專利名稱：長效重組組織因子途徑抑制物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及長效重組組織因子途徑抑制物(LTFPI)。更具體地，本發(fā)明涉及確定LTFPI突變位點與突變、基因克隆、基因表達、蛋白純化與復性，以及功能測定。
背景技術：
組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)是絲氨酸蛋白酶抑制物，分子量約40kd，前體有304個氨基酸，成熟蛋白則有276個氨基酸，后者由氨基末端、三個串聯(lián)的Kunitz型結構域和羧基末端組成，主要功能有(1)結構域1抑制組織因子(Tissue Factor，TF)和凝血因子VII/VIIa，并通過抑制TF產(chǎn)生抗血小板聚集作用；(2)結構域2抑制凝血因子X/Xa；(Broze GJ.Annu RevMed，1995；46103-112)；(3)結構域3抑制內(nèi)毒素與CD14的結合，產(chǎn)生顯著的抗炎癥作用；同時結構域3還是肝素的結合位點，肝素通過結合于TFPI結構域3發(fā)揮抗凝作用；(4)羧基末端能與受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)結合，是影響TFPI半衰期的關鍵部位。動物和人體實驗證實TFPI能有效治療嚴重感染、濃毒血癥、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、多臟器功能衰竭(MOF)、高凝狀態(tài)、血栓栓塞性疾病和腫瘤等具有良好療效，是一種具有良好應用前景的蛋白質(zhì)。
大多數(shù)TFPI由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌，平滑肌細胞、心肌細胞和纖維母細胞在一定條件下也可產(chǎn)生TFPI。無論是人體自身的TFPI，還是給予的重組野生型TFPI，它的半衰期都很短，只有2分鐘左右，會很快從血液中清除。TFPI進入血液循環(huán)后，迅速與肝細胞膜上的LRP結合，然后被降解和代謝。半衰期短是TFPI在發(fā)揮治療作用時最大的缺點，必須連續(xù)72-96小時給藥才能保持療效，每個療程約需160-320mg，如此大的劑量給病人帶來了巨大的經(jīng)濟負擔。因此，延長TFPI的半衰期，減少其用藥量，是急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供半衰期長，具有良好抗凝功能的長效組織因子途徑抑制物(long half-life TFPI，LTFPI)及其制備方法。
本發(fā)明根據(jù)生物信息學和結構分子生物學的分析結果，應用基因工程和蛋白質(zhì)工程對TFPI羧基末端進行了突變，獲得半衰期明顯延長的重組組織因子途徑抑制物(TFPI)長效突變體，命名為長效組織因子途徑抑制物(LTFPI)，體內(nèi)和動物實驗表明LTFPI具有良好的抗凝功能。
TFPI的羧基末端能與LRP結合，然后被迅速降解和代謝。本發(fā)明首先在計算機工作站上模建了TFPI和LRP分子，然后將兩者進行對接，發(fā)現(xiàn)TFPI羧基末端的某些關鍵氨基酸在TFPI和LRP的相互作用發(fā)揮關鍵作用。本發(fā)明將TFPI羧基末端267-304區(qū)域內(nèi)的某些氨基酸進行不同程度的替代和缺失突變后，兩者的結合能力出現(xiàn)了不同程度的下降，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長10倍以上，并具備抗組織因子、凝血因子VII/VIIa和凝血因子X/Xa功能。其中將269、282、288和289位賴氨酸全部替換為丙氨酸的突變效果為佳。
本發(fā)明所述氨基酸突變后具有Sequence 1的氨基酸序列。
本發(fā)明還提供了制備LTFPI的方法，包括制備至少包含表達生物活性的LTFPI編碼序列部分的cDNA，在適合表達的載體中克隆cDNA片斷，用該載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，在適于表達該cDNA片斷的條件下培養(yǎng)該宿主細胞，以及從培養(yǎng)物中回收和純化所需LTFPI。
本發(fā)明中LTFPI基因的制備包括經(jīng)過點突變后的基因，與相關質(zhì)粒重組，DNA限制性內(nèi)切酶酶切鑒定篩選陽性克隆，核苷酸序列分析驗證基因是否正確。
將本發(fā)明的LTFPI cDNA片斷與表達載體重組，形成重組表達質(zhì)粒。本發(fā)明不限于特定的表達質(zhì)粒。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用原核表達載體，例如pET28等。
上述重組表達載體可按常規(guī)方法導入適宜宿主細胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細胞，只要它能夠表達所述重組表達載體。在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用大腸桿菌BL21等。
本發(fā)明的表達產(chǎn)物以包涵體形式存在于宿主細胞的胞體中，破菌分離包涵體，高濃度尿素或鹽酸胍溶解包涵體，分離純化LTFPI，經(jīng)適當復性后即獲得有活性的LTFPI。
以上技術方案中所有基本分子生物學操作均參照<分子克隆實驗指南>。
