試劑盒可以用于測量胎盤和血清樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，為進一步對該因子的致病機制、體內(nèi)合成調(diào)節(jié)的研究打下良好基礎(chǔ)，并使孕期早癇的病理研究工作向前邁進了一大步。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明地高辛抗體逆轉(zhuǎn)內(nèi)源性洋地黃樣因子在早癇中對鈉鉀泵的抑制作用，縱坐標代表血紅細胞中鈉鉀泵被抑制的百分比，單位％ ;圖中A代表對照，B代表沒有使用地高辛抗體的早癇患者樣本，C代表使用地高辛抗體后的早癇患者樣本。
[0028]圖2為本發(fā)明標準曲線(按照標準曲線繪制方法得到)，橫坐標代表烏本苷溶液濃度的log (摩爾/升)值；縱坐標是放射性，縱坐標代表標準烏本苷溶液經(jīng)本發(fā)明所述方法測得的放射性含量，y=0.0671e—14.，R2=0.9979。
[0029]圖3為本發(fā)明試劑盒測出的十一份獨立胎盤樣本中分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，樣本來自正常孕婦，其中，橫坐標ι-ll分別代表i 份獨立樣本；縱坐標代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位納摩/升。
[0030]圖4為本發(fā)明試劑盒用于確定胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，樣品來自早癇孕婦，其中，橫坐標1-5分別代表5份獨立樣本；縱坐標代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，
單位納摩/升。
[0031]圖5為本發(fā)明試劑盒用于測量早癇孕婦血清中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，其中，橫坐標1-7分別代表7份獨立樣本；縱坐標代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位納摩/升。
[0032]圖6為本發(fā)明發(fā)明試劑盒測量人胎盤中內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度隨時間的累積，其中，橫坐標代表培養(yǎng)時間，單位小時；縱坐標代表內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位10_8摩/升。
[0033]圖7 為 GFAA 法(Graphite Furnance Atomic Absorption Spectrometry,石墨爐原子吸收光譜法)和本發(fā)明所述試劑盒所用方法檢測相同胎盤樣品中內(nèi)源性洋地黃樣因子的比較。橫坐標代表GFAA法測得樣品中該因子的活性百分比，單位％ ;縱坐標代表使用本發(fā)明所述試劑盒測得的樣品中因子含量，單位:納摩/升
【具體實施方式】
[0034]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0035]本發(fā)明所述的羊抗人地高辛多克隆抗體(一抗地高辛抗體)購自GlaxoSmithKline(又名抗地高辛抗體)、二抗鼠抗羊IgG均購自Jackson ImmunoResearchLaboratories, Inc、3H標記烏本苷購自PerkinElmer、聚乙二醇4000購自Calbiochem、pH=7.4的憐酸緩沖液(PBS緩沖液)自配、3H閃爍液購自NationalDiagnostics、烏本苷購自Sigma、pH=7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液)購自Sigma，DMEM培養(yǎng)液購自Gibson。
[0036]本試劑盒的組成如下:[0037]羊抗人地高辛多克隆抗體12微克/毫升、二抗鼠抗羊IgG5X 10_7摩爾/升、3H標記烏本苷濃度為10.0Ci/mmol、聚乙二醇4000濃度為30wt%、pH=7.4的磷酸緩沖液(PBS緩沖液)、3H閃爍液、烏本苷、pH=7.4的Tris緩沖液。
[0038]本發(fā)明所述的試劑盒需要可以測量3H放射性的儀器設(shè)備進行測量。(設(shè)備名為scintiIIationcounterο任何做放射性實驗的實驗室都有,操作過程為把樣品放進去,運行操作軟件，直接出結(jié)果。)
[0039]實施例1:
[0040]試劑盒用于測量胎盤組織分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量
[0041]⑴采集分娩時間少于6小時的新鮮人胎盤；
[0042]⑵撥開羊膜，取5mmX5mmX5mm大小的組織塊4_5塊，放入PBS中洗掉殘留血液；
[0043]⑶將組織塊剪成微粒，去除肉眼可見血塊和血管，用PBS洗至無血液殘留，在無菌濾紙上吸干PBS，放入DMEM培養(yǎng)液中，37°C、5%C02培養(yǎng)48小時；
[0044]⑷收集培養(yǎng)液，離心去除殘留組織塊，4°C保存；
[0045](5)取出試劑盒中羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷，分別取100微升，與100微升待測樣品充分混合，室溫孵育；
[0046](6)再加入400微升PEG4000溶液，8000rpm離心10分鐘，得到沉淀物；
[0047](7)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入4毫升3H閃爍液；
[0048](8)測量樣品放射量，根據(jù)標準曲線計算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度。
[0049]結(jié)果如圖3所示，利用此試劑盒測量出獨立胎盤組織中分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，單位為納摩/升，此濃度可以被本發(fā)明提供的試劑盒精確測量。
[0050]實施例2:
[0051]該試劑盒用于測量人體冷凍胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量
[0052]⑴采集新生兒胎盤，切成2cmX 2cmX 2cm大小的組織塊，液氮冷凍，保存于_80°C ；
[0053]⑵將冷凍胎盤組織塊切成薄片，置于勻漿器中，放入液氮罐中冷凍I分鐘；以1500rpm的速度將組織薄片勻漿5分鐘；
[0054]⑶收集勻漿組織，加入5毫升甲醇，混勻，以2000rpm的速度離心5分鐘，去除蛋白；收集離心上清液，真空濃縮，4°C保存；
[0055]測量樣品方法同實施例1中步驟(5) - (8)。
[0056]如圖4所示，此試劑盒可測量冷凍胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度，平均為實施例1中的100倍，樣品來源均被確診為早癇病發(fā)者。
[0057]實施例3:
[0058]該試劑盒用于測量人體血清中內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量
[0059]測量樣品方法同實施例1中步驟(5) - (8)。
[0060]結(jié)果如圖5所示，該試劑盒可以精確測量出人體血清中低含量的內(nèi)源性洋地黃樣因子。
[0061]孕婦血清中內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度超過150納摩/升，即可初步判斷為早癇患者。
[0062]此處指孕婦血清中內(nèi)源性洋地黃樣因子含量，因為醫(yī)院在孕婦分娩前，化驗血清是最方便的。但由于此因子在胎盤中產(chǎn)生，胎盤含量要遠遠高于血清含量，如圖4與圖5對比；又如圖3，顯示正常孕婦胎盤分泌到培養(yǎng)液中的因子濃度，與圖5中早癇患者的血清中因子濃度具可比性，進一步證實了血清中含量遠遠少于胎盤，血清中該因子的低含量，以及化驗血清比胎盤便捷，是本發(fā)明的重要創(chuàng)新。
[0063]實施例4:
[0064]該試劑盒用于測量人胎盤組織中分泌內(nèi)源性洋地黃樣因子的累積，方法同實施例1o
[0065]如圖6所示，隨著組織培養(yǎng)時間的累積，該試劑盒測出人胎盤分泌的內(nèi)源性洋地黃樣因子含量逐步增加。
[0066]標準曲線繪制步驟如下:
[0067]⑴取濃度分別為50納摩/升，0.1微摩/升，0.2微摩/升，0.5微摩/升，I微摩/升，3微摩/升的烏本苷溶液各100微升；
[0068]⑵取出試劑盒中羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、pH=7.4的Tris緩沖液，分別加100微升到上述不同濃度的烏本苷溶液中，充分混合，室溫孵育；
[0069]⑶再加入400微升PEG4000溶液，8000rpm離心10分鐘，得到沉淀物；
[0070]⑷沉淀物用500微升ρΗ7.4的PBS重懸，加入3Η閃爍液；
[0071](5)測量樣品放射量，得到樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子濃度，繪制曲線，得到標準曲線。
[0072]由于烏本苷能夠以與內(nèi)源性洋地黃樣因子相同的結(jié)合率結(jié)合到抗地高辛抗體上，可利用已知的烏本苷標準溶液的濃度代表樣本中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度。
[0073]圖7的測量因子含量方法同實施例1，即取胎盤組織培養(yǎng)液測量放射量，結(jié)果顯示胎盤組織中內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度與其活性呈線性關(guān)系，進一步證實本發(fā)明中所述檢測方法的可靠性。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒，其特征在于:包括如下組份 一抗羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷、聚乙二醇4000、pH=7.4的磷酸緩沖液、3H閃爍液、pH=7.4的Tris緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒，其特征在于:還包括烏本苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒，其特征在于:所述一抗羊抗人地高辛多克隆抗體濃度12微克/毫升，所述二抗鼠抗羊IgG濃度5X 10_7摩爾/升，所述3H標記烏本苷濃度為10.0Ci/mmol，所述聚乙二醇4000濃度為30wt%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒用于檢測人體血清、胎盤組織分泌液、以及冷凍胎盤組織中的內(nèi)源性洋地黃樣因子的含量。
5.—種如權(quán)利要求1所述的檢測內(nèi)源性洋地黃樣因子含量的試劑盒使用方法,其特征在于:步驟如下 ⑴采集胎盤，切碎，液氮冷凍，保存于_80°C ； ⑵將冷凍胎盤組織塊切成薄片，置于勻漿器中，放入液氮罐中冷凍I分鐘；以1500rpm的速度將組織薄片勻漿5分鐘； ⑶收集勻漿組織，加入等量的甲醇，混勻，離心去除蛋白；收集離心上清液，真空濃縮，4°C保存； ⑷取出試劑盒中羊抗人地高辛多克隆抗體、二抗鼠抗羊IgG、3H標記烏本苷、pH=7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液，分別等量加入，與等量待測樣品充分混合，室溫孵育； (5)再加入等量的PEG4000溶液，離心，得到沉淀物； (6)沉淀物用500微升pH7.4的PBS重懸，加入3H閃爍液； (7)測量樣品放射量，根據(jù)標準曲線計算出樣品中所含內(nèi)源性洋地黃樣因子的濃度。
【文檔編號】G01N33/53GK103439485SQ201310371006
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】馬潔, 劉小兵, 張慕軍 申請人:天津市康婷生物工程有限公司