本發(fā)明應用基因工程方法對LTFPI進行生產(chǎn)，所得產(chǎn)品具有高效的抗凝、抗血小板和抗炎功能，并且制備工藝簡便、安全。與野生TFPI性質(zhì)比較表明，LTFPI半衰期明顯延長，其余功能類似。LTFPI為注射劑和非注射劑研究提供了原料，可用于預防和治療嚴重感染性疾病和血栓栓塞性疾病等。


圖1是TFPI與LRP對接后相互作用的氨基酸位點。
圖2是dPT法檢測TFPI1-276和TFPI1-161抗凝活性。
具體實施例方式
實施例1 TFPI和LRP在計算機工作站上的對接與分析應用Insight II軟件，在計算機工作站上對TFPI和LRP進行對接，尋找到了TFPI羧基末端269、282、288和289位賴氨酸是兩者相互作用的關鍵位點。
實施例2 LTFPI的設計、制備和性質(zhì)鑒定(1)LTFPI基因的克隆、改造及原核表達質(zhì)粒rLTFPI-pET28的構建LTFPI的設計方法為將TFPI羧基末端269、282、288和289位賴氨酸替換為丙氨酸。序列使用PCR點突變獲得基因，與pUC19重組，酶解篩選陽性克隆，核苷酸序列分析證實基因序列正確。然后將LTFPI基因切出，與原核表達載體pET28重組，構成原核表達質(zhì)粒rLTFPI-pET28。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，以相應限制性內(nèi)切酶酶解鑒定，獲得特征性片斷，證實獲得陽性克隆。
LTFPI基因獲取方法如下采用重疊延伸法，選用pET28多克隆位點NotI后400bp的一段序列設計下游引物5’＞CCA CTA CGT GAA CCA TCA CCC TAA TCA AGT ＜3’重疊延伸引物1其中斜體密碼從左到右依次為K254A，K241A。
5’＞CCC AAT TAG GCC TCC TTT TGA TAT TCT TTG GAT GAA ACC CGC TTT ACATGC CCT CAG ACA＜3’重疊延伸引物2斜體密碼從左到右依次為K254A，K260A，K261A。
5’＞AAA GGA GGC CTA ATT GCG ACC AAA AGA AAA AGA GCG GCG CAG AGA GTGAAA ATA GCA TAT ＜3’以質(zhì)粒pET28-TFPI為模板，上游引物與重疊延伸引物1配對，下游引物與重疊延伸引物2配對，分別PCR，回收產(chǎn)物后用作中間體，加上游引物和下游引物做PCR，NcoI+NotI雙酶切PCR產(chǎn)物，即得K241A，K254A，K260A，K261A突變的LTFPI。
限制性內(nèi)切酶購自BRL公司，大腸桿菌JM109、質(zhì)粒pUC19 Invitrogen公司。pLy4的構建按已知方法進行。
(2)篩選高拷貝高效表達菌株將質(zhì)粒rLTFPI-pLy4電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，使其與大腸桿菌染色體發(fā)生重組，G418篩選高效表達菌株。
宿主菌大腸桿菌BL21培養(yǎng)液LBKKan工作濃度30ug/mlIPTG工作濃度1mM①挑單克隆菌落接種至5ml LBK medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2。
②接種至500ml LBK medium，37℃×250rpm至OD600＝1～2。
③接種至25L LBK medium，37℃×600rpm，溶氧50％，至OD600＝0.6～0.8。
④加1M IPTG至終濃度1mM，誘導表達3h。
⑤4℃×4000rpm×35min，收集菌體。
⑥50mM Tris.HCl pH8.0洗滌菌體1次，收集菌體，稱重。
挑取上述陽性克隆接種于10ml低營養(yǎng)液BMG〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油〗中，30℃快速振遙(250RPM)，培養(yǎng)過夜。次日測定光密度OD600，離心棄除BMG培液，用無菌水洗滌后用BMM培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇〗稀釋至OD600＝1。每天補加體積百分數(shù)為0.5％的甲醇。甲醇誘導培養(yǎng)7天，每隔24小時取樣1ml，測定抗TF/FVIIa(rhTFPI-AP1)或抗Fxa(rhTFPI-AP2)活性。離心棄沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清與2x上樣緩沖液等體積混合后取20ul上樣，作還原性SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS掃描定純度、分子量?？梢娬T導后上清液在分子量約6kd處有一濃集的條帶，經(jīng)掃描，目的蛋白約占上清總蛋白的84％；結果表明表達產(chǎn)物rhTFPI-AP1有明顯的抗TF/FVIIa作用，rhTFPI-AP2有明顯的抗FXa作用。上述還原性SDS-PAGE按Laemmli方法進行。
(3)發(fā)酵表達工程菌按上述篩選高表達菌株作為工程菌，然后以5L發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵。從-70℃深低溫冰箱中取出種子菌，室溫下解凍，在種子菌培養(yǎng)室100級潔凈度條件下劃YPD平板，30℃溫箱培養(yǎng)2-3天。從平板上挑取單菌落，同樣在100級潔凈度條件下接種于10ml BMG培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)過夜，此為一級種子液。再將一級種子液加入140ml培養(yǎng)液中，30℃培養(yǎng)6-8小時，直至OD600＝6，此為二級種子液。種子菌接入后，自然增值，待基礎培養(yǎng)基中預加的甘油被耗盡以后，開始補充甘油，補充速度16ml/L/h，待OD600達到120左右，停止補加甘油。待培養(yǎng)液中甘油全部耗盡后，開始甲醇誘導。甲醇補料速度從1ml/L/h逐漸升高至12ml/L/h，以后一直維持此速度。本發(fā)明的發(fā)酵技術是用低鹽培養(yǎng)基擴增工程菌，誘導前用含微量元素的甘油溶液進行補料，到達一定菌體濃度后用含微量元素的甲醇溶液進行誘導表達。
甲醇誘導40h以后，停止發(fā)酵，從發(fā)酵罐中立即放出菌液進行離心，分離沉淀菌體，收集上清進行純化。上清中rhTFPI-AP1對TF/FVIIa的抑制常數(shù)達Ki＝0.12uM，rhTFPI-AP2對FXa的抑制常數(shù)達Ki＝0.09uM。發(fā)酵參數(shù)為溫度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，攪拌速度與DO連動。
(4)超濾濃縮脫鹽將離心所獲上清以1∶10稀釋，經(jīng)Millipore超濾裝置(NMWL3000，Millipore公司)超濾濃縮至1.0L，脫去無機鹽。
(5)凝膠過濾Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，將超濾濃縮液上樣，加樣時注意勿攪動Sephadex G-50膠面。然后用PB洗脫，流速10ml/min，收集活性峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱層析以10倍體積的50mmol/L PB(pH7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝膠過濾后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率將其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280達0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH7.4)線性梯度洗脫，收集有抗凝活性部分，分裝，冷凍干燥，-40℃保存。
本發(fā)明的色譜操作均為常規(guī)操作。
(7)純度鑒定及分子量測定樣品進行16.5％SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色后，PharmaciaInagemasterVDS掃描測定純度、分子量。所得產(chǎn)品純度97％以上，分子量約6kD。
(8)抗TF/FVIIa活性測定使用稀釋后的凝血酶原時間(dilutedprothrombin time，dPT)測定，方法如下。
將凝血活酶干粉試劑加2mL生理鹽水稀釋至終濃度5000U/L，此為凝血活酶原液，再用生理鹽水分別稀釋10、100和500倍，置37℃?zhèn)溆?。?00μL正常人混合血漿，加10μL蛋白溶液，分別加100μL不同濃度的凝血活酶溶液，37℃孵育1min，加100μL 30mmol/L CaCl2溶液，開始計時血漿凝固時間。反應體系中TFPI1-276和TFPI1-161終濃度均為0.2μmol/L，取3次實驗平均值記為實驗結果，所有試劑均需37℃預熱，全部操作2h內(nèi)完成。結果表明LTFPI使dPT明顯延長。
(9)抗FXa測定應用發(fā)色低物發(fā)測定，方法如下。
采正常人全血，109mM枸櫞酸鈉1∶9抗凝，4℃離心15min，4000r/min，等體積混合30份正常人新鮮血漿，56℃孵育15min，置37℃?zhèn)溆茫藶閰⒄昭獫{。每毫升此參照血漿中的TFPI定義為1個活性單位(1U)。
將野生型TFPI和LTFPI分別溶于TS(20mM Tris/HCl pH7.8+150mM NaCl)96孔板，每孔加100μL待測定溶液，再加100μL反應液(100ng/mL FXa+0.2％BSA)，室溫孵育30min，加發(fā)色底物Spectrozyme Xa至終濃度0.25mM，測OD405。結果表明LTFPI的抗Xa活性與野生型TFPI類似。表1是野生型TFPI和LTFPI抗Xa活性。
表1

實施例3 LTFPI半衰期測定dPT法測大鼠體內(nèi)TFPI半衰期大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40mg/kg)麻醉，股靜脈給藥(1mg/kg)，頸總動脈插管，給藥后不同時間分別取血，109mM枸櫞酸鈉1∶9抗凝，4℃離心15min，4000r/min，吸取上層血漿，測定dPT。
用生理鹽水將凝血活酶標準溶液稀釋500倍，此為凝血活酶工作液。取100μL血漿，加100μL凝血活酶工作液，37℃孵育1min，加10μL 250mmol/LCaCl2溶液，開始計時血漿凝固時間。取3次實驗平均值記為實驗結果。
以野生型TFPI為對照組，觀察LTFPI(K282A)和LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)的半衰期，結果可見LTFPI(K282A)和LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)的T1/2α分別比TFPI延長了5.1倍和14.5倍。半衰期計算使用上海宏能軟件有限公司PKS統(tǒng)計學軟件。表2是大鼠給藥前后dPT的變化。表3是二級擬合參數(shù)表——二室模型。
表2

表3.

其中，用藥對象中的1代表TFPI，2代表LTFPI(K282A)，3代表LTFPI(K269A，K282A，K288A和K289A)。
無需進一步詳細闡述，根據(jù)上述所公開的內(nèi)容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，上述的優(yōu)選具體實施方案應被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領域技術人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對本發(fā)明進行各種變更和改進。
SEQUENCE LISTINGOrganization ApplicantStreet醫(yī)學院路138號City上海State上海Country中國PostalCode200032PhoneNumber8621-54237045FaxNumber8621-64037324<110>復旦大學<120>長效重組組織因子途徑抑制物及其制備方法<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>304<212>PRT<213>human<400>1Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu20 25 30Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys35 40 45Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys50 55 60
Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu65 70 75 80Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser85 90 95Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile100 105 110Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu115 120 125Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn130 135 140Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly145 150 155 160Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu165 170 175Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn180 185 190Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu195 200 205Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly210 215 220Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn245 250 255Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Ala Gly Phe Ile260 265 270Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Ala Thr Lys Arg Lys Arg Ala275 280 285Ala Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met290 295 300
權利要求
1.一類重組組織因子途徑抑制物(TFPI)長效突變體，命名為長效組織因子途徑抑制物(LTFPI)，其特征在于TFPI羧基末端267-304區(qū)域內(nèi)的某些氨基酸突變后具有序列1的氨基酸序列，所述LTFPI的半衰期較TFPI延長10倍以上，具有抗組織因子、凝血因子VII/VIIa和凝血因子X/Xa功能。
2.基于權利要求1所述的LTFPI，羧基末端267-304區(qū)域內(nèi)的突變可以是替換或切除。
3.基于權利要求2，羧基末端267-304區(qū)域內(nèi)氨基酸的替換可以是任何氨基酸。
4.基于權利要求2，羧基末端267-304區(qū)域內(nèi)的切除可以是一個、多個或全部。
5.基于權利要求3，將269、282、288和289位賴氨酸替換為丙氨酸。
6.基于權利要求1的LTFPI的制備方法，通過下述步驟獲得(1)獲得編碼序列1的基因；(2)將突變后的基因與原核或真核表達載體重組；(3)將重組表達載體轉(zhuǎn)導原核或真核表達系統(tǒng)；(4)表達后的LTFPI經(jīng)分子篩和離子交換層析后，獲得純度大于95％的LTFPI；(5)原核系統(tǒng)表達純化后的LTFPI經(jīng)復性獲得活性。
7.基于權利要求6，原核表達載體可以是pET-28或pLY-4；真核表達載體可以是pPIC9K。
8.基于權利要求6，原核表達系統(tǒng)可以是BL21或JF1125；真核表達系統(tǒng)可以是GS115。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，具體涉及長效組織因子途徑抑制物(LTFPI)及其制備方法和應用。本發(fā)明對組織因子途徑抑制物(TFPI)及其受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)的生物信息學和結構分子生物學分析和實驗，確定了TFPI羧基末端與LRP結合并被清除的部位。設計了TFPI羧基末端突變體，通過PCR定點突變構建LTFPI基因后，與原核或真核表達載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或畢赤酵母，篩選高表達工程菌。原核工程菌經(jīng)發(fā)酵擴增，破碎細菌，離心收集包涵體，復性后經(jīng)分子篩和離子交換二步法純化LTFPI；真核工程菌直接將上清進行二步純化。獲得的LTFPI半衰期明顯延長，具有良好的抗凝功能。
文檔編號C12N15/12GK1528894SQ0315120
公開日2004年9月15日 申請日期2003年9月25日 優(yōu)先權日2003年9月25日
發(fā)明者馬端, 宋后燕, 白浩, 張農(nóng), 馬 端 申請人:復旦大學